Protocol
تمت الموافقة على جميع الاستخدامات الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مستشفى الأطفال في بوسطن.
التحضير 1. عينة
- التزاوج توقيت
- وضع C57Bl6 النوع البري من الذكور والإناث معا في نفس القفص.
- تحقق لتشكيل المكونات التزاوج في وقت مبكر صباح اليوم التالي. المكونات التزاوج (ويعرف أيضا باسم، عن طريق المهبل أو المكونات الجماع) هو ترسب هلامي تصلب الذي يمنع المهبل.
- تحديد موعد المكونات كما الجنينية يوم 0.5 (e0.5).
- العزلة من أجنة الفئران
- الموت ببطء الإناث الحوامل من CO 2 الخنق.
- وضع الفئران مستلق على وسادة ماصة ورش منطقة البطن مع الايثانول 70٪.
- رفع الجلد وجعل شق 5 مم الأولي في منطقة البطن الذيلية باستخدام مقص جراحي. قطع وإزالة الجلد في منطقة البطن للكشف تماما عن الأعضاء الداخلية
- قطع بالقرب زارة شؤون المحاربين القدامىجينا لإزالة الرحم بأكمله.
- قطع بين المواقع زرع طول قرن الرحم. يجب أن يكون كل جزء أو الحمل المستكن جنين واحد فقط في الداخل.
- الحفاظ على شرائح الرحم في 1X الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- تشريح الجنين
- وضع كل الحمل المستكن في طبق منفصل مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني تحت المجسام.
- إزالة أنسجة الرحم، والمشيمة والأغشية الجنينية ثم بالتتابع باستخدام ملقط تشريح غرامة.
- نقل الأجنة تشريح لأنبوب 50 مل مع 1X الجليد الباردة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة نقل كبيرة. تجنب التقاط الجنين مباشرة مع ملقط للحد من تلف الأنسجة.
- تثبيت
- إصلاح الأجنة تشريح في 10٪ محايد حل الفورمالين مخزنة في 4 درجة مئوية لمدة أكثر من 24 ساعة مع لا يقل عن 10 مجلدات عينة من تثبيتي.
- المعالجة
- إعداد الحل المقاصة: 4M اليوريا، و 10٪ الجلسرين، و 4٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) في الماء المقطر المزدوج.
- استبدال تثبيتي مع الحل المقاصة.
- تناوب بلطف العينة على الكرسي الهزاز في درجة حرارة الغرفة ل1-2 أسابيع. تبادل الحل المقاصة مرة واحدة في الثاني واليوم الثالث. العينة يصبح ببطء واضح وشفاف.
- استبدال الحل المقاصة مع 10٪ من الفورمالين وترك على الكرسي الهزاز لمدة 2 أيام.
- جفاف
- غسل العينات سابقة التجهيز مع برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- يذوى العينات في سلسلة الإيثانول تصاعدي في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز لطيف. للأجنة E15.5، استخدام سلسلة تصاعدي الإيثانول بما في ذلك 50٪، 60٪، 70٪، 80٪، 85٪، 90٪، 95٪، والإيثانول بنسبة 100٪، 2 ساعة كل خطوة. لأجنة كبار السن، ويحتاج فترة حضانة إلى زيادة.
- تلطيخ
- إعداد تلطيخ الحل: إضافة 0.1375 غراما من يوزين Y الصوديوم والملح و0.0275 غراما من الأكريدين أورانج نصفي (كلوريد الزنك) ملح إلى 50 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. تحرك المكونات لمدة 2 ساعة. تصفية مع ورقة الترشيح. تخزين في درجة حرارة الغرفة، وتجنب ضوء من خلال تغطية بورق الألمنيوم.
- نقل العينة إلى الحل تلطيخ لمدة 1 ساعة.
- استبدال الحل تلطيخ الطازجة وصمة عار بين عشية وضحاها.
- تسلل
- إعداد تسلل الحل: الجمع بين 100 مل من محلول ألف من JB-4 طقم التضمين، 1.25 غرام من محفز C، 0.275 غرام من يوزين Y الصوديوم والملح و0.055 غرام من البرتقال الأكريدين نصفي (كلوريد الزنك) الملح. يحرك المزيج حتى خلط (200 دورة في الدقيقة) في دلو الثلج لمدة 2 ساعة، ثم تصفية مع ورقة الترشيح.
- تخزين الحل التسلل عند 4 درجات مئوية، وتجنب ضوء من خلال تغطية بورق الألمنيوم.
- نقل الأجنة إلى تسلل الحل: الحل تلطيخ (1: 1)، واحتضان لمدة لا تقل عن 3 ساعة على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية.
- نقل الأجنة إلى تسلل الحل واحتضان لمدة 3 ساعاتص على الكرسي الهزاز في غرفة باردة.
- استبدال تسلل الحل مرة واحدة كل يوم، وترك في غرفة باردة على الكرسي الهزاز لطيف لمدة ثلاثة أيام أخرى.
2. تضمين
- إبقاء الحل B وتسلل الحل على الجليد.
- جعل تضمين الحل (1:25 من الحل B وتسلل الحل) على الفور قبل التضمين.
- الشرق العينة في قالب التضمين، ثم صب البارد الحل تضمينها في القالب تضمين بلطف. إعادة توجيه مع دبوس إذا لزم الأمر.
- استخدام دبوس لدراسة ما إذا كانت توطد الحل التضمين. طرد كتلة العينة، وتقليم إذا لزم الأمر.
- إعادة توجيه كتلة العينة باستخدام قالب منفصل للحصول على التوجه عبر.
- وضع حامل كتلة في أعلى القالب التضمين. صب بلطف تضمين الحل في القالب حتى يتم المغمورة العفن وحامل كتلة من تضمين الحل.
- الحفاظ على العينة في وعاء الثانوية وترك الأمرعلى الجليد لمدة 3-4 ساعة في غطاء الدخان.
- تخزين العينات عزز في 4 درجات مئوية.
- قشر بعيدا قالب التضمين. وضع كتلة تحت مجهر تشريحي مع إضاءة مائلة لتفقد وضع العينة في الكتلة. على وجهه كتلة، خطوط الشبكة كافة أنحاء العينة.
- تقليم كتلة لإزالة كمية صول تضمين المواد باستخدام خطوط الشبكة ضعت المراجع.
3. الحصول على الصور
- المشبك كتلة العينة إلى مشراح والحصول على قطع السطحية العذبة. تعيين سمك الباب (على سبيل المثال، e9.5-10.5، 1.5 ميكرون، e11.5-12.5، 2.0 ميكرون، e13.5-15.5، 2.5 ميكرون، e16.5-كبار السن، 3 ميكرون). الحفاظ على عينة / كتلة في موقف البيت من مشراح.
- جبل المجهر ستيريو التكبير التي تواجه أفقيا على سطح كتلة من العينة.
- قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر، والبدء في البرنامج الحصول على الصور.
- تصور والتركيز البصريات إلى كتلة وجهتحت عنوان "عرض لايف" واسطة من برامج التصوير.
- محاذاة المجهر ومشراح إذا لزم الأمر بحيث كتلة الوجه في مركز عدسة الكاميرا.
- ضبط التكبير بحيث كامل كتلة الوجه داخل عدسة الكاميرا.
- اختر الأخضر بروتين فلوري (GFP) فلتر (الإثارة 470 ± 20 نانومتر، مزدوج اللون 495 نانومتر، وانبعاث 525 ± 25 نانومتر) وتركيز إذا لزم الأمر.
- قياس وضبط الوقت التعرض يدويا (على سبيل المثال، 80-400 مصغرة ثانية).
- الحصول على صور من كتلة وجه بعد كل قطع الطازجة وحفظ الصور تلقائيا إذا أمكن ذلك.
- المعالم الهامة سجل بما في ذلك القرار، سمك الباب والتكبير.
- بعد الانتهاء من العينة كلها والتصدير وتحويل جميع ملفات الصور إلى صيغة JPEG إذا لزم الأمر.
- عكس كل الصور الأصلية باستخدام برامج معالجة التصوير، وضبط السطوع والتباين.
- حفظ جميع الصور المجهزة في مجلد منفصل.
4. 3Dتصور
- تحميل جميع الصور المجهزة لبرنامج التصور 3D اتباع التعليمات.
- قرار المدخلات وسمك الباب لتحويل جميع الصور لبيانات حجمية (أي حجم فوكسل) وحفظ الملف 3D.
- محاذاة كل الصور باستخدام طريقة تلقائية. ضبط الصور الفردية يدويا إذا لزم الأمر.
- حفظ الصورة الانحياز إلى اسم ملف جديد.
- تحليل الخصائص المورفولوجية للعينة باستخدام برنامج 3D التصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد ذكرت الصور HREM جودة عالية من أجنة الفئران بين E9.5 وE13.5 8. جودة الصورة من الأجنة نظموا في وقت متأخر، ومع ذلك، هو خطر كبير بسبب اختراق الأنسجة محدود من يوزين صبغة الفلورسنت. لزيادة كفاءة تلطيخ، اختبرناها عدة طرق المعالجة التي تتوافق التصوير الفلورسنت 11. على وجه التحديد، تم علاج أجنة الفئران E15.5 مع أي هيئة السلع التموينية / ه A2 12 أو كامل الجسم CUBIC 13. لقد اختبرنا أيضا صيغة مبسطة، والمقاصة الحل (4 M اليوريا، الجلسرين 10٪ و 4٪ من الصوديوم دوديسيل كبريتات). جميع طرق المعالجة زادت كفاءة تلطيخ. الأجنة أصبحت شفافة بعد 1 أسبوع من العلاج مع الحل المقاصة. تم الكشف عن أي تلف الأنسجة واضحا بعد العلاج. تم معالجة الأجنة سابقة التجهيز من خلال الخطوات بما في ذلك الجفاف، وتلطيخ والتسلل قبل أن embeddeد في وسائل الإعلام التضمين البلاستيك. تم الحصول على صور HREM من العينة جزءا لا يتجزأ كما هو موضح أعلاه في القسم 3 (الحصول على الصور) وعرضها باستخدام برنامج 3D التصور. مثال على عرض سطح جبل كامل من جنين E15.5 أظهر معالم شكلية مفصلة من الجلد بما في ذلك منصات شعيرات وتطوير بصيلات الشعر (الشكل 1). وكان القرار من وجهة نظر قسم الظاهري مماثلة لقسم النسيجي (الشكل 2).
الشكل 1: 3D سطح عرض من جنين E15.5 ويبين معالم شكلية مفصلة من الجلد. بصيلات الشعر النامي (بقع بيضاء صغيرة) واضحة، مما يدل على دقة عالية للصورة. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر هاءrsion من هذا الرقم.
الشكل 2: قسم مشاهدة الظاهري قسم خط الوسط من جنين E15.5 الهياكل الداخلية، بما في ذلك القلب والكبد والأمعاء والمثانة واضحة للعيان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نقدم بروتوكول تعديلها باستخدام المعدات المخبرية الروتينية للحصول على الصور HREM التسلسلية التي تتلاءم مع التصور 3D السريع وتحليل المورفومترية من الهياكل المعقدة. لأنه يتم أخذ صور عالية الدقة مباشرة من على وجه كتلة بدلا من المقاطع الفردية، والحفاظ على الميزات الشكلية الجميلة وأعيد بناؤها بسرعة رقميا في برنامج التصور 3D.
عروض 3D التصوير مزايا كبيرة في تصور وفهم الخصائص المورفولوجية المعقدة. تعتمد معظم تقنيات التصوير 3D على المعدات المتخصصة 1-4. في المقابل، المالية و الصناعية المصرية والتصوير HREM تستخدم فقط المعدات المختبرية القياسية بما في ذلك مجهر تشريحي مزودة بكاميرا رقمية و14 مشراح. اقتران الوظيفي بين المجهر ومشراح يمكن أتمتة التقاط صور يمكن أتمتة عملية الاستحواذ الصورة بأكملها. ومع ذلك، لقد أظهرنا أناقتران ظيفي ليس إلزاميا 8. بدلا من ذلك، ونحن ببساطة تركيب مجهر تشريحي أفقيا بحيث تواجه مباشرة على وجهه كتلة من مشراح القياسي في موقف وقف يستريح. الحد الرئيسي لهذا الإعداد بسيط هو أن الصور HREM يجب أن تؤخذ يدويا. قدرنا أن يستغرق حوالي 5 ثانية لكل صورة في المتوسط. الحد الآخر هو أن صورة فردية يمكن أن تنتقل من موقع إلى آخر، ولكن هذه ليست مشكلة لأنهم إعادة ترتيب بسهولة خلال إعادة الإعمار 3D.
باستخدام تكنولوجيا HREM، قمنا بتحليل سلسلة من الصور 3D من أجنة الفئران من E9.5 لE13.5، وكشفت عن آلية جديدة التي مجرور الجنينية الانفرادي يتحول مبنيين منفصلين، الجهاز الهضمي القاصي وانخفاض البولية مساحات 8. جودة الصور HREM في الآونة الأخيرة نظموا الأجنة محدودة بسبب اختراق غير الكفء لليوزين (لا تظهر البيانات). لزيادة penetr الأنسجةأوجه من E15.5 وE18.5 الأجنة، وقد استخدمنا طريقتين المعالجة المختلفة التي تتوافق التصوير الفلورسنت 11 واختبار صيغة جديدة، والمقاصة الحل (4 M اليوريا، و 10٪ الجلسرين و 4٪ SDS). وقد أظهرت كل من هذه الأساليب تحسنا كبيرا من اختراق الأنسجة وتلطيخ يوزين. أحد الاعتبارات الهامة قبل وبعد المعالجة هو أن عينة معرضة للجلد تورم أو تقلص بسبب الضغط الاسموزي. للحد من هذا التغيير المفاجئ في الضغط الاسموزي بالتالي الحد من تشوه النسيج، ونحن نوصي الصرف التدريجي من الحل. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن إدراج الإيثانول يساعد بشكل كبير (الخطوة 1.5.4). خلال تسلل والخطوات التضمين، فمن المهم للحفاظ على عينة من الضوء وفي 4 ج.
بشكل جماعي، ويستخدم هذا البروتوكول المعدات المخبرية الروتينية للحصول على الصور HREM، والذي يتوافق عالية الدقة 3D التصور والتحليل المورفولوجية. الشوق للبروتوكولLD أن تتكيف بسهولة في أي مكان المختبر القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
