Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En fluorescens-baserte analysen av fosfolipid Scramblase aktivitet

doi: 10.3791/54635 Published: September 20, 2016

Abstract

Scramblases translocate fosfolipider over membranen bilayer bidirectionally i en ATP-uavhengig måte. Den første scramblase å bli identifisert og biokjemisk bekreftet ble opsin, apoprotein av fotoreseptoren rhodopsin. Rhodopsin er et G-protein-koblet reseptor lokalisert i stang fotoreseptorlidelser skive membraner av netthinnen der den er ansvarlig for oppfatningen av lys. Rhodopsin er scramblase aktivitet ikke er avhengig av sin ligand 11- cis -retinal, dvs. at apoprotein opsin også aktiv som scramblase. Selv konstituerende og regulert fosfolipid scrambling spille en viktig rolle i cellefysiologi, har bare noen få fosfolipid scramblases blitt identifisert så langt foruten opsin. Her beskriver vi en fluorescens-basert analyse av opsin er scramblase aktivitet. Opsin rekonstitueres i store unilamellære liposomer sammensatt av phosphatidylcholine, fosfatidylglycerol og et spor mengde fluorescerende NBD-merket PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl) amino] heksanoyl} - sn -glycero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitet bestemmes ved å måle i hvilken grad NBD-PC-molekyler som befinner seg i den indre paknings av vesikkel er i stand til å få tilgang til det ytre paknings hvor deres fluorescens blir kjemisk fjernet ved et reduksjonsmiddel som ikke kan krysse membranen. Metodene vi beskriver ha generell anvendelighet og kan brukes til å identifisere og karakterisere scramblase aktivitetene til andre membranproteiner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den fotoreseptoren rhodopsin, en prototypisk G-protein-koblet reseptor (gjennomgått for eksempel i referanse 1), er den første fosfolipid scramblase å bli identifisert og bekreftet biokjemisk 2,3. Scramblases er fosfolipid transportører som øker egen langsomme transbilayer fosfolipid bevegelse til fysiologisk riktig nivå i en toveis, ATP-uavhengig måte 4-6. Eksempler på sine handlinger kan bli funnet i det endoplasmatiske retikulum og bakterie cytoplasmiske membran hvor konstitutiv scrambling er nødvendig for membran homeostase og vekst, så vel som for en rekke av glykosyleringsseter veier 5. Regulert fosfolipid scrambling er nødvendig for å eksponere fosfatidylserin (PS) på overflaten av apoptotiske celler hvor det fungerer som en "spise-me" -signal for makrofager 7 og gir et prokoagulerende overflate på aktiverte blodplater for å katalysere produksjonen av protein faktors behov for blodpropp. I fotoreseptorlidelser platemembraner, har rhodopsin s scrambling aktivitet blitt foreslått for å motvirke fosfolipidet ubalansen mellom de to membran brosjyrer av bilaget som er generert av den ATP-avhengige, ensrettet lipid flippase ABCA4 4,8,9 10-12.

Til tross for den fysiologiske betydningen av scramblases forble deres identitet unnvikende til rhodopsin ble rapportert som en scramblase i fotoreseptorlidelser plater 2, medlemmer av TMEM16 protein familien ble identifisert som Ca 2 + -avhengige scramblases trengs for PS eksponering på plasmamembranen (anmeldt i referanse 13), og den bakterielle protein FtsW ble foreslått som en Lipid II scramblase kreves for peptidoglykansyntesen 14. Disse funnene var basert på tilberedning av rensede proteiner i liposomer og demonstrasjon av scramblase aktivitet i de resulterende proteoliposomes bruk av metodikken described her. Andre potensielle scramblases 15-21 - de MurJ og AMJ proteiner involvert i peptidoglykan biosyntese, WzxE og relaterte proteiner involvert i scrambling O-antigen forløpere, MprF protein trengs for å translocate aminoacylert fosfatidylglycerol over bakteriell cytoplasmamembranen, og Xkr8 familiemedlemmer som har blitt foreslått å eksponere PS på overflaten av apoptotiske celler - gjenstår å bli testet biokjemisk. Dette understreker viktigheten av en robust analyse for å identifisere og karakterisere scramblase aktivitet.

Her beskriver vi tilberedning av renset opsin, den apoprotein av fotoreseptoren rhodopsin, i store unilamellære vesikler (LUV), og påfølgende analyse av scramblase aktivitet i de resulterende proteoliposomes med en fluorescens-basert analysen. Det finnes flere brønn beskrevne protokoller som er tilgjengelige i litteraturen for heterolog ekspresjon og rensing av opsin, derfor vil vi ikkebeskrive det i denne protokollen; vi bruker protokollene beskrevet i Goren et al. 3 som gir FLAG-merket, termostabile opsin på ca 100 ng / mL i 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

Rekonstituering er oppnådd ved å behandle LUV med tilstrekkelig vaskemiddel slik at de sveller, men ikke oppløses. Under disse betingelser, en membranprotein - tilføres i form av protein-vaskemiddel miceller - integreres inn i liposomene og bli rekonstituert i liposom-membranen ved fjerning av detergent, noe som resulterer i proteoliposomes. For å rekonstituere opsin (oppnådd som et renset protein i 0,1% (w / v) DDM), LUV er fremstilt fra en blanding av POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfokolin) og POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3- [fosfor-rac- (1-glycerol)]) og mettet med DDM før du legger opsin og NBD-PC. Vaskemiddelet blir deretter fjernet ved behandling av prøven med polystyrenkuler.

lass = "jove_content"> Prinsippet fluorescens-baserte analysen er vist i figur 1B. LUV er symmetrisk rekonstitueres med spormengder av NBD-PC eller en annen NBD-merket fluorescerende fosfolipid reporter (figur 1A). Ved tilsetning av ditionitt, er et membran-impermeant dianion, blir NBD-PC-molekylene i den ytre paknings av LUV gjort ikke-fluorescerende som nitrogruppen av NBD redusert til en ikke-fluoriserende amino-gruppe. Som verken NBD-PC-molekyler eller ditionitt er i stand til å krysse membranen på tidsskalaen for forsøket (<10 min), dette resulterer i 50% reduksjon av det fluorescerende signal. Men hvis liposomene er rekonstituert med en scramblase kan NBD-PC-molekylene i den indre paknings rykke hurtig til utsiden, hvor de er redusert. Dette resulterer i totalt tap av fluorescens i det ideelle tilfellet (figur 1C).

es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av scramblase aktivitetsanalysen Analysen benytter et fluorescerende NBD-merkede rapportør lipid; NBD-PC er vist (A). Store unilamellære vesikler er rekonstruert med en spormengde NBD-PC. Tilberedning produserer symmetriske vesikler, med NBD-PC fordelt likt i de ytre og indre brosjyrer. Ditionitt (S 2 O 4 2-) reduserer kjemisk nitrogruppen av NBD til en ikke-fluoriserende amino-gruppe. Behandling av proteinfrie liposomer med ditionitt (B, topp) forårsaker en 50% reduksjon av fluorescens, siden bare de NBD-PC-molekylene i den ytre paknings blir redusert: ditionitt er negativt ladet og kan ikke krysse membranen til å reagere med NBD-PC-molekyler i indre pakningsvedlegget. Dithionite behandling av opsin holdig proteoliposomes (B, nederst), dvs. scramblase-aktiv proteoliposomes, resulterer i 100% tap av fluorescence som opsin forenkler bevegelse av NBD-PC mellom den indre og den ytre pakningsvedlegget. (C) viser idealiserte fluorescens spor innhentet på å behandle proteinfrie liposomer og opsin holdig proteoliposomes med dithionite. Hastigheten av fluorescens tap er den samme i begge tilfeller som indikerer at den kjemiske reduksjonen av NBD av ditionitt er hastighetsbegrensende, og at scrambling skjer med en hastighet lik eller større enn hastigheten av den kjemiske reaksjon. Spor hentet fra en faktisk eksperiment er vist i figur 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Metodene vi beskrive kan brukes til å rekonstituere og analysere andre rensede proteiner, så vel som blandinger av membranproteiner som oppnås, for eksempel ved ekstrahering med mikrosomer vaskemiddel 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Utarbeidelse av liposomer og Proteoliposomes

  1. liposomdannelse
    1. Ved hjelp av en glassprøyte, tilsett 1435 mL POPC (25 mg / ml, i kloroform) og 160 ul POPG (25 mg / ml, i kloroform) til en rundbunnet kolbe for å oppnå 52,5 umol lipider i et molforhold på POPC: POPG = 9: 1.
    2. Tørk lipidene i 30 minutter ved anvendelse av en rotasjonsfordamper ved en rotasjonshastighet på 145 rpm (ingen vannbad er nødvendig for dette volum av oppløsningsmiddel), og deretter overføre kolben til en vakuumeksikator i minst 3 timer eller over natten, ved romtemperatur (RT).
    3. Hydrat den tørkede lipidfilmen med 10 ml av 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (heretter henvist til som buffer A) ved å forsiktig virvling av kolben inntil en homogen, grumset suspensjons resultater;
      MERK: lipid-konsentrasjon på dette stadiet er forventet å være 5,25 mM som uten tap skulle ha forekommet hittil.
    4. Sonikere suspensjon i et vannbad i 10 minutter ved romtemperatur med en frekvens of 40 kHz. Løsningen vil se noe klarere.
    5. Ved hjelp av en ekstruder, passerer suspensjonen 10 ganger gjennom en membran med en 400 nm porestørrelse, etterfulgt av en andre syklus av ekstrusjon med 4 passerer gjennom en membran med en 200 nm porestørrelse.
      NB: Den midlere diameter av de resulterende LUV er ~ 175 nm. Om nødvendig, kan størrelsen og homogenitet av LUV sjekkes av dynamisk lysspredning i henhold til produsentens instruksjoner.
    6. Kvantifisere fosfolipid konsentrasjonen av LUV suspensjon som beskrevet i kapittel 1.2).
      MERK: På grunn av tap i ekstrudering, er konsentrasjonen vanligvis rundt 3,6 mm.
    7. Oppbevar LUV ved 4 ° C i ca 2 uker hvis det ikke brukes umiddelbart.
  2. fosfolipid Kvantifisering
    NB: For å bestemme fosfolipid konsentrasjonen av LUV suspensjonen anvendt til rekonstituering, så vel som av de proteoliposomes som til slutt blir generert, er en aliquot av prøven Subjected til oksidasjon av perklorsyre. Denne fremgangsmåten bryter ned fosfolipider for å frigjøre uorganisk fosfat som deretter kvantifisert ved en kolorimetrisk analyse i sammenligning med standarder 23.
    1. Fremstille en 40 mM forrådsoppløsning av natriumfosfat (Na 2 HPO 4) i avionisert destillert vann.
    2. Fortynne stamløsning med avionisert destillert vann for å oppnå 4 mm og 0,4 mm Arbeids løsninger som vil tjene som kalibreringsstandarder.
    3. Ved hjelp av arbeidsløsninger, fremstille standarder i 13 x 100 mm 2 glassrør som strekker seg fra 0 til 80 nmol natriumfosfat i et sluttvolum på 50 pl.
    4. Ta 10 mL hver av LUV og proteoliposome prøver som skal kvantifiseres og fortynnet med 40 ul DDH 2 O i 13 x 100 mm 2 glassrør.
      MERK: Som lipidkonsentrasjon av LUV og proteoliposomes er i størrelsesorden 2,5-5 pM, 10 ul prøve bør inneholde 25-50 nmol lipid fosfor.
    5. Tilsett 300 ul perklorsyre til hver av de standarder og prøver og varme i 1 time ved 145 ° C i en varmeblokk. Sette kulene på rørene for å forhindre fordampning.
    6. La rørene avkjøles til romtemperatur og tilsett 1 ml DDH 2 O.
    7. Tilsett 400 ul hver av nyfremstilt 12 g / l ammoniummolybdat og 50 g / l natrium-askorbat og vortex å blande.
    8. Varme i 10 minutter ved 100 ° C med kulene på toppen av rørene. Fjerne rørene fra varmeblokken og la dem avkjøle til romtemperatur.
    9. Mål absorbansen av prøvene mot emnets (standardprøve inneholdende 0 nmol natriumfosfat) med et spektrometer ved en bølgelengde på 797 nm.
    10. Bestem fosfatinnholdet i prøvene mot kalibreringsstandardkurve.
  3. Tilberedning av opsin
    Merk: Det er nødvendig å fastsette optimale betingelser for svelling rekonstituering som disse er avhengig av arten av vaskemiddel, så velsom lipid sammensetning og konsentrasjon av LUV. Som LUV endre sine lysspredningsegenskaper på hevelse prosessen kan overvåkes ved å måle absorbans (figur 2) som vurderes av Rigaud og Levy 24 og Geertsma et al. 25.
    1. Pipetter 800 mL av LUV (fra avsnitt 1.1, som lipid gjenoppretting etter ekstrudering er 70%, den forventede konsentrasjonen av LUV er 3,6 mm fosfolipid) i et 2 ml mikrosentrifugerør.
    2. Legg 5.3 ul av buffer A og 34,7 pl 10% (vekt / volum) DDM oppløst i buffer A.
    3. Inkuberes i 3 timer ved romtemperatur med ende-over-end blanding.
    4. I mellomtiden forberede polystyrenkuler:
      1. Bruke 400 mg perler per prøve og veie dem ut i et glassbeger.
      2. Vasker dem to ganger med metanol, tre ganger med vann og en gang med buffer A. For hvert vasketrinn bruk 5 ml flytende og omrør langsomt i 10 minutter.
        MERK: Det anbefales å forberede polystyrenperler for flere prøver på en gang, for eksempel, veier i 6 g av perler og vask med 75 ml væske. Overskytende perler kan lagres i et kjøleskap i flere dager.
    5. I løpet av de siste 30 min vesikkel destabilisering tørke NBD-merkede fosfolipid i en skrukork glassrør ( 'rekonstituering glassrør'): Per prøven, 9,5 ul av NBD-PC (1 mg / ml i kloroform, noe som ga 0,4 mol% av totale fosfolipider) ble tørket under en strøm av nitrogen i et glassrør og deretter oppløst i 45 ul 0,1% (w / v) DDM i buffer A.
    6. Etter 3 timer av vesikkel destabilisering legge den oppløste-NBD-merkede fosfolipid, DDM-solubiliserte protein og buffer A slik at sluttvolum på 1 ml inneholder 0,36% (vekt / volum), dvs. 7 mM, DDM.
      1. Derfor, for å generere proteinfrie liposomer (anvendt som en kontrollprøve) tilsett 45 pl av NBD-PC (oppløst i 0,1% DDM), 60 ul 0,1% DDM og 55 ul av buffer A; for proteoliposomes legge til, for eksamenpel 40 ul protein (fra en typisk stamløsning av ~ 110 ng / ul) i 0,1% DDM, 45 ul av NBD-PC (oppløst i 0,1% DDM), 20 ul 0,1% DDM og 55 ul buffer A .
        MERK: Rekkefølgen av tillegg bør som er oppført.
    7. Bland prøven for ytterligere time ende-over-ende ved romtemperatur.
    8. Legg 80 mg av de fremstilte polystyrenkuler og inkuberes prøven med ende-over-end blanding i 1 time ved RT.
    9. Deretter tilsettes ytterligere 160 mg av polystyrenkuler og inkuber med ende-over-end blanding i ytterligere 2 timer ved RT.
    10. Overfør prøven (forlater de brukte polystyrenkuler bak) til et glass med skrukork inneholdende 160 mg av friske polystyrenkuler og blandes over natten ved 4 ° C.
      NB: Den enkleste måte å overføre prøven og unngå å suge opp perlene er å bruke en Pasteur pipette som er skjøvet til bunnen av glassrøret med et lite positivt trykk. Når spissen av pipetten er fast vedbunnen av røret, og prøven kan trekkes lett uten innblanding fra kulene.
    11. Den neste morgen, overføre prøven til et mikrosentrifugerør uten bærer over perler og legg på is i forberedelse for den scramblase aktivitetsanalysen.

2. Scramblase aktivitetsanalyse

MERK: Fluorescensintensiteten av liposomer eller proteoliposomes fortynnet med buffer A blir overvåket over tid ved tilsetning av ditionitt i en fluorescens-spektrometer. For å oppnå en stabil utgangsintensitet, blir fluorescens registreres i minst 50 sek (eller inntil et stabilt signal er oppnådd) før tilsetning av ditionitt til en konstant omrørt prøven og deretter fulgt opp i minst 500 sekunder etter tilsetning av ditionitt.

  1. Legg 1,950 mL buffer A til en plastkuvette inneholder en mini rørestav.
  2. Tilsett 50 pl av den preparerte Proteo (liposomer) og la prøven likevekt i fluorescens spektrometer under konstant omrøring i flere sekunder.
  3. I mellomtiden tilberede en oppløsning av 1 M ditionitt i 0,5 M ikke-bufret Tris (dvs. for to prøver veie ut 20 mg av ditionitt i et mikrosentrifugerør og oppløses i 114 mL iskald 0,5 M Tris rett før bruk og holde på is for den neste prøve).
    MERK: dithionite løsningen må være forberedt fersk og bør ikke brukes mer enn 20 minutter etter tilberedning; dersom mange målinger skal gjøres, kan alikvoter av ditionitt skal veies ut på forhånd, og oppløst rett før bruk.
  4. Start fluorescens overvåking (eksitasjon 470 nm, emisjon 530 nm, slissebredden 0,5 nm).
  5. Legg 40 mL av 1 M ditionitt oppløsning til kuvetten 50 sekunder etter oppstarting av fluorescens-opptak (bruke septum i lokket på kyvetten kammer hvis mulig) og fortsette å registrere fluorescens for en ytterligere 400-600 sek.
  6. Analysere dataene som beskrevet i kapittel 3.

3.Dataanalyse

  1. Kinetikk Scrambling
    1. Karakterisere fluorescens spor for hver prøve oppnådd ved scramblase aktivitetsanalysen ved å definere den første fluorescens, F i, før tilsetning av ditionitt, og endepunktet fluorescens, F, nås etter> 400 sek. F i er bestemt for hver prøve som middelverdi av fluorescens på 30 sek periode før tilsetning av ditionitt.
    2. Bestemme endepunktsdata som svarer til omfanget av fluorescens reduksjon, R = 100 • F / F i. Vi bruker det gjelder R-L for proteinfrie liposomer og R P for opsin holdig proteoliposomes.
  2. Bestemme Molekylvekt av Funksjonelt Rekonstituert Scramblase
    1. Konvertere fluorescens reduksjon data i henhold til følgende ligning:
      p (≥1 scramblase) = (R P - R l) / (Rmaks - R L) (ligning 1)
      NOTAT: Hvor R max er den maksimale reduksjon som oppnås når tilstrekkelig protein blir rekonstituert slik at alle vesikler i prøven ha minst en funksjonell scramblase, og p er sannsynligheten for at en spesiell vesikkel i et rekonstituert prøve blir 'scramblase aktive' det vil si, besitter det minste en funksjonell scramblase. Verdien for R-L er typisk 45% 3, mens R max er typisk 82,5% 3, i stedet for den forventede 100% (R max kan bestemmes eksperimentelt for opsin proteoliposomes med en PPR> 1 mg / mmol). Som R max <100% antas det at en sub-populasjon av vesikler er refraktære til rekonstituering. For R max = 82,5%, brøkdel av vesikler som er ute av stand til å akseptere protein er 0.35.
    2. Beskrive forholdet mellom p (≥1 scramblase) og PPR (mg protein / mmol fosfolipid) ved Poisson statistikk som følger:
      p (≥1 scramblase) = 1 - e MERK: hvor m = antall scramblases pr vesikkel og α = mono-eksponensiell tilpasning konstant i enheter på mg protein / mmol fosfolipid.
    3. Som en brøkdel av vesiklene ikke bidrar til scrambling selv ved høy PPR (se diskusjon), modifisere ligningen til:
      p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (ligning 3)
      MERK: Hvor PPR * = PPR / (1-f), hvor f er den ildfaste populasjon av vesikler eller, i dette tilfellet, PPR * = PPR / 0,65 (ligning 4).
      MERK: fit konstant α bestemmes ved å montere en graf av p (≥1 scramblase) versus PPR * med en mono-eksponentiell funksjon. Hvis opsin (molekylvekt 41,7 kDa) funksjonelt rekonstruerer inn i 175-nm-diameter vesikler (hver blære har 280000 fosfolipider 26) som en monomer, a = 0,187 mg mmol -1. Hvis opsin dimerizes før rekonstituering 3 for å gi scramblase aktivt vesikler, deretter α= 0,37 mg mmol -1. Hvis PPR snarere enn PPR * skulle benyttes for analysen, da de tilsvarende a-verdier ville være 0,122 og 0,244 mg mmol -1. De anslåtte verdier for α anta at alle opsin molekyler er funksjonelt kompetent. Hvis bare en del av molekylene er i stand til å rykke ut lipider, da de tilsvarende verdier av α vil bli større.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi beskriver tilberedning av opsin inn LUV å karakterisere sin scramblase aktivitet ved hjelp av en fluorescens-basert analysen. Vi analysere resultatene for å sette en nedre grense for frekvensen av opsin-mediert fosfolipid scrambling og for å bestemme den oligomere tilstand i hvilken opsin funksjonelt rekonstruerer inn i vesiklene.

For å identifisere optimale omdanningsbetingelser, er det nødvendig å bestemme empirisk mengden av vaskemiddel som skal benyttes for å svelle LUV slik at de er mottagelige for protein innsetting. Et slikt eksperiment er vist i figur 2A. Aliquoter av POPC: POPG LUV er behandlet med forskjellige mengder av DDM i 3 timer og absorbansen til prøven måles ved 540 nm, et mål for turbiditet og derfor av vesikkel størrelse. Den optiske tetthet måles ved 540 nm (OD 540) Grafen viser at vesiklene som sveller DDM konsentrasjonerasjon er økt fra 4-6 mm, nå et metningspunkt på rundt 7 mm før du begynner å oppløse (tilsvarende tap av turbiditet og OD 540 signal) som DDM økes ytterligere. NBD-PC tilsettes etter detergentbehandling, og prøvene blir inkubert i ytterligere en time før den ble behandlet med polystyrenkuler for å fjerne detergent. Den transbilayer distribusjon av NBD-PC bestemmes ved å måle fluorescens tap etter å ha lagt dithionite til vesikler (som beskrevet ovenfor). Dermed setter NBD-PC til den ytre pakningsvedlegget av vesikler i fravær av vaskemiddel, angitt med sin komplette tilgjengelighet til dithionite. For vesikler ble behandlet med> 2 mM DDM, NBD-PC er i stand til å fordele symmetrisk til begge brosjyrer, slik at når DDM er fjernet 50% av NBD-PC er beskyttet fra ditionitt.

Figur 2B viser en lignende destabilisering-tilberedning eksperiment (tegnes på nytt fra referanse 2 </ Sup>), denne gang sporing tilberedning av opsin. I dette eksperimentet kan det sees at 7 mM DDM er nødvendig for opsin rekonstituering slik at NBD-PC blir kvantitativt (> 80%) tilgjengelig for ditionitt som et resultat av opsin-mediert scrambling.

Figur 2
Figur 2:. Rekonstituering av NBD-PC og opsin inn i vaske destabilisert vesikler (A) Aliquoter av vesiklene blir behandlet med en rekke detergentkonsentrasjoner (0-9 mm) ved å blande ende-over-ende i 3 timer ved romtemperatur . Ved slutten av inkuberingsperioden ble absorbansen av prøvene ved 540 nm blir målt (sort linje). NBD-PC (oppløst i 0,1% w / v DDM) blir deretter tilsatt, og prøven inkuberes i ytterligere 1 time ved romtemperatur før detergenten fjernes ved behandling polystyren-kuler. De resulterende liposomene blir analysert av fluor escent reduksjon analysen (rød linje) for å bestemme i hvilken grad NBD-PC-en er symmetrisk rekonstruert. (B) Som i (A), men i dette eksperimentet vesikler dannet av eggfosfolipider (egg PC / egg fosfatidinsyre, 9: 1 mol / mol) ble destabilisert med DDM, og opsin ble tilsatt sammen med NBD-PC, noe som resulterer i en fluorescens reduksjon på omtrent 80% når proteinet er effektivt rekonstitueres og i stand til å legge til rette for scrambling av NBD-PC (modifisert fra referanse 2). Selv NBD-PC ble symmetrisk rekonstruert ved 2 mM DDM, ble det ideelle forhold for rekonstituering opsin valgt rundt toppen av OD 540 absorbans, dvs. det punktet hvor vesikler var svært hoven på grunn av Pilgrim vaskemiddel, men ennå ikke oppløst (angitt med pil). For POPC / POPG (9: 1 mol / mol) vesikler, en DDM konsentrasjon på 8 mm ble funnet å være optimal for begge NBD-PC og opsin rekonstituering./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Omfanget av fluorescens reduksjon øker med mengden av opsin anvendt til rekonstituering. Figur 3A viser fluorescens spor innhentet på å legge dithionite til NBD-PC-holdige proteinfrie liposomer (svart kurve) og proteoliposomes rekonstituert med opsin på ulike protein til fosfolipid forhold (PPR, i enheter av mg protein per mmol fosfolipid, røde spor); sporene er normalisert slik at de alle har samme innledende fluorescens (F i) verdi for lettere visualisering. Monoeksponensiell anfall av trasene indikere meget like tidskonstanter, som strekker seg 20 til 25 sekunder; som frekvensen av ditionitt-mediert NBD-PC reduksjon i proteinfrie liposomer er den samme som i de proteoliposomes, er det bare mulig å plassere et lavere anslag på forekomsten av opsin-mediert scrambling (se text for flere detaljer). Figur 3B viser de analyserte data innhentet fra fluorescens reduksjonsanalyser for å gi plott av p (≥1) scramblase (sannsynligheten for en vesikkel med minst en scramblase) versus den eksperimentelt målte PPR (relatert til PPR * som omtalt ovenfor). Sammenligning av monoeksponensiell tilpasning av de eksperimentelle resultatene i hypotetiske passer tilsvarer opsin blir rekonstruert som en monomer, dimer eller tetramer viser at opsin rekonstruerer funksjonelt som en dimer.

Figur 3
Fig. 3: Scramblase aktivitet av opsin (A) Fluorescens traser tilsvarende ditionitt behandling av vesikler rekonstituert med NBD-PC og opsin mengder som varierer mellom 0 til 4,95 ug, angitt med kilen. Den laveste mengde av opsin rekonstituert tilsvarer en PPR-rute på 0,21 mg / mmol, detnest høyeste beløpet til 0,43 mg / mmol, og det høyeste beløpet til 1,3 mg / mmol, eller 10 opsins per vesikkel i gjennomsnitt. Ditionitt ble tilsatt ved den angitte tid (pil) og NBD fluorescens ble overvåket i en ytterligere 400 sek. Den maksimale grad av fluorescens reduksjon sett i dette forsøket var 85%, mens gjennomsnittet for mange eksperimenter er 82,5%. (B) Protein avhengighet av scrambling. Data fra eksperimenter tilsvarende til panel A, ble analysert ved hjelp av Poisson-statistikk for å generere en graf av sannsynligheten for vesikler som har minst en scramblase (p ≥1 scramblase) mot proteinet til fosfolipid-forhold (PPR) av vesiklene (protein ble kvantifisert etter rekonstituering ved Western blot-analyse 3 og fosfolipid ble bestemt ved måling av uorganisk fosfat frigjøres ved syrehydrolyse). Den røde linjen representerer en mono-eksponentiell fit for dataene; de stiplede grå linjene representerer mono-eksponentiell passer for tilberedning av opsin til 170 nm-diameter vesicles som monomerer, pre-dannet dimerer eller pre-formet tetramers. Som x-aksen representerer den eksperimentelt målte PPR (i stedet for PPR (se hovedteksten)), de passer konstanter tilsvarer PPR heller enn PPR * verdier, som omtalt i hovedteksten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den scramblase aktivitetsanalyse gjort oss i opprinnelig å fastslå at opsin har fosfolipid scramblase aktivitet 2. Analysen har også tillatt oss å karakterisere opsin s scramblase virksomhet ved å teste spesifisiteten (vi brukte en rekke NBD-merkede rapportør lipider så som NBD-fosfatidyletanolamin, merket med NBD på en acylkjede som er vist for NBD-PC i figur 1A, eller på hodegruppe, NBD-sphingomyelin eller NBD- fosfatidylserin 2), effekten av vesikkel lipid sammensetning (f.eks kolesterol ved ulike mengder som vesikkel bestanddel), og hvorvidt de ulike konforme statene opsin og rhodopsin alle utstillings scramblase aktivitet. Disse analysene viser at rhodopsin er scramblase aktivitet er svært rask (> 10.000 fosfolipider pr sek), ikke-spesifikk for fosfolipid og uavhengig av rhodopsin er conformational tilstand eller om den inneholder sin kromofor retinal 2,3. Her,vi presentert en detaljert metode for å generere proteoliposomes inneholder opsin og viste hvordan å analysere disse forberedelsene til fosfolipid scramblase aktivitet.

Den beskrevne rekonstituering protokollen er optimalisert for den gitte lipidsammensetning og til rekonstituering opsin etter at det var renset ved affinitets-kromatografi ved anvendelse av DDM som oppløsningsmiddel. Av lipid-sammensetningen, så vel som vaskemidlet kan endres i henhold til behovene til experimenter, selv om de ideelle omdanningsforhold for endrede betingelser måtte bestemmes ved å utføre de "hevelse-eksperiment" beskrevet i figur 2. DDM er empirisk velegnet for å opprettholde opsin i stabil og aktiv tilstand. Imidlertid kan andre detergenter så som oktyl-β-glukosid, CHAPS eller Triton X-100 brukes etter lignende protokoller. Triton X-100 er et mye brukt vaskemiddel for å rekonstituere ATP-bindende kassett transportører (ABC transportører) som sin effektiv vNCY i formidling membran rekonstituering er høyere enn for andre vaskemidler og det tar også mindre tid til å stabilisere seg med prefabrikerte liposomer 24.

Det er mulig å bestemme den oligomere tilstand av funksjonelt rekonstituert opsin om omfanget av fluorescerende reduksjon blir oppnådd for prøver rekonstituert med forskjellige mengder av opsin, dvs. over et område av protein til fosfolipid-forhold (PPR-ruter). For å kunne gjøre dette, må den PPR av de rekonstituerte vesiklene være eksplisitt målt som gjenoppretting av protein og fosfolipid kan variere. Fosfolipid utvinning kan bli bestemt av fosfat-analysen beskrevet i avsnitt 1.2, mens proteingjenvinning kan estimeres ved hjelp av kvantitativ Western Blot analyse der de rensede proteiner som brukes for reconstitutions brukes til å generere en kalibreringskurve som gjør forhold til utvinning av rekonstituerte prøver på tvers den PPR område testes (som forklart i detalj i referanse 3).

Den scramblase aktivitetsanalyse er bygget på en forutsetning om at dithionite ikke trenge inn i vesikler. Dette punktet kan verifiseres ved å fange et oppløselig NBD-merkede rapportør i vesiklene, og bestemmelse av hvorvidt det kan reduseres med ditionitt. For dette formål er NBD-glukose (12,6 mM tilsettes etter vesikkel destabilisering) benyttet i stedet for NBD-PC. Dette vannoppløselige molekyl er fanget innenfor proteoliposomes når vesiklene er forseglet, og bør derfor være beskyttet mot ditionitt. For å gjøre det NBD-glukose fullt tilgjengelig for reduksjon, kan Triton X-100 tilsettes (1% w / v), som deretter resulterer i 100% reduksjon 3,27.

De proteoliposomes kan være preget for å verifisere at rekonstituering av både reporter lipid og protein er symmetrisk. Førstnevnte oppnås ved collisional slukkeforsøk ved bruk av jodidioner, mens den sistnevnte er basert på en protease beskyttelse strategi ved hjelp av protease som AspNkutter på et bestemt område i nærheten av C-terminalen av opsin tre.

Overgangen fra den første fluorescens (F i) bestemmes i den scramblase aktivitetsanalysen til endepunktet fluorescens (F) er sammensatt, men for vårt formål det med rimelighet kan tilnærmes ved hjelp av en enkelt eksponentiell desintegrasjonsfunksjon. Tidskonstanten er forbundet med eksponentiell (20 sek) er omtrent den samme for inaktive og aktive liposomer, opsin holdige proteoliposomes indikerer at scrambling skjer så raskt eller raskere enn raten ved hvilken NBD fluoroforen er redusert med ditionitt. Dermed scramblase aktivitetsanalysen har en dårlig tidsoppløsning (begrenset av dithionite reduksjon kjemi) som foreløpig bare tillater klassifisering av mutanter til aktiv, veldig treg eller inaktive. Denne klassifiseringen kan bli sett for kalsium-regulert scramblase TMEM16 27: ved høye Ca 2+ nivåer, avslørte fluorescens forfallet en tidskonstant lik that sett i proteinfrie liposomer, noe som indikerer at det hastighetsbegrensende trinnet er den kjemiske reduksjon av NBD-fluoroforen av ditionitt enn lipid scrambling. Tvert imot, ved lave Ca 2 + nivåer den stabile tilstand av fluorescerende reduksjon ikke ble nådd etter 900 sekunder, noe som gjør det mulig å skille mellom to kinetiske komponenter, en tilordnet til ditionitt-reduksjon av den ytre paknings og den langsommere en til eksponeringen av indre-heftet NBD-lipider på utsiden.

Avviket mellom den forutsagte 100% tap av fluorescens på ditionitt behandling av vesikler fremstilt med høy PPR (figur 1C) i forhold til den eksperimentelle virkeligheten hvor det er vanskelig å overskride ~ 85% reduksjon (figur 3A) tyder på at en fraksjon av vesiklene er ildfast rekonstituering. Denne fraksjon kunne tilsvare blemmer som tetter tidlig under omdanningsprosedyren som vaskemiddel er adsorbert til polystyrenkuler og erderfor ikke lenger i stand til å motta proteinet. For analysen beskrevet i kapittel 3, antok vi at dette ildfast befolkning tilsvarer en brøkdel f av de totale blemmer. Hvis vi antar at halvparten av NBD-PC-molekyler (pool av NBD-PC i den ytre pakningsvedlegget) i de ildfaste vesikler er tilgjengelig for dithionite reduksjon, så vi regner med f = 2 • (1 - R max / 100), eller 0,35 når R max = 82,5%.

Montering av p (≥1 scramblase) versus PPR * data med et mono-eksponentiell ligning gir tilpasning konstant α, hvorfra det er mulig å bestemme hvorvidt opsin rekonstruerer funksjonelt som en monomer eller dimer, eller en blanding av tilstander inkludert høyere ordens multimerer . Tolkningen av disse resultater blir komplisert hvis en brøkdel av opsin molekyler ikke kan fungere i scrambling. Selv om dette er usannsynlig gitt de forholdene som opsin blir renset som garanterer at den beholder alle sine G proteinreseptor aktiviteter, en verdi på α tilsvarende den funksjonelle innsetting av dimerer kan også tolkes som den funksjonelle innsetting av monomerer fra et preparat av opsin hvor halvparten av proteinene er inaktive som scramblases. En ekstra punkt å vurdere er at analysen som vi presenterer forutsetter at vesikler brukes til rekonstituering er homogene i størrelse. I virkeligheten vesiklene har en rekke diametre er kjennetegnet ved en Gaussisk fordeling med et standardavvik som svarer til omtrent en tredjedel av den midlere diameter. Heldigvis er resultatet av analysen av p (≥1 scramblase) versus PPR * data ikke signifikant påvirket av behandlingen av vesikkel heterogenitet og så enkel analyse at vi presentert er tilstrekkelig for å beskrive dataene.

En potensiell begrensning av metodene som vi beskrevet er at arbeidskrevende prosedyre ikke tillater high-throughput målinger av et meget høyt antall sampler ennd som vesikkel heterogenitet kan forstyrre avlesning. Det første problemet kan overvinnes ved anvendelse av en mikrotiter-plateformat for den scramblase analysen; den andre kan løses i fremtiden ved enkelt vesikkel analyser ved anvendelse TIRF mikroskopi.

Den ditionitt undersøkelse for å måle scramblase aktivitet kan betraktes som meget pålitelig og robust når destabiliserende og blandingsprosedyrer er etablert. En alternativ metode for å kvantifisere transmembrane transport av fosfolipider, som også gjør det mulig å verifisere resultatene som oppnås ved ditionitt-analysen, er tilbake-ekstraksjon av kortkjedede NBD-lipider fra den ytre paknings av vesiklene ved hjelp av fettsyrefritt bovint serumalbumin 22. Tilbake-ekstraksjon, så vel som ditionitt analysen er også blitt anvendt for å karakterisere og identifisere flippases av P4-type ATPaser og ABC-transportører 28-33.

Som de verktøyene som presenteres her kan enkelt tilpasses etter different trenger de beskrevne prosedyrer er allsidig og vil bidra til å identifisere og karakterisere fosfolipid scramblases i fremtiden. Læring identiteten til mange av disse, blant annet fra scramblase nødvendig for utvidelse av biogene membraner under cellevekst er av største fysiologiske betydning.

For mer informasjon og detaljert beskrivelse av dataanalyse, blir leserne referert til tidligere publikasjoner fra vårt laboratorium 2-4,27 samt andre 22,25,28,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
  2. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
  3. Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
  4. Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. (2015).
  5. Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
  6. Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
  7. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
  8. Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
  9. Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
  10. Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
  11. Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51, (2010), 247-261 (2010).
  12. Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
  13. Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
  14. Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
  15. Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
  16. Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
  17. Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
  18. Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
  19. Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
  20. Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
  21. Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80, (2), 290-299 (2011).
  22. Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
  23. Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
  24. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  25. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
  26. Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
  27. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
  28. Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
  29. Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
  30. Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
  31. Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
  32. Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
  33. Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
En fluorescens-baserte analysen av fosfolipid Scramblase aktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter