Protocol
所有的动物用途被机构动物护理和使用委员会在波士顿儿童医院的批准。
1.样品制备
- 定时交配
- 在同一个笼子里放置一个C57BL6野生型男性和女性在一起。
- 检查第二天一早形成了交配塞。交配塞（ 又名 ，阴道或交配插头）是硬化胶质沉积，阻止阴道。
- 设置插件日期作为胚胎天0.5（E0.5）。
- 小鼠胚胎的隔离
- 通过CO 2窒息安乐死怀孕女性。
- 把小鼠仰卧上的吸收垫，并用70％乙醇喷雾腹部区域。
- 提起皮肤，并用在手术剪尾腹部开始5毫米的切口。剪切和去除腹部皮肤充分暴露内脏
- 附近的弗吉尼亚州切吉娜切除整个子宫。
- 沿角子宫着床点之间切割。每个段或孕应该有内部只有一个胚胎。
- 保持在1×冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）子宫段。
- 胚胎解剖
- 将每个孕在冰冷的PBS立视下一个单独的菜。
- 取出子宫组织，胎盘，然后胎膜依次用细镊子解剖。
- 转移解剖胚胎至50ml管中使用的大移液管1×冰冷的PBS。避免直接用钳子拿起胚胎，以尽量减少组织损伤。
- 固定术
- 固定在10％中性缓冲福尔马林溶液中的解剖胚胎在4℃下超过24小时，用固定剂中的至少10样品体积。
- 预处理
- 准备结算解决方案：48M尿素，10％甘油，4％十二烷基硫酸钠（SDS），在双蒸水。
- 更换清算解决方案的固定液。
- 2个星期 - 在室温下为1轻轻转动上的摇杆试样。交易所结算解决方案，一旦在第二和第三天。试样慢慢变得清澈透亮。
- 用10％福尔马林更换结算解决方案和摇杆离开2天。
- 脱水
- 用1×PBS洗涤预处理样品3次，每次5分钟。
- 脱水在室温下递增乙醇系列上的平缓摇杆样品。为E15.5胚胎中，使用递增的乙醇系列包括50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％和100％的乙醇，2小时的每个步骤。对年龄较大的胚胎，培养时间需要增加。
- 染色
- 准备染色液：补充0.1375克曙红Y二钠盐和0.0275克吖啶橙半（氯化锌）盐至50ml的100％乙醇的。搅拌2小时。用滤纸过滤。在室温下储存，并通过用铝箔覆盖避光。
- 传送标本的染色溶液1小时。
- 用新鲜的染色液和染色一夜之间更换。
- 浸润
- 准备渗透解决方案：结合百毫升JB-4包埋试剂盒的溶液A，1.25克催化剂的C，0.275克曙红Y钠盐和0.055克吖啶橙半（氯化锌）盐。搅拌混合（200rpm）下，在冰桶2小时，然后用滤纸进行过滤。
- 存放在4℃的渗透解决方案，并通过与铝箔覆盖避光。
- 胚胎转移到渗透液：染色溶液（1：1），并在4℃孵育至少3小时在摇杆。
- 胚胎转移到渗透解决方案，并培育3小时R ON在寒冷的房间摇杆。
- 每天更换一次渗透溶液，并在冷室中留下一个温和摇杆为三天。
2.嵌入
- 保持解决方案B和渗透液冰上。
- 立即嵌入之前，请嵌入（溶液B和渗透液1:25）。
- 东方在嵌入模具样品，然后轻轻地泼冷水解决方案嵌入到嵌入模具。重新定向，如果需要用的销。
- 使用PIN检查嵌入解决方案是否凝固。压出试样块，如果需要修剪。
- 使用单独的模具来获得的横方向重新定向试样块。
- 把块托架上嵌入模具的顶部。轻轻倾嵌入解到模具直到模具和块保持器被嵌入溶液淹没。
- 保持试样在次级容器并使其保持在冰上3 - 在通风橱4小时。
- 储存在4℃的固化试样。
- 剥去嵌入模具。放块中的体视显微镜下的斜光来检查在块中的样本的位置。在块面，标志网格线的样品周围。
- 修剪块删除使用标记网格线作为参考包埋材料的访问量。
3.图像采集
- 夹紧标本块切片机，并获取新的切割面。设置切片厚度（ 如 e9.5-10.5，1.5微米; e11.5-12.5，2.0微米; e13.5-15.5，2.5微米; E16.5-年纪大了，3微米）。保持试样/块在切片机的位置。
- 安装立体变倍显微镜水平面临着样本的块面。
- 打开计算机和显微镜，并启动图像采集软件。
- 可视化和聚焦光学器件的块面在成像软件的“实时取景”模式。
- 如果需要的话，这样的块面是在取景器中央对准显微镜和切片机。
- 调整变焦，以使整个块面是在取景器内。
- 选择绿色荧光蛋白（GFP）的过滤器（激发470±20纳米，分色495纳米，发射525±25纳米），如果需要的话重新聚焦。
- 测量和手动设置曝光时间 （ 例如 80 - 400迷你秒）。
- 获得块面的图像中的每个鲜切后，如果可能，会自动保存图像。
- 包括分辨率，截面厚度和变焦记录的重要参数。
- 完成整个标本，出口和在必要时所有的图像文件转换为JPEG格式之后。
- 倒置使用成像处理软件的所有原始图像，并调整亮度和对比度。
- 保存所有在一个单独的文件夹中处理图像。
4. 3D可视化
- 上传所有按照指示处理过的图像，三维可视化软件。
- 输入分辨率和截面厚度把所有图像容积数据（ 即，像素的大小），并保存3D文件。
- 对齐使用自动模式下，所有的图像。如有必要，手动调整个别图像。
- 对齐图像保存到一个新的文件名。
- 分析使用三维可视化软件试样的形态特征。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们曾报道E9.5和E13.5 8之间的小鼠胚胎的高品质图像HREM。后期阶段胚的图像质量，然而，显著因为荧光染料曙红的有限的组织穿透的损害。为了提高效率，染色，我们测试的是荧光成像兼容11多种预处理方法。具体来说，E15.5小鼠胚胎，用任何的Sca / E A2 12或全身CUBIC 13处理。我们也测试了简化公式，清算溶液（4M尿素，10％甘油，4％十二烷基硫酸钠）。所有的预处理方法提高染色效率。胚胎成为1周结算固溶处理后半透明。在处理后没有检测到明显的组织损伤。预处理的胚胎是embedde之前通过步骤，包括脱水，染色和加工的渗透d。在塑料嵌入媒体。如在第3（图像采集）上述并使用三维可视化软件中显示高分辨图像从嵌入的标本收购。 E15.5胚胎的整个安装面图的一个例子展示了皮肤的详细的形态学特征，包括晶须焊盘和显影毛囊（ 图1）。虚拟剖视图的分辨率是可比的组织切片（ 图2）。
图 1： 在E15.5胚胎的三维表面观这表明皮肤的具体形态特征。发展中的毛囊（小白点）是显而易见的，展示高清晰度的图像。 请点击这里查看大图已经这个数字rsion。
图 2： 在E15.5胚胎的中线部分的虚拟剖面视图的内部结构，包括心脏，肝脏，肠道和膀胱都清晰可见。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里，我们目前用常规的实验室设备收购是快速三维可视化和复杂结构的形态分析兼容串行高分辨图像的修改协议。由于高分辨率图像被从块面，而不是各个部分直接被使用，则细形态特征被保留，并迅速在3D可视化程序数字重建。
3D成像形象化和了解复杂的形态特征提供了显著的优势。大多数3D成像技术依赖于专门的设备1-4。与此相反，EFIC和高分辨成像只利用标准的实验室设备，包括装备有数码相机和切片机14立体显微镜。显微镜和切片机之间的功能耦合使图像采集的自动化功能，整个图像采集过程的自动化。然而，我们已经表明，功能耦合是不是强制性的8。相反，我们只是水平安装体视显微镜，使其直接面对在静止停止位置标准切片机的块面。这个简单的设置的主要限制是高分辨图像必须手动拍摄。我们估计，它需要平均每个图像约5秒。另一个限制是，各个图像可以从一个位置移动到另一个，但这不是一个问题，因为它们是三维重建期间容易重新排列。
使用高分辨技术，我们已经分析了一系列小鼠胚胎的3D图像从E9.5至E13.5的，并发现了由孤胚胎泄殖腔转变成两个独立的结构的新的机制，远侧消化道和下泌尿大片8。后期的高分辨图像质量上演的胚胎是有限的，由于伊红低效渗透（数据未显示）。为了提高组织penetrE15.5和E18.5胚胎的通货膨胀，我们使用两种不同的预处理方法是对荧光成像11兼容并测试新的配方，结算溶液（4M尿素，10％甘油，4％SDS）中。所有这些方法已显示的组织穿透和曙红染色的显著改善。预处理之前和之后的一个重要考虑因素是，试样是容易引起皮肤肿胀或收缩由于渗透压。为了限制渗透压的突然变化，从而减轻组织的变形，我们推荐的解决方案逐渐交换。此外，我们还发现，列入乙醇显著帮助（步骤1.5.4）。期间渗透和嵌入步骤，它从光保持样品并在4℃是重要的。
总的来说，这个协议采用常规的实验室设备获取高分辨图像，这是对于高分辨率三维可视化和形态分析相容。该协议守LD容易地适用于任何标准的实验室设置。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
