Abstract
Cnidarians, och särskilt Hydra, var de första djuren visade att regenerera skadade eller avslitna strukturer, och faktiskt sådana undersökningar utan tvekan lanserat modern biologisk undersökning genom arbetet i Trembley mer än 250 år sedan. Närvarande studiet av regenerering har sett ett uppsving med hjälp av både "klassiska" regenerativa organismer, såsom Hydra, planaria och Urodeles, samt en breddning spektrum av arter som sträcker sig över området av metazoer, från svampar genom däggdjur. Förutom dess inneboende intresse som ett biologiskt fenomen, kommer att förstå hur regenerering fungerar i en mängd olika arter informera oss om huruvida regenerativa processer har gemensamma funktioner och / eller arter eller kontextspecifika cellulära och molekylära mekanismer. Starlet havsanemon, nematostella vectensis, är ett växande modellorganism för regenerering. Liksom Hydra, är nematostella en medlem av den gamla stammen, cnidaria, men inom than klassen Anthozoa, en syster klad till hydrozoa som är evolutionärt mer basala. Således aspekter av förnyelse i nematostella ska bli intressant att jämföra och kontrastera med de Hydra och andra nässeldjur. I den här artikeln presenterar vi en metod för att Bisect, observera och klassificera regenerering av aboral änden av nematostella vuxen, som kallas physa. Den physa undergår naturligt klyvning som ett medel för asexuell reproduktion, och antingen naturliga klyvning eller manuell amputation av physa utlöser återväxt och reformation av komplexa morfologier. Här har vi kodifierat dessa enkla morfologiska förändringar i nematostella Regeneration Staging System (den NRSS). Vi använder NRSS att testa effekterna av klorokin, en hämmare av lysosomal funktion som blockerar autophagy. Resultaten visar att regenereringen av polyp strukturer, i synnerhet de mesenteries, är onormal när autophagy inhiberas.
Introduction
Observationen av förnyelse i en enda hydra var det nyskapande händelse i tillkomsten av biologi som en experimentell vetenskap 1,2. Regenerering är fortfarande ett fenomen av utomordentligt bred vädjan till biolog och lekman lika. Potentialen för utvecklings biologer, kliniker, biomedicinska analytiker och vävnads ingenjörer att förstå och övervinna gränserna för mänsklig förnyelse gör regenerering biologi mer än egen intressant.
Nu, med hjälp av ny teknik, såsom genomsekvensering och vinst och förlust av funktionsverktyg är fältet redo att retas isär regenerativa mekanismer och att slutligen förstå hur olika arter kan regenerera medan andra inte kan. Graden av gemensamhet i molekylära, cellulära och morfologiska svar återstår att klarlägga, men hittills verkar det som de grundläggande reaktioner bland djur som kan regenerera är mer lika än vad som skulle ha varit imagiNed bara ett decennium sedan tre.
Nässeldjur i synnerhet är enkel på att regenerera nästan alla sina kroppsdelar bland ett brett spektrum av morfologisk mångfald. Från den ensamma färskvatten polyp, Hydra tillsammans med de små marina polyper som bygger enorma korallrev, till de komplexa koloniala Siphonophor, såsom den portugisiska Man-O-War, är regenere ofta en form av reproduktion, förutom en mekanism för reparera eller reformera skadade eller förlorade kroppsdelar till följd av skada och predation. Om de olika arter av Cnidaria använder liknande eller olika mekanismer för regenerering är en principiellt intressant fråga 4-6.
Vi och andra har varit att utveckla den KORALLDJUR, vectensis nematostella som en modell för regenerering 7-17. Vi utvecklade nyligen en mellanstation system för att beskriva regenerering av en hela kroppen från en morfologiskt enhetlig bit vävnad tudelas från Aboral slutet av polyp 10. Medan nematostella polyper kan regenerera när tudelas på alla nivåer, valde vi att skära vuxna i en aboral position i de morfologiskt enkla regionen, physa, delvis eftersom det är nära till normalplanet av naturliga asexuell fission 18, och också eftersom det tillåter observation och molekylära analyser av hur en hel kropp ihop från de enklaste morfologiska komponenter.
Den nematostella Regeneration Staging System (NRSS) ger en relativt enkel uppsättning morfologiska riktmärken som kan användas för att göra mål utvecklingen av någon aspekt av regenerering av en amputerad physa under normala odlingsbetingelser eller experimentellt störs situationer som småmolekylära behandlingar, genmanipulation eller miljö förändring. Som väntat är NRSS bli antagen som en morfologisk byggnadsställning som de cellulära och molekylära händelser förnyelse kan refereras10.
Slutligen vår metod för skärning ger ett gapande hål flera tiopotenser större än sällade punktering som används i en nyligen genomförd studie 17, men båda sår läker i cirka 6 timmar. Dokumentera visuellt gripa och distinkta faser av sårtillslutning bör föreslå experimentella metoder för att förklara den skenbara oberoende av storleken på ett sår och den tid det tar att stänga. Således, en djupare visuell förståelse för aboral amputation processen, som tillhandahålls av detta protokoll kommer att hjälpa ytterligare undersökningar i denna modell regenereringssystem och bredda tillämpningen av denna iscensättning system med nematostella vectensis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konditionering av djur för temperatur, näring och ljus / mörkercykel
- Skaffa nematostella vectensis vuxna från en av de många nematostella labb världen över, eller en ideell leverantör (tabell 1)
- Bibehålla nematostella vid konstant temperatur (typiskt mellan 18 och 21 ° C) i mörker, i "1 / 3x" artificiellt havsvatten (ASW) vid en salthalt av 12 delar per tusen (ppt). Bibehålla kulturer i enkla sodaglasodlingsskålar, typiskt 250 ml eller 1,5 L kapacitet 11.
Obs: Dessa enkla odlingsbetingelser används vanligen bland labb som studerar nematostella, men kultur vård kan också automatiseras 19. - Feed nematostella nyligen kläckts Artemia naupliuslarverna 2 - 4x per vecka. Hatch Artemia cystor i full styrka (36 ppt) eller 1 / 3x ASW vid 30 ° C, i en grund rektangulär glasskål 20 eller inågon av ett antal småskaliga, kommersiella eller hemlagad artemia kläckerier. Om en inkubator är inte tillgänglig, kommer räkor kläcks vid RT men gör det långsammare.
Obs: Detta kräver ofta mer än 24 timmar för fullbordande. - Ersätta anemone kultur vatten minst en gång i veckan. För bästa vuxna hälsa, rengör (utan tvål) kulturen skålar en gång i veckan av ackumulerade slemsekret, som päls skålen och kan fälla matrester och avfall, och snärja djuren.
2. Val och avkoppling av Nutritionally Konditionerade Djur
- Välj storlek matchade polyper av ungefär samma längd (3 - 5 cm, när naturligt avspänd) och placera dem i en skål separeras från kolonin för tre dagar före amputation.
Obs: Antalet djur som valts ut för skärning kommer att bestämmas av experiment genomförs, naturligtvis, men i allmänhet vi rekommenderar minst fem djur per provtagningspunkt med sex upprepningar. Sålunda,i ett typiskt experiment minst 30 djur skulle förväljas. I allmänhet är det klokt att välja mer än minimiantalet (30) sedan amputationer som är oregelbunden (se nedan) kan senare påverka poäng. - Ta skålen av utvalda djur från inkubatorn i rummet ljuset åtminstone en timme före amputation.
Obs: Exponering för rumsbelysning och vibrationer av hantering kommer sannolikt leda till att djuren ihop sig, så de behöver anpassas eller "avslappnad" genom inkubation på laboratoriebänken. Djuren kommer att bli eldfasta att beröra och ljusexponering och vid denna punkt kan flyttas genom försiktig pipettering. - Valfritt: Bedöva djuren genom att tillsätta 7,5% MgCl2 (i 1 / 3x ASW). Lägg försiktigt MgCl2 lösning i skålen med en vanlig plast 5 ml pipett.
Obs: Även djur så småningom kommer att vänja sig vid ljuset och fysisk manipulation, kan det vara fördelaktigt att söva djur för att upprätthålla eller "fixa" than avslappnat tillstånd efter att de har blivit avlånga 16,21,22. - Använd en bred borrning (> 0,5 cm) plastpipetten att överföra (i 1 / 3x ASW) fem djur från poolen måste amputeras, i botten av en steril glasskär maträtt av 100 mm diameter innehållande 12 ppt ASW. Placera skålen på scenen av en stereo med variabel förstoring mellan 10 - 40X.
Obs: Om djuren inte har bedövas och avslappnad för kapning, kan de ändå svara att beröra och stereoskop belysning och därmed kan behöva några minuter för att bli avslappnad igen.
3. Amputation
- Med användning av en steril skalpell, amputera aboral physa från varje polyp, med målet att erhålla en sektion av physa som är ungefär lika långt som den är bred och som inte innehåller något tarmkäx.
Obs: Den ideala cut webbplats är bara aboral till uppsägning av tarmkäxet. Vid planet för skär det finns en övergång från tarmkäxet korrekt att tunna lines motsvarande varje mesenterial insättning (se figur 1, pilar). Avsaknad av tarmkäx är kritisk, eftersom det producerar slem som kan underlätta "pluggning" hålet 17,30.- Placera skalpellblad i kontakt med djuret på det önskade stället för amputation. Gör detta antingen på egen hand (frihand), eller genom att försiktigt ta tag i djurets kropp med # 5 pincett (Dumont stil eller liknande).
- Skär genom vävnaden genom att utnyttja den krökta bladet i skalpellen i en "gungande" rörelse över kroppen.
Obs: Vävnaden bör bryta rent som skalpellen gungas och befria den önskade delen av physa från donatorn. Men om en liten bit vävnad ansluter fortfarande kroppen och physa, skär den med skalpell. Försök inte att separera de anslutna bitar genom att dra, eftersom det kan skada physa.
- Ta bort varje amputerade "givare" polyp från skålen och returnera den till en SEPAränta skål märkt "poolade amputerade"; datum skålen och returnera den till stamkultur.
Obs: amputerat polyper kommer att läka aboral såret inom en dag och sedan kan matas normalt. De kommer att regenerera en normal ser physa inom två veckor vid vilken punkt physa kan amputerade igen om så önskas. - Skölj den utskurna physa som finns kvar i skär skålen i 12 ppt ASW, sedan överföra varje physa till en separat steril brunn i en flerbrunnscellodlingsplatta som redan innehåller 10 ml 12 ppt ASW i varje brunn.
Obs: I detta exempel används en sex brunnar, där varje brunn håller 10 ml havsvatten och fem exciderad physa. I allmänhet havsvatten bör omfatta physa tillräckligt för att undvika exponering för luft på grund av rörelse i hantering och potentiella avdunstning. Plattan eller brunnar bör ha ett lock. - Upprepa steg 3,1-3,3 för att samla in åtminstone fem physa i varje brunn reserverad för varje experimentell behandling.
- Inkubera physa vid en temperatur som kommer att PROVide de bästa flighterna för förnyelse för de planerade försöks förhör. Placera plattan innehållande physa in i en temperaturreglerad inkubator, vid en fixerad temperatur bestäms av den önskade graden av regenerering.
Obs: physa kommer regenerera saknade vävnader och bildar en fullständig polyp när de inkuberas vid temperaturer mellan 15 och 27 ° C. Hastigheten för regenerering är temperaturberoende med undantag för de två första stegen. Den genomsnittliga dagen för att nå Steg 4 för alla temperaturer är 7 d efter skärning och detta sammanfaller också med regenerering vid 21 ° C. Vid 27 ° C, är Stage 4 nåddes cirka 3 dagar tidigare och vid 15 ° C, är Stage 4 fördröjd med ungefär 3 d jämfört med regenerering vid 21 ° C (även se referens 10).
4. Bedömning Regenerering med nematostella Regeneration Staging System (NRSS)
- Betyg den physa med hjälp av en stereo-mikroskop med variabel magnification (10 - 80X). Gör det nyskurna nematostella physa i fas 0 och fortsätta scoring vid samma tid varje dag efter amputation (dpa) med användning av NRSS 10.
Obs! För nyckelmellan kriterier och information finns Referens 10.- Betyg physa i fas 0 (öppet sår) om en nyklippt physa visas som en skålformad massa liknar en slapp ballong, med ett öppet sår webbplats är sannolikt synlig.
Anmärkning: De sårkanterna kan också hålla ihop från början, men vävnaden kommer fortfarande fällas ihop och saknar styvhet. Kanterna på det öppna såret kan observeras genomgår radiell sammandragning som såret läker. - Betyg physa i fas 1 (Wound Closed) om amputation såret verkar stängd.
Obs: Wound plats kommer att motsvara den framtida oral pol. Den yttre ytan runt framtida oral pol kan börja visa olika bågar motsvarar de underliggande radiellt symmetrisk endodermala mesenterial insättningar. - poäng phYSA som Stage 2 (Radiella Valv) om ytan på den orala polen visas uppblåst, avslöjar åtta upphöjda valv anordnade i ett radiellt symmetriskt mönster och åtskilda av spår. Observera små halvrunda blåsor i toppen av bågarna. De kommer att vara ungefär lika lång som bred, troligen övergående, och initialt består av en enda ektodermal cellskikt.
Obs: I vissa fall dubbelskiktade blåsor kan stabiliseras. Obs: Vid detta eller senare iscensätter en slemskikt kan visas att kapsla in physa (Figur 2) i en membran "mantel". Detta inkapslande material bör tas bort för att underlätta scoring. - Betyg physa i fas 3 (Tentacle) om knopparna av tentakler som innehåller endodermala och ektodermal vävnadsskikt är stabilt bildas vid den muntliga slutet av åtminstone några radiella bågar.
Notera: De tentakler är längre än de är breda och är minimalt motila. Den physa visar ökat, men varierande inflation så att tarmkäxet grunderna kan bli visible sträcker sig från den mesenterial införing i kroppshåligheten (coelenteron). - Betyg physa i fas 4 (Linear Mesenteries) om physa innehåller åtta distinkta, synliga mesenteries som sträcker sig in i coelenteron från insättningar i kroppen väggen, med orala-aboral längder som är mer än två gånger sin radiella bredd mätt från där de verkar ansluta till svalget vid dess aboral ände (enterostome).
Obs: Fyra eller färre mesenteries har "veckade" interna fria kanter. Svalget är synlig. Mer än åtta tentakler är synliga, rörliga och ibland ihop sig in i kroppen. - Betyg physa i fas 5 (övervägande Pleated Mesenteries) om physa har mer än fyra mesenteries med veckning, och veck är mer fullständig och slingrande än i steg 4. Djuret har en nästan "normal" vuxen utseende, men det finns inga synliga gonadala celler.
- Betyg physa i fas 0 (öppet sår) om en nyklippt physa visas som en skålformad massa liknar en slapp ballong, med ett öppet sår webbplats är sannolikt synlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Progressionen av morfologiska händelser under regenerering i avhuggna physa visas i figur 1 A, som inkluderar representativa vyer av physa vid varje NRSS skede. Den typiska physa snitt webbplats visas på vuxna (pilspetsar). Fotografierna i figur 1A visar progressiv förnyelse av orala och kroppsstrukturer från nyklippt physa genom fullt utvecklade polyp. Figur 1B, C visar arrangemanget av interna septa, de mesenteries, i steg 4 och steg 5, respektive. Observera att vissa mesenteries vid Steg 4 kommer att sakna "veckning", men att kvalificera sig som en etapp 5 majoriteten ska utveckla veck. Figur 1D visar en physa insvept i ett membran av slem som kan tas bort med pincett (Figur 1E). Medan vanligtvis inte skadligt för regenerering (om det inte orimligt svälls djuret) kan membranet hindra ledningen med physa och görning experimentella manipulationer, såsom mikroskopi, provfixering eller skörd för molekylär / biokemisk analys. Detta är bäst bort efter etapp 1, eller senare om det reformer.
Figur 2 visar hur iscensättningen systemet kan användas för att göra mål resultaten av ett experiment för att bedöma effekterna av att hämma autophagy. Physa skars och behandlades med klorokin vid 10, 50 och 100 | iM, eller physa var obehandlade (kontroll). Klorokin hämmar lysosomala funktioner som krävs för autophagy. De NRSS kriterier användes för att poängsätta physa under loppet av regenerering och resultaten avsattes i figur 2E. Fotografier av representativ kontroll (figur 2A) och klorokin behandlade physa (Figur 2 B - D) gjordes när kontroller nått stadiet 5. klorokin behandlade djur inte utvecklas längre än steg 4, och de vanligtvis uppvisade ofullständig tarmkäx regeneraning (mest saknade plissering), kort tentakel storlek, och i vissa fall korta kroppslängd.
Figur 1. Dragen av Regeneration. (A) Exempel på physa regenere orala och kroppsstrukturer iscensatt enligt NRSS. Panelen märkt Vuxen visar särdrag hos en mogen djur med tentakler (t) svalget (ph), mesenteries (m) och tarmkäxet insertioner (mi). Vita pilar visar var veckad region mesenteries övergång till tarmkäxet insättning, en ås endoderm sträcker sig till aboral terminalen. Denna region utgör physa. Gula pilar visar ideal physa TUDELNING webbplats. Panel 0 visar fem physa minuter efter TUDELNING, och panelen 0 'är en förstorad vy av en en av dem physa, med öppet sår på centrerar, definierande Stage 0 avNRSS. Panel 1 visar en physa med såret nu stängd, definierar Steg 1. Panel 2 visar physa med upphöjda radiella bågar runt oral pol, med uppblåsta vävnader nedan motsvarar steg 2 (paneler 0-2 är vyer av den muntliga slut). Panel 3 visar tentakel knoppar framväxande vid den muntliga polen (vänd åt höger) av den långsträckta och blåsa physa, nu vid steg 3. Not rudimentär tarmkäx element synliga och svalget bildar i det mörka området vid den muntliga slut. Panel 4 visar framväxten av verkliga tentakler, liksom övergående "blåsor" vid den muntliga polen, definierar Steg 4. Linjär mesenteries syns i den uppblåsta physa. Den stora runda massa synlig inne i polyp är av okänt ursprung och kommer att utvisas genom munnen. Panel 5 visar nästan fullständig regenerering kännetecknas av mer än fyra veckade mesenteries, en fullt utvecklad pharynx och åtta eller fler tentakler, som definierar det som Steg 5. (B, C) Aboral utsikt enskilda physa illustrerar biradial arrangemanget och morfologi mesenteries. I den här vyn, veckade mesenteries verkar ha en utbuktning av vävnad halvvägs (grön pil). En Steg 4 physa har fyra eller mindre veckade mesenteries, och en scen 5 physa har mer än fyra (C). Mesenteries med eller utan veckning indikeras av gröna eller gula pilspetsar, respektive. Svart pil i (C) pekar på en veckad tarmkäx som har förlängt radiellt. (D, E) borttagning av en slem mantel från physa visas. De vita pilar indikerar en slem mantel som omger physa (D) som ska tas bort som i (E) innan scoring regenerering. Ibland vävnadsrester (gula pilar) kan fångas inuti höljet, och detta bör också tas bort. Asterisk anger orala stolpar, där märkeed. Röd Storlek barer är 0,5 mm i alla paneler utom A5 (1,0 mm). Paneler B och C i denna figur har modifierats och återges med tillstånd från referens 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Effekter av Klorokin på Regeneration. För att demonstrera en tillämpning av NRSS, testade vi effekterna av en klorokin, en inhibitor av autophagy. Physa amputerades och placerades omedelbart i en / 3x ASW innehållande 0,1% DMSO (kontroll) eller klorokin vid 10, 50, 100 ^ M. Physa bedömdes vid 24 timmars intervall med hjälp av NRSS. (A) Representativa endpoint bilder tagna av kontroller när de nådde etapp 5.
Figur 3. Sammanfattning avviktiga funktioner i NRSS steg. Detta diagram visar de viktigaste morfologiska förändringar som definierar varje steg i NRSS. Riktning rörelser indikeras med röda pilar och funktioner av Green pilspetsar. Stadium 0 skildrar öppet sår strax efter skärning (A), och t). Sårkanterna genomgår stängning radiell sammandragning mot mitten (B). Stadium 1 kännetecknas av fullständig stängning av såret (C) och förhöjning av bågarna mellan orala vända åsar (D); centrum av den orala ytan (pilspets) är nedtryckt. Stadium 2 har en uttalad valvbildning av den orala ytan (pilspets, E); den physa börjar långsträckt och blir trånga (F) med tentakel knoppar och blebs synliga vid spetsen av bågarna (pilspetsar). Steg 3 har stabila tentakel knoppar (pilspets, G) och den regenererande svalget kan ses som en densitet vid den muntliga polen (orange massa, pilspets i H (I) som bör vara minst dubbelt så länge som de är höga vid korsningen av svalget (I). Fyra eller färre mesenteries kan veckades med sin inre kant - den mesenterial filamentet (J, J '). Steg 5 kännetecknas av mer än fyra veckade mesenteries (K), som bäst kan bedömas genom att titta från aboral ände (K). Re-print med tillstånd från referens 10. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användning av nematostella som en modell för sårläkning och regenerering blir alltmer populärt. Således är det viktigt att kunna visualisera de morfologiska mönster av ett särskilt protokoll före effektiva cellulära och molekylära analyser kan tilldelas och jämföras. Nematostella har en hög grad av regenerativ "flexibilitet", att kunna reformera nästan alla saknade struktur amputerad på valfri plats, vid post planula skeden av livet. Sålunda har olika forskare undersökt regenere uppstått genom amputation eller såra i olika regioner av polyper, vid olika åldrar och storlekar 7-18.
Iscensättningen system som beskrivs här följer omvandlingen av en morfologiskt likformig del av physa, amputerade från aboral änden av en vuxen, en anatomiskt komplett ungdoms polyp saknas endast reproduktiv vävnad (vi har ännu inte fastställt när dessa regenere ungdomar blir sexuellt mratur). Detta tillvägagångssätt undersöker regenerering från en enkel rudiment av vävnad till en av nära maximal komplexitet. Inklusive fem physa minst gruppstorlek rekommenderas att normalisera för potentiella individuell variation och efterlevande. Naturligtvis kan detta antal justeras för att passa de särskilda experimentella mål men NRSS protokoll tillåter två ml medium per physa att förneka en potentiell "volymeffekt" som det som har rapporterats påverka förnyelse i hydra 23.
Andra metoder för att studera nematostella förnyelse har använt vuxna tudelade mitten kropp eller vid den muntliga slut, eller juvenila 4-tentakel scen polyper tudelas mitten kroppen 7,11-18. Två studier har undersökt förnyelse i physa frigörs genom naturlig fission 16,18, och tillvägagångssätt med amputerade physa har nyligen dykt upp med NRSS 8,9. Var och en av dessa olika metoder har sina egna meriter och kan ta itu med unika frågor om regenerative processer som sker under olika amputation eller sårande regimer och bland olika åldrade djur. Den NRSS protokollet för physa amputation och poäng, som visas i den aktuella studien, genererar en relativt enhetlig uppsättning physa för systematiska studier och undviker variation i physa storlek, vävnadssammansättning, och efterföljande utvecklingen av regenerering observeras med naturlig tvär fission 18,24. Även physa amputation motsvarar något till den naturliga läget av asexuell reproduktion i nematostella har molekylära skillnader noterats mellan regenerering till följd av naturlig klyvning och amputation i mitten av kroppen eller på physa 16,18,24. Om physa produceras med hjälp av metoden för amputation som beskrivs här eller naturlig fission visar dessa skillnader återstår att fastställa.
Det finns några frågor som är avgörande för att lyckas med uppfödning amputation, och poäng metoder som beskrivs här. Polyper som valts ut för amputation should hållas vid samma temperatur, matchas för physa storlek, närings historia och om möjligt ålder (även om den senare inte har testats systematiskt för att avgöra om det finns en ålders effekt på variationen i steg progression). Erhålla ett öppet sår med en skarp steril skalpell som har en krökt blad är viktigt för morfologiska observationer av sårläkning mellan etapp 0 och Steg 1. När physa blåses och böjt blad av skalpell vaggas över vuxen vävnad, det är amputerad i en rörelse och kan snabbt överföras till behandling väl från att skära skålen. Amputationer som inkluderar tarmkäxet eller som är resultatet av omfattande fysisk manipulation ska kasseras.
Öva staging obehandlad physa att få en känsla av individuell variation i befolkningen som testas. Variation mellan enskilda physa är minst för de tidigaste stadierna. Till exempel, alla physa är i etapp 0 vid 0 dpa. På samma sätt hela physa nå Stage1 synkront vid en dpa. Utseendet på etapp 2 kan vara svårare för betraktaren att urskilja eftersom "inflation" är en relativ tillstånd som uppnås, dock med 2 dpa med lite variation. Utseendet på sann tentakel märken progression till etapp 3. regenere tentakler kan skymmas av uppkomsten av en membran "kokong" som hindrar visualisering av tentakel linda under. Om membran täcker inte tidigare har avlägsnats, bör det göras så nu. Avlägsnande av membranet med fin spets pincett kommer att frigöra den regenererande physa. Distinktionen mellan steg 4 och 5 är antalet veckade mesenteries. Steg 4 har fyra eller färre veckade mesenteries, och Steg 5 har fem till åtta veckade mesenteries. Medan veckning kan observeras i en lateral vy, är det exakta antalet veckade mesenteries bättre observerade med en aboral utsikt.
En utmaning i att studera vuxen nematostella regenerering från en PHYsa rudiment, och faktiskt med vävnader klippts ut från andra amputations platser är varierad tydligheten i levande vävnad. Lampan i physa är relativt tydligt i den intakta vuxna, men det blir ganska ogenomskinligt på grund av vävnad kontraktion efter amputation. Klarhet återgår gradvis (etapp 2) en gång de lindade stänger (etapp 1) och djuret börjar blåsas upp, men även då regionen runt sårstället där vävnader och strukturer aktivt regenererande resterna något skymda av täta vävnader (speciellt Stage 3). Ökad inflation följer vanligtvis Steg 4 och 5. Fixering följt av optisk förtydligande kommer med största sannolikhet att lösa vad som händer vid den muntliga slutet, men mer informativ kan vara levande, vävnadsspecifika transgena reportrar som kan övervakas för fluorescens och lättare synlig 15, 25-30.
En amputerad physa uppenbarligen inte kan mata eftersom det saknar tentakler, mun och mesenteries (som hyser matsmältningskörtlar), alltså behöver utförasring regenerering av saknade kroppsstrukturer kan åstadkommas genom att mobilisera näringsreserver från icke-livsmedel källor. Den physa kan potentiellt åstadkomma detta är genom autophagy, i vilka cytoplasman organeller och andra cellulära komponenter är uppslukade intracellulärt och bearbetas av en lysosom-beroende mekanism för att producera energi och föreningar för anabola processer 31-33. Vi finner att behandla physa med lysosomen hämmare, klorokin, orsakar onormal förnyelse av mesenteries och tentakler, och allmänna organ morfologi, vilket indikerar att autophagy krävs för normal förnyelse av orala och kroppsstrukturer. Autophagy reglerar stamcells funktioner 34-36, och spelar viktiga roller i förnyelse i Hydra, planaria, och zebrafisk 37-41. Ytterligare analys krävs för att förstå hur autophagy påverkar nematostella förnyelse på cellulär och molekylär nivå, men vår första passet experiment visar nyttan av att använda NRSS som en snabb screeningmetod för små molekyler som kan påverka regenerering.
De genetiska, molekylära och cellulära processer som reglerar förnyelse i nematostella är endast i ett rudimentärt stadium av förståelse, men denna framväxande modell för regenerering har en växande repertoar av verktyg för genomisk och genuttryck analys. Med sin Annotated genom en uppsjö av regionala och vävnadsspecifika genetiska markörer, och robusta metoder för genmodifiering, mutagenes, histologi och mikroskopi, nematostella lovar att avslöja mekanismer som styr KORALLDJUR nässeldjur förnyelse och avslöja om dess regenerativa processer är likartade eller unik bland nässeldjur och metazoans i allmänhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Bidrag till GHT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Glass Culture Dish, 1,500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 mL |
| Polyethylene transfer pipette, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex Petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass Petri plates |
| Sterile 6-well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12-well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24-well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000 mL | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 - 40X magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , The Boxwood Press. (1986).
- Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. , Jean & Herman Verbeek. (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al.
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T.
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E.
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
