Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Nesledyrene, og spesielt Hydra, var de første dyrene vist seg å regenerere skadede eller avkuttede strukturer, og faktisk slike studier uten tvil lansert moderne biologisk henvendelse gjennom arbeidet Trembley mer enn 250 år siden. For tiden er studiet av regenerering har sett en fornyet bruk av både "klassiske" regenerative organismer, slik som Hydra, planaria og Urodeles, samt en utvidelse spektrum av arter som spenner over området metazoer, fra svamper gjennom pattedyr. Foruten sin iboende interesse som et biologisk fenomen, vil forstå hvordan regenerering fungerer på en rekke arter informere oss om hvorvidt regenerative prosesser dele fellestrekk og / eller arter eller kontekstspesifikke cellulære og molekylære mekanismer. Den starlet sjøanemone, Nematostella vectensis, er en ny modellorganisme for regenerering. Som Hydra, er Nematostella et medlem av den gamle phylum, Cnidaria, men innenfor tHan klasse Anthozoa, en søster clade til småmaneter som er evolusjonært mer basal. Dermed aspekter av regenerering i Nematostella vil være interessant å sammenligne og kontrast med de av Hydra og andre nesledyr. I denne artikkelen presenterer vi en metode for å halvere, observere og klassifisere regenerering av aboral slutten av Nematostella voksen, som kalles physa. Den physa gjennomgår naturlig fisjon som et middel for aseksuell reproduksjon, og enten naturlig fisjon eller manuell amputasjon av physa utløser ny vekst og reformasjon av komplekse morfologi. Her har vi kodifisert disse enkle morfologiske endringer i en Nematostella Regeneration Staging System (den NRSS). Vi bruker NRSS for å teste effekten av klorokin, en inhibitor av lysosomal funksjon som blokkerer autophagy. Resultatene viser at regenereringen av polyp strukturer, spesielt mesenteries, er unormal når autofagi er sperret.
Observasjonen av regenerering i en enkelt hydra var banebrytende hendelse i advent av biologi som en eksperimentell vitenskap 1,2. Regeneration er fortsatt et fenomen av usedvanlig bred appell til biolog og lå person likt. Potensialet for utviklings biologer, leger, biomedisinske forskere og ingeniører vev til å forstå og overvinne grensene for menneskelig regenerering gjør regenerering biologi mer enn egentlig interessant.
Nå, med bruk av nye teknologier som genomsekvensering og gevinst og tap av funksjon verktøy, er feltet klar til å erte hverandre regenerative mekanismer og til slutt forstå hvordan ulike arter kan regenerere mens andre ikke kan. Graden av felles i molekylære, cellulære og morfologiske responser er ikke avklart, men så langt ser det ut som de grunnleggende reaksjoner blant dyr som kan regenerere er mer lik enn det som ville ha vært Imagined bare et tiår siden 3.
Nesledyrene er spesielt lettvinte ved gjenoppfriske nesten alle sine kroppsdeler midt i et bredt spekter av morfologisk mangfold. Fra den ensomme ferskvann polypp, Hydra sammen med de små marine polypper som bygger enorme korallrev, til de komplekse koloni siphonophora, slik som den portugisiske Man-O-War, er regenerering ofte en modus for reproduksjon, i tillegg til en mekanisme for reparere eller reformere skadet eller mistet kroppsdeler som følge av skade og predasjon. Hvorvidt de ulike arter av Cnidaria bruke lignende eller ulike mekanismer for regenerering er et fundamentalt interessant spørsmål 4-6.
Vi, og andre har vært å utvikle anthozoan, Nematostella vectensis som en modell for regenerering 7-17. Vi har nylig utviklet en iscenesettelse system for å beskrive regenerering av en hele kroppen fra et morfologisk uniform stykke vev halvert fra Aboral enden av polypp 10. Mens Nematostella polypper kan regenerere da delt i to ved en hvilken som helst nivå, valgte vi å skjære voksne i en aboral posisjon i den mest morfologisk enkel region, den physa, dels fordi dette er nær det normale planet for naturlig aseksuell fisjons 18, og også fordi det tillatelser observasjon og molekylære analyser av hvordan en hele kroppen er satt sammen fra de enkleste morfologiske komponenter.
Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) gir et relativt enkelt sett med morfologiske benchmarks som kan brukes til å sette fremdriften av noen aspekter av regenerering av en amputert physa, under normale kultur forhold eller eksperimentelt opprørt situasjoner som små molekyl behandlinger, genetisk manipulering eller miljømessige endringer. Som forventet, er NRSS blir vedtatt som en morfologisk stillaset som de cellulære og molekylære hendelser av regenerering kan refereres10.
Endelig vår metode for skjæring produserer et gapende hull flere størrelsesordener større enn fint punktering brukt i en fersk undersøkelse 17, men begge sår leges i rundt 6 timer. Dokumentere visuelt fremtredende og distinkte faser av sårlukking skal foreslå eksperimentelle tilnærminger for å forklare den tilsynelatende uavhengig av størrelsen av et sår, og den tid det tar å lukke. Dermed vil en dypere visuell forståelse av aboral amputasjon prosessen, levert av denne protokollen, vil hjelpe videre undersøkelser i denne modellen regenerering system og utvide anvendelsen av denne iscenesettelsen systemet med Nematostella vectensis.
Bruk av Nematostella som en modell for sårheling og regenerering blir stadig mer populært. Derfor er det viktig å være i stand til å visualisere de morfologiske mønstre av en bestemt protokoll før effektive cellulære og molekylære analyser kan tildeles og sammenlignes. Nematostella har en høy grad av regenerativ "fleksibilitet", være i stand til å reformere nesten alle mangler struktur amputert på ethvert sted, på post-Planula stadier av livet. Dermed har ulike forskere undersø…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Grant til GHT.
Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
#5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |