Abstract
Cnidarianer, og specifikt Hydra, var de første dyr vist sig at regenerere beskadigede eller afhuggede strukturer, og faktisk sådanne undersøgelser velsagtens lanceret moderne biologisk undersøgelse gennem arbejdet i Trembley mere end 250 år siden. I øjeblikket studiet af regenerering har oplevet en opblomstring ved hjælp af begge de "klassiske" regenerative organismer, såsom Hydra, Planaria og Urodeles, samt en udvidelse spektrum af arter, der spænder over intervallet Metazoa, fra svampe gennem pattedyr. Udover dens iboende interesse som et biologisk fænomen, vil forstå, hvordan regenerering arbejder i en række arter informere os om, hvorvidt regenerative processer deler fælles træk og / eller arter eller kontekst-specifikke cellulære og molekylære mekanismer. Den starlet søanemone, Nematostella vectensis, er en ny model organisme til regenerering. Ligesom Hydra, Nematostella er medlem af den gamle phylum, Cnidaria, men inden for than klasse Anthozoa, en søster clade til hydrozoa der er evolutionært mere basal. Således aspekter af regenerering i Nematostella bliver interessant at sammenligne med de Hydra og andre cnidarianer. I denne artikel præsenterer vi en metode til at gennemskære, observere og klassificere regenerering af aboral ende af Nematostella voksen, som kaldes physa. Den physa undergår naturligt fission som et middel til ukønnet formering, og enten naturlig fission eller manuel amputation af physa udløser genvækst og reformation af komplekse morfologier. Her har vi kodificeret disse enkle morfologiske ændringer i en Nematostella Regeneration Iscenesættelse System (dettes NRSS-organ). Vi bruger dettes NRSS-organ til at afprøve virkningerne af chloroquin, en inhibitor af lysosomal funktion, der blokerer autofagi. Resultaterne viser, at regenerering af polyp strukturer, især mesenteries, er unormal, når autophagy inhiberes.
Introduction
Observation af regenerering i en enkelt hydra var den skelsættende begivenhed i fremkomsten af biologien som en eksperimentel videnskab 1,2. Regeneration forbliver et fænomen af ekstraordinært bred appel til biolog og lægge personen ens. Potentialet for udviklingsmæssige biologer, klinikere, biomedicinske forskere og væv ingeniører til at forstå og overvinde grænserne for menneskelig regenerering gør regenerering biologi mere end uløseligt interessant.
Nu, med brug af nye teknologier såsom genom sekventering og gevinst og tab af funktion værktøjer, er feltet klar til at drille hinanden regenerative mekanismer og i sidste ende at forstå, hvordan forskellige arter kan regenerere, mens andre ikke kan. Graden af ensartethed i molekylære, cellulære og morfologiske reaktioner mangler at blive belyst, men indtil videre ser det ud til, at de grundlæggende reaktioner blandt dyr, der kan regenerere er mere ens, end det ville have været imagiNed kun et årti siden 3.
Cnidarianer i særdeleshed er facile på regenerere næsten alle deres kropsdele midt et bredt spektrum af morfologisk mangfoldighed. Fra den ensomme ferskvand polyp, Hydra sammen med de små marine polypper, der bygger enorme koralrev, til de komplekse koloniale siphonophorer, såsom den portugisiske Man-O-War, regenerering er ofte en form for reproduktion, i tillæg til en mekanisme for reparere eller reformere beskadigede eller mistede kropsdele som følge af skade og prædation. Om de forskellige arter af Cnidaria anvender tilsvarende eller forskellige mekanismer til regenerering er et fundamentalt interessant spørgsmål 4-6.
Vi, og andre har været at udvikle anthozoan, Nematostella vectensis som en model for regenerering 7-17. Vi har for nylig udviklet en mellemstation system til at beskrive regenerering af et hele kroppen fra et morfologisk ensartet stykke væv gennemskæres fra Aboral ende af polyp 10. Mens Nematostella polypper kan regenerere, når gennemskæres på ethvert niveau, valgte vi at skære voksne på en aboral position i den mest morfologisk simple region, physa, dels fordi det er tæt på det normale plan naturlig ukønnet fission 18, og også fordi det tillader observation og molekylære analyser af, hvordan et hele kroppen samles igen fra de simpleste morfologiske komponenter.
Den Nematostella Regeneration Staging System (dettes NRSS-organ) tilvejebringer et relativt simpelt sæt af morfologiske kriterier, som kunne anvendes til at score forløbet af ethvert aspekt af regenerering af en amputeret physa under normale dyrkningsbetingelser eller eksperimentelt perturbed situationer som småmolekylære behandlinger, genetisk manipulation eller miljømæssig ændring. Som forventet, er dettes NRSS-organ bliver vedtaget som en morfologisk stillads, hvor de cellulære og molekylære begivenheder regenerering kan refereres10.
Endelig vores fremgangsmåde til skæring frembringer et gabende hul adskillige størrelsesordener større end utrolig lækker punktering anvendes i en nylig undersøgelse 17, men begge sår heler i omkring 6 timer. Dokumentere de visuelt fængslende og adskilte faser af sårlukning bør foreslå eksperimentelle metoder til at forklare den tilsyneladende uafhængighed af størrelsen af et sår, og den tid det tager at lukke. Således en dybere visuel forståelse af den aboral amputation proces, leveres af denne protokol, vil hjælpe yderligere undersøgelser i denne model regenerering systemet og udvide anvendelsen af denne iscenesættelse system ved hjælp af Nematostella vectensis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konditionering af dyr for temperatur, Ernæring og Lys / Mørk Cycle
- Opnå Nematostella vectensis voksne fra en af de mange Nematostella laboratorier verden over, eller en non-profit leverandør (tabel 1)
- Vedligehold Nematostella ved konstant temperatur (typisk mellem 18 og 21 ° C) i mørke, i "1 / 3x" Kunstig Hav Vand (ASW) ved en saltholdighed på 12 promille (ppt). Opretholde kulturer i simple natronkalkglas dyrkningsskåle, typisk 250 ml eller 1,5 L kapacitet 11.
Bemærk: Disse enkle dyrkningsbetingelser er almindeligt anvendt blandt laboratorier, der studerer Nematostella, men kultur pleje kan også automatiseres 19. - Feed Nematostella frisk udklækket Artemia nauplii 2 - 4x om ugen. Hatch Artemia cyster i fuld styrke (36 ppt) eller 1 / 3x ASW ved 30 ° C, i en lavvandet firkantet glasfad 20 eller ienhver af en række små, kommercielle eller hjemmelavede saltlage rejer rugerier. Hvis en inkubator ikke er tilgængelig, vil rejer klækkes ved RT men gør det langsommere.
Bemærk: Det kræver ofte mere end 24 timer til færdiggørelse. - Udskift anemone kultur vand mindst en gang om ugen. For bedst voksen sundhed, grundigt rene (uden sæbe) kulturen skåle en gang om ugen af akkumulerede slim sekreter, hvilket pels skålen og kan fælde Foderrester og affald, og entangle dyrene.
2. Valg og Lempelse af Ernæringsmæssigt Betinget Dyr
- Vælg størrelse matchede polypper af omtrent samme længde (3 - 5 cm, når naturligt afslappet) og placere dem i en skål adskilt fra kolonien i tre dage forud for amputation.
Bemærk: Antallet af dyr udvalgt til skæring vil blive bestemt af eksperimentet gennemføres, naturligvis, men generelt anbefaler vi mindst fem dyr pr prøve point med seks gentagelser. Dermed,i et typisk forsøg mindst 30 dyr ville blive forudvalgt. Generelt er det klogt at vælge mere end det minimale antal (30), da amputationer, der er uregelmæssige (se nedenfor) kan senere påvirke scoring. - Fjern skålen af udvalgte dyr fra inkubatoren til rumbelysning mindst en time før amputation.
Bemærk: Udsættelse for lys og vibrationer håndtering vil sandsynligvis medføre, at dyrene kontrakt, så de skal tilpasses eller "afslappet" ved inkubation på laboratoriet bænken. Dyr bliver refraktær at røre og lyseksponering og på det tidspunkt kan bevæges ved forsigtig pipettering. - Valgfrit: Bedøver dyrene ved at tilsætte 7,5% MgCl2 (i 1 / 3x ASW). Tilføje forsigtigt MgCl2-opløsning til skålen med en standard plast 5 ml pipette.
BEMÆRK: Selvom dyr sidste ende vil blive vant til lyset og for fysisk manipulation, kan det være fordelagtigt at bedøve dyr til at opretholde eller "fix" than afslappet tilstand, efter at de er blevet aflang 16,21,22. - Brug en bred boring (> 0,5 cm) plastik pipette til at overføre (i 1 / 3x ASW) fem dyr fra puljen til amputeres, i bunden af en steril glas skæring fad på 100 mm med 12 ppt ASW. Sæt fadet på scenen af et stereomikroskop med variabel forstørrelse mellem 10 - 40X.
Bemærk: Hvis dyrene ikke er blevet bedøvet og afslappet til skæring, kan de stadig reagere på berøring og stereoskop belysning og dermed kan have brug for et par minutter til at blive afslappet igen.
3. Amputation
- Anvendelse af en steril skalpel, amputere aboral physa fra hver polyp, med det mål at opnå en sektion af physa som er cirka så længe den er bred og indeholder ingen mesenterium.
Bemærk: Den ideelle cut site er bare aboral til opsigelse af mesenterium. På planet for opskæring der er en overgang fra mesenteriet korrekt at tynde lines svarende til hver mesenteriale insertion (se figur 1, pile). Fravær af mesenterium er kritisk, fordi den producerer slim, der kan lette "tilslutte" hullet 17,30.- Placer skalpelblad i berøring med dyret på det ønskede sted for amputation. Gør dette enten uden hjælp (frihånd), eller ved forsigtigt fat i dyrets krop med en # 5 pincet (Dumont stil eller lignende).
- Skær gennem vævet ved at udnytte den buede klinge af skalpel i en 'vuggende' motion på tværs af kroppen.
Bemærk: Vævet skal skille rent som skalpellen er rystet og befri den ønskede del af physa fra donoren. Men hvis et lille stykke væv stadig forbinder kroppen og physa, skæres med skalpel. Forsøg ikke at adskille de tilsluttede stykker ved at trække, da dette kan beskadige physa.
- Fjern hvert amputeret "donor" polyp fra fadet og returnere den til en SEPAsats skål mærket "pooled amputerede«; dato skålen og returnere det til lager kultur.
Bemærk: amputeret polypper vil helbrede aboral sår inden for en dag, og derefter kan fodres normalt. De vil genskabe en normal leder physa inden for to uger på hvilket tidspunkt physa om ønsket kan igen amputeret. - Skyl det udskårne physa at forblive i den skærende skålen i 12 ppt ASW, og derefter overføre hvert physa til en separat steril brønd i en multi-brønds cellekultur plade, der allerede har 10 ml 12 ppt ASW i hver brønd.
Bemærk: Dette eksempel bruger en plade seks, med hver brønd holder 10 ml havvand og fem udskårne physa. Generelt havvand bør dække physa tilstrækkeligt til at undgå udsættelse for luft på grund af bevægelse i håndtering og potentiel fordampning. Pladen eller brønde bør have et låg. - Gentag trin 3.1 - 3,3 til indsamle mindst 5 physa i hver brønd reserveret for hver eksperimentel behandling.
- Inkubér physa ved en temperatur, der vil provIdé den bedste pris for regenerering for de planlagte eksperimentelle afhøringer. Pladen indeholdende physa i en temperaturreguleret inkubator ved en fast temperatur bestemmes af den ønskede hastighed af regenerering.
Bemærk: physa vil regenerere manglende væv og danne en fuld polyp, når de inkuberes ved temperaturer mellem 15 og 27 ° C. Hastigheden af regenerering er temperaturafhængig bortset fra de to første faser. Den gennemsnitlige dag for at nå Stage 4 for alle temperaturer er 7 d efter opskæring og dette falder også sammen med regenerering ved 21 ° C. Ved 27 ° C, er fase 4 nået omkring 3 dage tidligere og ved 15 ° C, er Stage 4 forsinkes med omkring 3 d i forhold til regenerering ved 21 ° C (også se reference 10).
4. Vurdering Regeneration med Nematostella Regeneration Staging System (dettes NRSS-organ)
- Score den physa ved hjælp af et stereo-sammensat mikroskop med variabel magnifiction (10 - 80X). Score den nyslået Nematostella physa i etape 0 og fortsætte scoring på samme tidspunkt hver dag efter amputation (dpa) ved hjælp dettes NRSS-organ 10.
Bemærk: centrale kriterier mellemstationer og angivelser refererer reference 10.- Score physa i etape 0 (åbent sår) Hvis en nyslået physa vises som en kop- formet masse ligner en slatten ballon, med et åbent sår site er sandsynligvis synlig.
Bemærk: sårkanterne kan også hænge sammen fra starten, men vævet vil stadig blive kollapsede og mangler stivhed. Kanterne af det åbne sår kan observeres undergår radial sammentrækning som såret heler. - Score physa i etape 1 (Wound Closed) hvis amputation sår vises lukket.
Bemærk: Wound placering vil svare til den fremtidige oral pol. Den ydre overflade omkring den fremtidige oral pol kan begynde at vise forskellige buer svarer til de underliggende radialt symmetrisk endodermale mesenteriale insertioner. - score phYsa i etape 2 (radial Arches) hvis overfladen af den orale pol vises oppustet, afslører otte hævede buer arrangeret i et radialt symmetrisk mønster og adskilt af riller. Overhold små halvkugleformede blærer på toppen af buer. De vil være lige så høj som bred, sandsynligvis forbigående, og i første omgang omfattet af en enkelt ektodermal cellelag.
Bemærk: I nogle tilfælde dobbelt-lag blærer kan stabilisere. Bemærk: På dette eller senere stadier en slim lag kan synes at indkapsle physa (figur 2) i en membranøs "kappe". Dette indkapsle materiale bør fjernes for at lette scoring. - Score physa i etape 3 (Tentacle) hvis knopper af tentakler indeholder endodermale og ektodermale vævslag stabilt dannes ved den mundtlige ende af i det mindste nogle radiale buer.
Bemærk: De fangarme er længere end de er brede og er minimalt bevægelige. Den physa vil vise øget, men variabel inflation, så mesenterium ansatser kan blive oversible strækker sig fra mesenteriale indsættelse i kropshulrummet (coelenteron). - Score physa i etape 4 (Lineære Mesenteries) hvis physa indeholder otte forskellige, synlige mesenteries der strækker sig ind i coelenteron fra indrykninger i kroppen væggen, med orale-aboral længder, der er mere end det dobbelte af deres radiale bredde målt fra hvor de synes at forbinde til svælget ved sin aboral ende (enterostome).
Bemærk: Fire eller færre mesenteries har "plisseret" interne frie kanter. Pharynx er synlig. Mere end otte fangarme er synlige, bevægelige og nogle gange de kontrakt i kroppen. - Score physa som Fase 5 (Overvejende Plisserede Mesenteries) hvis physa har mere end fire mesenteries med plissering, og gang så er mere fuld og bugtet end på trin 4. De animalske har en næsten "normal" voksen udseende, men der er ingen synlige gonadale celler.
- Score physa i etape 0 (åbent sår) Hvis en nyslået physa vises som en kop- formet masse ligner en slatten ballon, med et åbent sår site er sandsynligvis synlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Progressionen af morfologiske hændelser under regenerering i afhuggede physa er vist i figur 1A, som omfatter repræsentative visninger af physa på hvert dettes NRSS-organ fase. Den typiske physa cut site er angivet på voksne (pilespidser). Fotografierne i figur 1A viser progressiv regenerering af mundtlige og krop strukturer fra nyslået physa gennem fuldt dannet polyp. Figur 1B, C viser arrangementet af indre skillevægge, de mesenteries, på trin 4 og trin 5, hhv. Bemærk, at nogle mesenteries på fase 4 vil mangle "plissering", men at kvalificere sig som en Stage 5 flertallet skal have udviklet læg. Figur 1D viser et physa indhyllet i en membran af slim, som kan fjernes med en pincet (figur 1E). Mens normalt ikke er skadelige for regenerering (medmindre det urimeligt fælder dyret), kan membranen hindrer scorer det physa og gøreing eksperimentelle manipulationer, såsom mikroskopi, prøve fiksering eller høst til molekylær / biokemisk analyse. Dette er bedst fjernes efter fase 1, eller senere, hvis det reformer.
Figur 2 viser, hvordan mellemstationen kan anvendes til at score resultaterne af et eksperiment for at vurdere virkningerne af inhibering autofagi. Physa blev skåret og behandlet med chloroquin ved 10, 50 og 100 uM, eller physa var ubehandlede (kontroller). Klorokin hæmmer lysosomale funktioner, som er nødvendige for autofagi. Dettes NRSS-organ kriterier blev anvendt til at score physa i løbet af regenerering og resultater blev plottet i figur 2E. Fotografier af repræsentative kontrol (figur 2A) og chloroquin behandlet physa (Figur 2 B - D) blev foretaget, når kontroller nået stadie 5. Klorokin behandlede dyr ikke videre end stadie 4, og de typisk udstillet ufuldstændig mesenterium regeneraning (mest manglede plissering), korte fangarm størrelse, og i nogle tilfælde kort kropslængde.
Figur 1. Funktioner af Regeneration. (A) Eksempler på physa regenerere mundtlige og krop strukturer iscenesat efter dettes NRSS-organ. Panel mærket Adult viser træk af en moden dyr med fangarme (t) svælget (ph), mesenteries (M) og mesenterium indsættelser (mi). Hvide pile viser, hvor plisseret region mesenteries overgang til mesenteriet indsættelse, en højderyg af endoderm strækker sig til aboral endestation. Denne region udgør physa. Gule pile viser ideelle physa bisection site. Panel 0 viser fem physa minutter efter bisection, og Panel 0 'er et forstørret billede af en en af dem physa, med åbne sår i midten, der definerer Stage 0 iDettes NRSS-organ. Panel 1 viser en physa med såret nu lukket, definerer Stage 1. Panel 2 viser physa med hævede radiale buer omkring den mundtlige pol, med oppustede væv nedenfor, svarende til fase 2 (paneler 0 - 2 er udsigt over den orale ende). Panel 3 viser fangarm knopper nye ved den mundtlige pol (mod højre) af den aflange og puste physa, nu på stadie 3. Note rudimentær mesenterium elementer er synlige og svælg danner i det mørke område ved den mundtlige ende. Panel 4 viser fremkomsten af sande tentakler, samt forbigående 'blærer' ved den mundtlige pol, definerer Stage 4. Lineære mesenteries er synlige i den oppustede physa. Den store runde masse synlige inde i polyp er af ukendt oprindelse, og vil blive bortvist gennem munden. Panel 5 viser næsten fuldstændig regenerering karakteriseret ved mere end fire plisserede mesenteries, et fuldt dannet pharynx og otte eller flere fangarme, der definerer det som Fase 5. (B, C) Aboral udsigt over individuelle physa illustrere biradial arrangement og morfologi mesenteries. I denne opfattelse, plisserede mesenteries synes at have en bule af væv midtvejs (grøn pilespids). En Stage 4 physa har fire eller færre plisserede mesenteries, og en scene 5 physa har mere end fire (C). Mesenteries med eller uden plissering er angivet med grøn eller gul pilespidser, hhv. Sort pilespids i (C) peger på en plisseret mesenterium der har udvidet radialt. (D, E) Fjernelse af en slim kappe fra physa er afbildet. De hvide pile angiver en mukøse kappe omkring physa (D), der skal fjernes som i (E), inden lave regenerering. Undertiden tilbageværende væv (gule pile) kan være fanget i kappen, og dette også bør fjernes. Asterisk angiver mundtlige poler, hvor marked. Rød Størrelse barer er 0,5 mm i alle paneler, undtagen A5 (1,0 mm). Paneler B og C i denne figur er blevet ombygget og genoptrykt med tilladelse fra reference 10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Virkninger af Klorokin på Regeneration. For at demonstrere en anvendelse af dettes NRSS-organ, testede vi virkningerne af en chloroquin, en inhibitor af autofagi. Physa blev amputeret og øjeblikkeligt anbragt i 1 / 3x ASW indeholdende 0,1% DMSO (kontrol) eller chloroquin ved 10, 50, 100 uM. Physa blev bedømt med 24 timers interval ved anvendelse dettes NRSS-organ. (A) Repræsentative endpoint billeder taget af kontrol, når de nåede fase 5.
Figur 3. Sammenfatning afcentrale elementer i dettes NRSS-organ stadier. Dette diagram viser de vigtigste morfologiske ændringer, der definerer hver fase i dettes NRSS-organ. Retning af bevægelser er angivet med røde pile og funktioner ved grønne pilespidser. Stage 0 afbilder åbent sår lige efter opskæring (A), og t). Sårkanterne gennemgår lukning radial sammentrækning mod midten (B). Etape 1 er karakteriseret ved fuldstændig lukning af såret (C) og elevation af buer mellem orale-vender kamme (D); midten af den orale overflade (pilespids) er deprimeret. Etape 2 har en udtalt krumning af orale overflade (pilespids, E); den physa begynder at forlænge og bliver smalle (F) med fangarm knopper og blærer synlige i spidsen af buerne (pilespidser). Fase 3 har stabile fangarm knopper (pilespids, G) og regenererende svælg kan ses som en massefylde ved den mundtlige pol (appelsin masse, pilespids i H (I), der bør være mindst dobbelt så længe som de er høje på krydset af pharynx (I '). Fire eller færre mesenteries kan plisseret ved deres indre kant - den mesenteriale glødetråd (J, J '). Etape 5 er kendetegnet ved mere end fire plisserede mesenteries (K), der bedst kan vurderes ved at se fra aboral ende (K). Re-print med tilladelse fra reference 10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelse af Nematostella som en model for sårheling og regenerering bliver stadig mere populære. Således er det vigtigt at være i stand til at visualisere de morfologiske mønstre af en særlig protokol, inden effektive cellulære og molekylære analyser kan tildeles og sammenlignes. Nematostella have en høj grad af regenerativ "fleksibilitet", at være i stand til at reformere næsten enhver manglende struktur amputeret på ethvert sted, på post-Planula stadier af livet. Således har forskellige forskere undersøgt regenerering følge af amputation eller sårede i forskellige regioner af polypper, i forskellige aldre og størrelser 7-18.
Iscenesættelsen system, beskrives her følger omdannelsen af en morfologisk ensartet afsnit af physa, amputeret fra aboral ende af en voksen, til en anatomisk komplet juvenile polyp mangler kun reproduktive væv (vi har endnu ikke bestemt, når disse regenererede unge bliver seksuelt mperatur). Denne tilgang undersøger regenerering fra en simpel rudiment af væv til en af nær maksimal kompleksitet. Herunder fem physa som minimum gruppe størrelse anbefales at normalisere for potentiel individuel variation og efterladte. Selvfølgelig kan dette tal blive justeret til at passe de særlige eksperimentelle mål, men dettes NRSS-organ-protokollen tillader 2 ml medium pr physa at negere en potentiel 'volumen effekt' som det, der er blevet rapporteret at påvirke regenerering i hydra 23.
Andre metoder til at studere Nematostella regenerering har brugt voksne gennemskæres mid-krop eller ved den mundtlige ende, eller juvenile 4-fangarm stage polypper gennemskæres mid-krop 7,11-18. To studier har undersøgt regenerering i physa befriet ved naturlig fission 16,18, og metoder, der anvender amputeret physa har for nylig opstået med dettes NRSS-organ 8,9. Hver af disse forskellige tilgange har sine egne fortjenester og kan løse unikke spørgsmål om regenerative processer, der forekommer under forskellige amputation eller såre regimer, og blandt forskelligt gamle dyr. Dettes NRSS-organ protokol for physa amputation og scoring, vist i nærværende undersøgelse, genererer et relativt ensartet sæt physa for systematisk undersøgelse og undgår variation i physa størrelse, vævssammensætning, og efterfølgende progression af regenerering observeret med naturlig tværgående fission 18,24. Selvom physa amputation svarer lidt til den naturlige tilstand af ukønnet formering i Nematostella har molekylære forskelle blevet bemærket mellem regenerering som følge af naturlig fission og amputation medio krop eller på physa 16,18,24. Hvorvidt physa produceret ved fremgangsmåden i amputation beskrevet her, eller naturlig fission show sådanne forskelle er endnu ikke fastslået.
Der er et par problemer, der er afgørende for succes med opdræt amputation, og score teknikker beskrevet her. Polypper udvalgt til amputation should holdes ved samme temperatur, matchet til physa størrelse, ernæringsmæssige historie og om muligt alder (selv om sidstnævnte ikke er blevet systematisk testet for at afgøre, om der er en alder-effekt på variation i scenen progression). Opnåelse et åbent sår med en skarp steril skalpel har en krum klinge er vigtigt for morfologiske observationer af sårheling mellem fase 0 og trin 1. Når physa er oppustet og krumme blad af skalpellen vippes over voksent væv, det er amputeret i én bevægelse og kan hurtigt overføres til behandling godt fra opskæring skålen. Amputationer der omfatter mesenterium, eller som er resultatet af omfattende fysisk manipulation skal kasseres.
Øv iscenesættelse ubehandlet physa at få en fornemmelse af den individuelle variation i populationen, der testes. Variation mellem individuel physa er mindst for de tidligste stadier. For eksempel er alle physa er i fase 0 ved 0 dpa. På samme måde hele physa nå Stage1 synkront på en dpa. Udseendet af fase 2 kan være sværere for observatøren at skelne, fordi "inflation" er en relativ tilstand, der er opnået, dog med 2 dpa med lidt variation. Fremkomsten af sand tentakler mærker progression til fase 3. De regenererende tentakler kan skjules af fremkomsten af en membranøs "kokon", der hindrer visualisering af fangarm opløbet nedenunder. Hvis membranøs dækker ikke tidligere er blevet fjernet, skal det gøres så nu. Fjernelse af membranen med fine tippet pincet vil befri regenererende physa. Sondringen mellem trin 4 og 5 er antallet af plisserede mesenteries. Fase 4 har fire eller færre plisserede mesenteries, og Etape 5 har fem til otte plisserede mesenteries. Mens plissering kan observeres i en lateral udsigt, det nøjagtige antal plisserede mesenteries er bedre observeret med en aboral udsigt.
En udfordring i at studere voksen Nematostella regenerering fra en grafisa rudiment, og faktisk med væv skåret fra andre amputation sites, er det varierede klarhed i levende væv. Pæren af physa er relativt klart i den intakte voksne, men det bliver temmelig uigennemsigtig på grund af væv sammentrækning efter amputation. Klarhed returnerer gradvist (etape 2), når såret lukker (etape 1) og dyret begynder at puste, men selv da området omkring såret site, hvor væv og strukturer er aktivt regenererende rester noget skjult af tætte væv (især Stage 3). Øget inflation normalt ledsager Stage 4 og 5. Fiksering efterfulgt af optisk afklaring vil næsten helt sikkert løse, hvad der sker ved den mundtlige ende, men mere informative kan være levende, vævsspecifikke transgene reportere, der kan overvåges for fluorescens og lettere visualiseret 15, 25-30.
En amputeret physa kan naturligvis ikke foder, da det mangler tentakler, mund og mesenteries (som huser fordøjelseskirtlerne), således vandskravenering regenerering af manglende kroppens strukturer skal udføres ved at mobilisere reserver næringsstoffer fra ikke-fødevarer kilder. Den physa kan potentielt opnå dette er ved autophagy, hvori cytoplasma, organeller og andre cellulære komponenter er opslugt intracellulært og behandles af en lysosom-afhængig mekanisme til at producere energi og forbindelser til anabolske processer 31-33. Vi finder, at behandle physa med lysosomet hæmmer, chloroquin, forårsager unormal regenerering af mesenteries og fangarme, og generel krop morfologi, hvilket indikerer, at autophagy er nødvendig for normal regenerering af mundtlige og krop strukturer. Autophagy regulerer stamceller funktioner 34-36, og spiller væsentlige roller i regenerering i Hydra, Planaria, og zebrafisk 37-41. Yderligere analyser er påkrævet for at forstå, hvordan autofagi påvirker Nematostella regenerering på cellulære og molekylære plan, men vores første pass eksperiment viser nytten af at bruge NRSS som en hurtig screeningsmetode til små molekyler, som kan påvirke regenerering.
De genetiske, molekylære og cellulære processer, der regulerer regenerering i Nematostella er kun i en rudimentær fase af forståelse, men denne emergent model til regenerering har en voksende repertoire af redskaber til genomisk og genekspression analyse. Med sin kommenteret genom, et væld af regionale og væv specifikke genetiske markører, og robuste metoder til gensplejsning, mutagenese, histologi og mikroskopi, Nematostella lover at afsløre mekanismer, der styrer anthozoan cnidarian regenerering og afdække, om dens regenerative processer er ens eller enestående blandt cnidarianer og metazoans generelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Tilskud til GHT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Glass Culture Dish, 1,500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 mL |
| Polyethylene transfer pipette, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex Petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass Petri plates |
| Sterile 6-well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12-well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24-well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000 mL | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 - 40X magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , The Boxwood Press. (1986).
- Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. , Jean & Herman Verbeek. (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
