Abstract
Nesledyrene, og spesielt Hydra, var de første dyrene vist seg å regenerere skadede eller avkuttede strukturer, og faktisk slike studier uten tvil lansert moderne biologisk henvendelse gjennom arbeidet Trembley mer enn 250 år siden. For tiden er studiet av regenerering har sett en fornyet bruk av både "klassiske" regenerative organismer, slik som Hydra, planaria og Urodeles, samt en utvidelse spektrum av arter som spenner over området metazoer, fra svamper gjennom pattedyr. Foruten sin iboende interesse som et biologisk fenomen, vil forstå hvordan regenerering fungerer på en rekke arter informere oss om hvorvidt regenerative prosesser dele fellestrekk og / eller arter eller kontekstspesifikke cellulære og molekylære mekanismer. Den starlet sjøanemone, Nematostella vectensis, er en ny modellorganisme for regenerering. Som Hydra, er Nematostella et medlem av den gamle phylum, Cnidaria, men innenfor tHan klasse Anthozoa, en søster clade til småmaneter som er evolusjonært mer basal. Dermed aspekter av regenerering i Nematostella vil være interessant å sammenligne og kontrast med de av Hydra og andre nesledyr. I denne artikkelen presenterer vi en metode for å halvere, observere og klassifisere regenerering av aboral slutten av Nematostella voksen, som kalles physa. Den physa gjennomgår naturlig fisjon som et middel for aseksuell reproduksjon, og enten naturlig fisjon eller manuell amputasjon av physa utløser ny vekst og reformasjon av komplekse morfologi. Her har vi kodifisert disse enkle morfologiske endringer i en Nematostella Regeneration Staging System (den NRSS). Vi bruker NRSS for å teste effekten av klorokin, en inhibitor av lysosomal funksjon som blokkerer autophagy. Resultatene viser at regenereringen av polyp strukturer, spesielt mesenteries, er unormal når autofagi er sperret.
Introduction
Observasjonen av regenerering i en enkelt hydra var banebrytende hendelse i advent av biologi som en eksperimentell vitenskap 1,2. Regeneration er fortsatt et fenomen av usedvanlig bred appell til biolog og lå person likt. Potensialet for utviklings biologer, leger, biomedisinske forskere og ingeniører vev til å forstå og overvinne grensene for menneskelig regenerering gjør regenerering biologi mer enn egentlig interessant.
Nå, med bruk av nye teknologier som genomsekvensering og gevinst og tap av funksjon verktøy, er feltet klar til å erte hverandre regenerative mekanismer og til slutt forstå hvordan ulike arter kan regenerere mens andre ikke kan. Graden av felles i molekylære, cellulære og morfologiske responser er ikke avklart, men så langt ser det ut som de grunnleggende reaksjoner blant dyr som kan regenerere er mer lik enn det som ville ha vært Imagined bare et tiår siden 3.
Nesledyrene er spesielt lettvinte ved gjenoppfriske nesten alle sine kroppsdeler midt i et bredt spekter av morfologisk mangfold. Fra den ensomme ferskvann polypp, Hydra sammen med de små marine polypper som bygger enorme korallrev, til de komplekse koloni siphonophora, slik som den portugisiske Man-O-War, er regenerering ofte en modus for reproduksjon, i tillegg til en mekanisme for reparere eller reformere skadet eller mistet kroppsdeler som følge av skade og predasjon. Hvorvidt de ulike arter av Cnidaria bruke lignende eller ulike mekanismer for regenerering er et fundamentalt interessant spørsmål 4-6.
Vi, og andre har vært å utvikle anthozoan, Nematostella vectensis som en modell for regenerering 7-17. Vi har nylig utviklet en iscenesettelse system for å beskrive regenerering av en hele kroppen fra et morfologisk uniform stykke vev halvert fra Aboral enden av polypp 10. Mens Nematostella polypper kan regenerere da delt i to ved en hvilken som helst nivå, valgte vi å skjære voksne i en aboral posisjon i den mest morfologisk enkel region, den physa, dels fordi dette er nær det normale planet for naturlig aseksuell fisjons 18, og også fordi det tillatelser observasjon og molekylære analyser av hvordan en hele kroppen er satt sammen fra de enkleste morfologiske komponenter.
Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) gir et relativt enkelt sett med morfologiske benchmarks som kan brukes til å sette fremdriften av noen aspekter av regenerering av en amputert physa, under normale kultur forhold eller eksperimentelt opprørt situasjoner som små molekyl behandlinger, genetisk manipulering eller miljømessige endringer. Som forventet, er NRSS blir vedtatt som en morfologisk stillaset som de cellulære og molekylære hendelser av regenerering kan refereres10.
Endelig vår metode for skjæring produserer et gapende hull flere størrelsesordener større enn fint punktering brukt i en fersk undersøkelse 17, men begge sår leges i rundt 6 timer. Dokumentere visuelt fremtredende og distinkte faser av sårlukking skal foreslå eksperimentelle tilnærminger for å forklare den tilsynelatende uavhengig av størrelsen av et sår, og den tid det tar å lukke. Dermed vil en dypere visuell forståelse av aboral amputasjon prosessen, levert av denne protokollen, vil hjelpe videre undersøkelser i denne modellen regenerering system og utvide anvendelsen av denne iscenesettelsen systemet med Nematostella vectensis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Conditioning of Animals for temperatur, ernæring og lys / mørke-syklus
- Skaff Nematostella vectensis voksne fra en av de mange Nematostella laboratorier over hele verden, eller en non-profit leverandør (tabell 1)
- Oppretthold Nematostella ved konstant temperatur (typisk mellom 18 og 21 ° C) i mørket, i "1 / 3x" kunstig sjøvann (ASW) ved et saltinnhold på 12 deler pr tusen (ppt). Oppretthold kulturer i enkle soda-lime glass kultur retter, vanligvis 250 ml eller 1,5 L kapasitet 11.
Merk: Disse enkle dyrkingsbetingelsene blir ofte brukt blant laboratorier som studerer Nematostella, men kultur omsorg kan også automatiseres 19. - Mate Nematostella nylig klekket artemia nauplier 2 - 4x per uke. Hatch Artemia cyster i full styrke (36 ppt) eller 1 / 3x ASW ved 30 ° C, i et grunt rektangulær glassfat 20 eller inoen av en rekke små, kommersielle eller hjemmelagde saltlake reker klekkerier. Dersom en inkubator ikke er tilgjengelig, vil reker klekkes ved RT men gjør det mer langsomt.
Merk: Dette krever ofte mer enn 24 timer for ferdigstillelse. - Bytt anemone kultur vann minst en gang i uken. For best helse i voksen alder, grundig rengjort (uten såpe) kulturen boller en gang i uken av akkumulert slimete sekret, som pels bollen og kan felle uspist mat og avfall, og komplisere dyrene.
2. Utvalg og Avslapning av Ernæringsmessig Betinget Dyr
- Velg størrelse matchet polypper av omtrent samme lengde (3 - 5 cm, da naturlig avslappet) og legg dem i en bolle skilt fra kolonien i tre dager før amputasjon.
Merk: Antall dyr som er valgt for skjæring vil bli bestemt av eksperimentet blir gjennomført, selvfølgelig, men generelt anbefaler vi minst fem dyr per prøve poeng med seks kjøringer. Dermed,i et typisk forsøk i minst 30 dyr ville bli forhåndsvalgt. Generelt er det lurt å velge mer enn minimum antall (30) siden amputasjoner som er uregelmessig (se nedenfor) kan senere påvirke scoring. - Ta fatet av utvalgte dyr fra inkubatoren inn på rommet lys i minst en time før amputasjon.
Merk: Eksponering for lys og vibrasjoner håndtering vil trolig føre til at dyrene til kontrakt, så de må være tilpasset eller "avslappet" ved inkubasjon på lab benken. Dyr blir ildfast å berøre og lyseksponering og på det punktet kan flyttes ved forsiktig pipettering. - Valgfritt: Anesthetize dyrene ved å legge 7,5% MgCl2 (i 1 / 3x ASW). Tilsett den MgCl2-løsning til bollen med en standard plast 5 ml pipette.
Merk: Selv om dyrene vil etter hvert bli tilvent til lyset og til fysisk manipulasjon, kan det være fordelaktig å bedøve dyrene til å opprettholde eller "fikse" than avslappet tilstand etter at de har blitt forlenget 16,21,22. - Bruk en bred boring (> 0,5 cm) plast pipette til å overføre (i 1 / 3x ASW) fem dyr fra bassenget for å bli amputert, i bunnen av en steril glass cutting fat med diameter 100 mm med 12 ppt ASW. Sett fatet på scenen av en stereomikroskop med variabel forstørrelse mellom 10 - 40X.
Merk: Hvis dyrene ikke har blitt bedøvet og avslappet for å kutte, kan de likevel reagere på berøring og stereoskop belysning, og dermed kan trenge et par minutter å bli avslappet igjen.
3. Amputasjon
- Ved hjelp av en steril skalpell, amputere aboral physa fra hver polypp, med det mål å oppnå en del av physa som er omtrent så lang som den er bred, og som ikke inneholder noe mesenterium.
Merk: Den ideelle cut området er bare aboral til oppsigelse av mesenteriet. Ved planet for å kutte det er en overgang fra mesenteriet riktig å tynn lines tilsvarer hvert mesenterial innsetting (se figur 1, piler). Fravær av mesentery er kritisk fordi den produserer slim som kan fremme "plugging" hullet 17,30.- Plasser skalpellblad i kontakt med dyret på det ønskede sted av amputasjon. Gjør dette enten ved egen hjelp (frihånd), eller ved å forsiktig ta tak i dyrets kropp med en # 5 tang (Dumont stil eller lignende).
- Skjær gjennom vevet ved å utnytte den buede blad av skalpell i en gynge 'bevegelse over hele kroppen.
Merk: Vevet bør kutte ren som skalpell er rystet og frigjøre den ønskede delen av physa fra donor. Imidlertid, hvis et lite stykke vev fremdeles forbinder kroppen og physa, skjære det med skalpellen. Ikke forsøk å skille de tilkoblede stykker ved å trekke, da dette kan skade physa.
- Fjern hvert amputert "donor" polypp fra fatet og returnere den til en SEPAsats bolle merket 'samlede amputerte'; Hittil bollen og returnere den til lager kultur.
Merk: amputert polypper vil helbrede aboral såret i løpet av en dag, og deretter kan mates normalt. De vil regenerere en normal ser physa innen to uker på hvilket tidspunkt den physa kan amputerte igjen om ønskelig. - Skyll det utskårede physa at forbli i skjære fatet i 12 ppt ASW, og deretter overføre hver physa til en separat steril brønn i en multi-brønn cellekulturplate som allerede inneholder 10 ml av 12 ppt ASW i hver brønn.
Merk: Dette eksemplet bruker en seks brønn plate, med hver brønn holder 10 ml sjøvann og fem utskåret physa. Generelt sjøvann bør dekke physa tilstrekkelig til å unngå kontakt med luft på grunn av bevegelse i håndtering og potensiell fordampning. Platen eller brønnene bør ha et lokk. - Gjenta trinn 03.01 til 03.03 for å samle inn minst fem physa i hver brønn reservert for hver eksperimentell behandling.
- Inkuber physa ved en temperatur som vil provIde den beste prisen for regenerering for de planlagte eksperimentelle avhørene. Sett platen inneholdende physa i en temperaturregulert inkubator, ved en konstant temperatur bestemmes av den ønskede hastighet på regenerering.
Merk: physa vil regenerere manglende vev og danner et komplett polypp når inkuberes ved temperaturer mellom 15 og 27 ° C. Frekvensen av regenereringen er temperaturavhengig, med unntak av de to første trinn. Den gjennomsnittlig dag for å nå Stage 4 for alle temperaturer er 7 dager etter skjæring og dette sammenfaller også med regenerering ved 21 ° C. Ved 27 ° C, Trinn 4 oppnås ca. 3 dager tidligere, og ved 15 ° C, Trinn 4 forsinket med omtrent 3 dager sammenlignet med regenerering ved 21 ° C (se også Reference 10).
4. Vurdere Regeneration med Nematostella Regeneration Staging System (NRSS)
- Resultat av physa bruker et stereo-sammensatt mikroskop med variabel magnificasjon (10 - 80X). Resultat av nyklipt Nematostella physa som Stage 0 og fortsette å score på samme tid hver dag etter amputasjon (DPA) ved hjelp av NRSS 10.
Merk: For viktige raste kriterier og detaljer, se Referanse 10.- Resultat physa som Stage 0 (Open Wound) hvis en nyklipt physa vises som en cup formet masse som ligner en slapp ballong, med et åpent sår nettstedet er sannsynlig synlig.
Merk: sårkantene kan også holde sammen fra begynnelsen, men vevet vil fortsatt bli kollapset og mangler stivhet. Kantene av det åpne såret kan observeres gjennomgå radial sammentrekning som såret leges. - Resultat physa som Stage 1 (såret lukket) dersom amputasjonen såret vises stengt.
Merk: Sår plasseringen vil tilsvare fremtiden oral pol. Den ytre overflate omkring den fremtidige oral pol kan begynne å vise forskjellige buene svarende til de underliggende radielt symmetrisk endodermal mesenterial innsettinger. - Score phYSA som trinn 2 (Radial-Buer) hvis overflaten av den orale pol vises oppblåst, og viser åtte hevet buer som er anordnet i et radialt symmetrisk mønster og adskilt ved hjelp av spor. Observere små, halvkuleformede blemmer på toppen av buene. De vil være omtrent like høy som bred, sannsynligvis forbigående, og i utgangspunktet består av en enkelt ectodermal celle laget.
Merk: I noen tilfeller dobbelt lag blebs kan stabilisere seg. Merk: På dette eller senere stadier kan en slimete laget ser ut til å kapsle physa (figur 2) i en membran "kappe". Dette innkapslingsmateriale bør fjernes for å lette scoring. - Score physa som trinn 3 (Tentacle) hvis knopper av tentakler som inneholder endodermal og ectodermal vev lag er stabilt utformet ved den orale enden av minst noen radiale buer.
Merk: tentakler er lengre enn de er brede og er minimalt bevegelige. Den physa vil vise økt, men variabel inflasjon slik at mesentery rudimenter kan bli visible strekker seg fra mesenterial innføring i kroppshulrommet (coelenteron). - Resultat physa som Stage 4 (Linear Mesenteries) hvis physa inneholder åtte forskjellige, synlige mesenteries som strekker seg inn i coelenteron fra innsett i kroppen veggen, med oral-aboral lengder som er mer enn dobbelt så radial bredde målt fra der de ser ut til å koble til svelget på sitt aboral enden (enterostome).
Merk: Fire eller færre mesenteries har "plissert" interne frie kanter. Svelget er synlig. Mer enn åtte tentakler er synlige, motile og noen ganger er de trekke seg sammen inn i kroppen. - Resultat physa som Stage 5 (Hovedsakelig Pleated Mesenteries) hvis physa har mer enn fire mesenteries med pleating, og plissering er mer full og slyngete enn på Stage 4. Dyret har en nesten "normal" voksen utseende, men det er ingen synlige gonadale celler.
- Resultat physa som Stage 0 (Open Wound) hvis en nyklipt physa vises som en cup formet masse som ligner en slapp ballong, med et åpent sår nettstedet er sannsynlig synlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Progresjonen av morfologiske hendelser under regenerering i avkuttede physa er vist i figur 1A, som inkluderer representative visninger av physa på hvert NRSS trinn. Den typiske physa kutt nettstedet er angitt på den voksne (pilspisser). Fotografiene i figur 1A viser progressive regenerering av muntlige og kroppsstrukturer fra nyklipt physa gjennom fullt dannet polypp. Figur 1B, C viser arrangementet av interne septa, de mesenteries, på Stage 4 og Stage 5, henholdsvis. Merk at noen mesenteries på Stage 4 vil mangle "pleating", men for å kvalifisere som en Stage 5 flertallet må ha utviklet folder. Figur 1D viser et physa innhyllet i en membran av slimete som kan fjernes med tang (figur 1E). Mens vanligvis ikke er skadelig for regenerering (hvis det urimelig fanger dyret), kan membranen hindre utføre den physa og gjøreing eksperimentelle manipulasjoner, som mikroskopi, prøve fiksering eller høsting for molekylær / biokjemisk analyse. Dette er best fjernes etter trinn 1, eller senere hvis det reformer.
Figur 2 viser hvordan oppsetningen systemet kan brukes til å plassere ballen resultatene av et forsøk for å vurdere effekten av å inhibere autophagy. Physa ble kuttet og behandlet med klorokin ved 10, 50 og 100 uM, eller physa var ubehandlet (kontroller). Klorokin hemmer lysosomale funksjoner som er nødvendige for autofagi. De NRSS kriterier ble brukt til å sette inn physa i løpet av regenereringen, og resultatene ble plottet i figur 2E. Fotografier av representative kontroll (figur 2A) og klorokin behandlet physa (figur 2 B - D) ble gjort når kontrollene nådd stadiet 5. klorokin behandlede dyr ikke videre utover stadium 4, og de vanligvis utstilt ufullstendig mesentery regenerasjon (de fleste manglet plissering), kort tentakkel størrelse, og i noen tilfeller kort kroppslengde.
Figur 1. Funksjoner av Regeneration. (A) Eksempler på physa regenererende muntlige og kroppsstruktur iscenesatt i henhold til NRSS. Panel merket Adult viser funksjonene til et modent dyr med tentakler (t) svelget (ph), mesenteries (m) og mesentery innsett (mi). Hvite piler viser hvor plisserte regionen mesenteries overgang til mesentery innsetting, et høydedrag av endoderm som strekker seg til aboral endestasjonen. Denne regionen utgjør physa. Gule piler viser ideelle physa halverings nettstedet. Panel 0 viser fem physa minutter etter Halverings, og Panel 0 'er et forstørret bilde av en en av dem physa, med åpent sår i sentrum, definere Stage 0 avNRSS. Panel 1 viser en physa med såret nå stengt, definere Fase 1. Panel 2 viser physa med hevet radial buer rundt munn pol, med oppblåste vev under, som tilsvarer trinn 2 (paneler 0-2 er utsikt over den muntlige slutten). Panel 3 viser tentakkel knopper vekst ved oral pole (mot høyre) av den langstrakte og blåse physa, nå på scenen 3. Note rudimentær mesentery elementene er synlige og svelget danner i det mørke området på den muntlige slutten. Panel 4 viser fremveksten av sanne tentakler, samt forbigående "blebs" ved oral pol, som avgrenser Trinn 4. Lineære mesenteries er synlige i den oppblåste physa. Den store runde masse synlig inne polypp er av ukjent opprinnelse og vil bli kastet ut gjennom munnen. Panel 5 viser nesten komplett regenerasjon preget av mer enn fire plisserte mesenteries, et fullt dannet pharynx og åtte eller flere tentakler, som definerer det som Stage 5. (B, C) Aboral utsikt over enkelte physa illustrere biradial arrangement og morfologi mesenteries. I denne visningen, plisserte mesenteries synes å ha en bule av vev midtveis (grønn pilspiss). En Stage 4 physa har fire eller færre plisserte mesenteries, og en scene 5 physa har mer enn fire (C). Mesenteries med eller uten plissering er angitt med grønn eller gul pilspisser, henholdsvis. Svart pilspiss i (C) peker på en plissert mesentery som har utvidet radialt. (D, E) Fjerning av en slimete slire fra physa er avbildet. De hvite piler indikerer en slimete skjede rundt physa (D) som skal fjernes som i (E) før scoring regenerering. Noen ganger gjenværende vev (gule piler) kan bli fanget inne i hylsteret, og dette også må fjernes. Stjerne indikerer muntlige polene, hvor marked. Røde størrelse barer er 0,5 mm i alle paneler bortsett fra A5 (1,0 mm). Paneler B og C i denne figur har blitt endret og gjengitt med tillatelse fra Reference 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Effekter av Chloroquine på Regeneration. For å demonstrere en anvendelse av NRSS, testet vi effektene av en klorokin, en inhibitor for autophagy. Physa ble amputert og umiddelbart plassert i en / 3x ASW inneholdende 0,1% DMSO (kontroll) eller klorokin ved 10, 50, 100 uM. Physa ble scoret på 24 timers mellomrom ved hjelp av NRSS. (A) Representative endepunkt bilder tatt av kontroller når de nådde stadium 5.
Figur 3. Oppsummering avviktige funksjoner på NRSS etapper. Dette diagrammet viser de viktigste morfologiske endringer som definerer hvert trinn i NRSS. Retning av bevegelser er angitt med røde piler og funksjoner av grønne pilspisser. Stage 0 skildrer åpent sår rett etter klipping (A), og t). Sårkantene gjennomgå nedleggelse radial sammentrekning mot midten (B). Trinn 1 er karakterisert ved fullstendig lukking av såret (C) og heving av buene mellom orale vendte rygger (D); midten av den orale overflate (pilspiss) er trykket inn. Stage 2 har en uttalt overordnede i oral overflaten (pilspiss, E); den physa begynner å forlenge og bli smal (F) med tentakkel knopper og blebs synlige på toppen av buene (pilspisser). Stage 3 har stabile tentakkel knopper (pilspiss, G) og regenererende svelget kan bli sett på som en tetthet på oral pole (oransje massen, pilspiss i H (I) som bør være minst dobbelt så lenge som de er høye ved veikryss i strupen (I '). Fire eller færre mesenteries kan plissert på deres indre kant - det mesenterial filament (J, J '). Stage 5 er preget av mer enn fire plisserte mesenteries (K), som kan best vurderes ved å se fra aboral (K). Re-print med tillatelse fra Reference 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av Nematostella som en modell for sårheling og regenerering blir stadig mer populært. Derfor er det viktig å være i stand til å visualisere de morfologiske mønstre av en bestemt protokoll før effektive cellulære og molekylære analyser kan tildeles og sammenlignes. Nematostella har en høy grad av regenerativ "fleksibilitet", være i stand til å reformere nesten alle mangler struktur amputert på ethvert sted, på post-Planula stadier av livet. Dermed har ulike forskere undersøkt regenerering som følge av amputasjon eller såre i ulike regioner av polypper, på ulike alderstrinn og størrelser 7-18.
Iscenesettelsen systemet beskrevet her følger transformasjon av et morfologisk uniform delen av physa, amputert fra aboral slutten av en voksen, til en anatomisk fullstendig juvenil polypp mangler bare reproduktive vev (vi har ennå ikke bestemt når disse regenererte yngel blir seksuelt mperaturen). Denne tilnærmingen tar for regenerering av en enkel rudiment av vev til en av nær maksimal kompleksitet. Inkludert fem physa som et minimum gruppestørrelse anbefales å normalisere for potensielle individuell variasjon og overlevelses. Selvfølgelig kan dette antallet tilpasses de spesielle eksperimentelle mål, men NRSS protokollen tillater 2 ml medium per physa å oppheve en potensiell 'volumeffekt "som det som har blitt rapportert å påvirke regenerering i hydra 23.
Andre måter å studere Nematostella regenerering har brukt voksne todelte midten av kroppen eller ved oral slutten, eller juvenile 4-tentakkel trinns polypper delt i midten av kroppen 7,11-18. To studier har undersøkt regenerering i physa frigjort av naturlig fisjon 16,18, og tilnærminger ved hjelp amputert physa har nylig dukket opp med NRSS 8,9. Hver av disse ulike tilnærmingene har sine egne fordeler og kan ta unike spørsmål om regenerative prosesser som skjer under forskjellige amputasjon eller såret regimer, og blant annerledes alderen dyr. Den NRSS protokoll for physa amputasjon og score, vist i denne studien, genererer et relativt ensartet sett physa for systematisk studie og unngår variasjon i physa størrelse, vev sammensetning, og påfølgende progresjon av regenerering observert med naturlig tverr fisjon 18,24. Selv physa amputasjon tilsvarer noe til den naturlige modus for aseksuell reproduksjon i Nematostella, har molekylære forskjeller vært registrert mellom regenerering som følge av naturlig fisjon og amputasjon på midten av kroppen eller på physa 16,18,24. Enten physa fremstilt ved fremgangsmåten ifølge amputasjon er beskrevet her eller naturlig spalting viser slike forskjeller gjenstår å bli bestemt.
Det er noen spørsmål som er avgjørende for å lykkes med å oppdra amputasjon, og scorings teknikker beskrevet her. Polypper valgt for amputasjon shouLD opprettholdes ved samme temperatur, tilpasset for physa størrelse, ernæringsmessige historie og hvis mulig alder (selv om sistnevnte ikke er blitt systematisk testet for å bestemme om det er en alder-effekt på variasjonen i trinn progresjon). Innhenting av et åpent sår med en skarp steril skalpell ha en buet blad er viktig for morfologiske observasjoner av sårtilheling mellom Stage 0 og Stage 1. Når physa er oppblåst og den buede blad av skalpell er rystet over voksent vev, det er amputert i én bevegelse, og kan raskt overføres til behandling vel fra å kutte parabolen. Amputasjoner som omfatter mesentery, eller som er et resultat av omfattende fysisk manipulasjon skal kastes.
Praksis iscenesettelse ubehandlet physa å få en følelse av individuell variasjon i populasjonen som testes. Variasjon mellom individ physa er minst for de tidligste stadier. For eksempel, alle physa er i Stage 0 til 0 dpa. På samme måte hele physa nå Stage1 synkront på en dpa. Utseendet til trinn 2 kan være vanskeligere for observatøren å skjelne fordi 'inflasjon' er en relativ tilstand som er oppnådd, men ved to dpa med liten variasjon. Utseendet av ekte tentakler merker progresjon til Stage 3. regenererende tentakler kan være skjult av utseendet til en membran "kokong" som hindrer visualisering av tentakkel knopp under. Dersom membranbelegget ikke tidligere er blitt fjernet, må det gjøres det nå. Fjerning av membranen med fin spiss pinsett vil frigjøre regenererende physa. Skillet mellom Trinn 4 og 5 er antall folde mesenteries. Stage 4 har fire eller færre plisserte mesenteries, og Stage 5 har fem til åtte plisserte mesenteries. Mens plissering kan observeres i en sidevisning, er det nøyaktige antallet plisserte mesenteries bedre observert med en aboral utsikt.
En utfordring i å studere voksen Nematostella regenerering fra en grafisa rudiment, og faktisk med vev kuttet fra andre amputasjon nettsteder, er det variert klarhet i levende vev. Den pære av physa er relativt klar i intakt voksen, men det blir ganske ugjennomsiktig på grunn av vev kontraksjon etter amputasjon. Klarhet returnerer gradvis (trinn 2) Når såret lukkes (Trinn 1) og dyret begynner å blåse, men selv da regionen rundt sårstedet der vev og strukturer er aktivt regenererende restene noe skjult av tett vev (spesielt Stage 3). Økt inflasjon vanligvis følger med Stage 4 og 5. Fixation fulgt av optisk avklaring vil nesten helt sikkert løse hva som skjer på den muntlige slutten, men mer informativ kan være levende, vevsspesifikke transgene reportere som kan overvåkes for fluorescens og mer lett å visualisere 15, 25-30.
En amputert physa åpenbart ikke kan mate siden det mangler tentakler, munn og mesenteries (som rommer fordøyelseskjertler), og dermed krav som stillesring regenerering av manglende kroppsstruktur som skal oppnås ved å mobilisere næringsreserver fra non-food kilder. Den physa potensielt kan oppnå dette på er ved autophagy, hvori cytoplasma, organeller og andre cellulære komponenter er omsluttet intracellulært og behandlet med en lysosom-avhengig mekanisme for å produsere energi, og forbindelser for anabole prosesser 31-33. Vi finner at behandling physa med lysosome inhibitor, klorokin, fører til unormal regenerering av mesenteries og tentakler, og generell kroppsplanen, noe som indikerer at autofagi er nødvendig for normal regenerering av muntlige og kroppsstrukturer. Autophagy regulerer stamcelle funksjoner 34-36, og spiller viktige roller i regenerering i Hydra, planaria, og sebrafisk 37-41. Videre analyser er nødvendig for å forstå hvordan autofagi påvirker Nematostella regenerering på cellulære og molekylære nivåer, men vår første pass eksperiment viser nytten av å bruke NRSS som en rask screening metode for små molekyler som kan påvirke gjenfødelse.
De genetiske, molekylære og cellulære prosesser som regulerer regenerering i Nematostella er bare i en elementær stadium av forståelse, men dette emergent modell for regenerering har en voksende repertoar av verktøy for genomisk og genekspresjonsanalyse. Med sin Annotated genom, en overflod av regionale og vev spesifikke genetiske markører, og robuste metoder for transgenesis, mutagenese, histologi og mikroskopi, lover Nematostella å avsløre mekanismene som styrer anthozoan nesledyr regenerering og avdekke om sine regenerative prosesser er lik eller unik blant nesledyr og metazoans generelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Grant til GHT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Glass Culture Dish, 1,500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 mL |
| Polyethylene transfer pipette, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex Petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass Petri plates |
| Sterile 6-well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12-well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24-well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000 mL | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 - 40X magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , The Boxwood Press. (1986).
- Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. , Jean & Herman Verbeek. (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
