Phospholipid Scramblase गतिविधि का एक प्रतिदीप्ति आधारित परख
Summary
We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.
Abstract
Scramblases bidirectionally एक एटीपी स्वतंत्र ढंग से झिल्ली bilayer भर फॉस्फोलिपिड सरकाना। पहले scramblase पहचान की है और biochemically सत्यापित opsin किया गया था, फोटोरिसेप्टर rhodopsin की apoprotein किया जाना है। Rhodopsin एक जी प्रोटीन युग्मित रेटिना जहां यह प्रकाश की धारणा के लिए जिम्मेदार है की रॉड फोटोरिसेप्टर डिस्क झिल्ली में स्थानीय रिसेप्टर है। Rhodopsin के scramblase गतिविधि अपने ligand 11 सीआईएस -retinal, यानी पर निर्भर नहीं करता है, apoprotein opsin भी एक scramblase के रूप में सक्रिय है। विधान और विनियमित फॉस्फोलिपिड पांव मार सेल शरीर क्रिया विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभानी है, केवल कुछ ही फॉस्फोलिपिड scramblases अब तक opsin इसके अलावा पहचान की गई है। यहाँ हम opsin के scramblase गतिविधि का एक प्रतिदीप्ति आधारित परख का वर्णन है। Opsin बड़े unilamellar phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol और फ्लोरोसेंट NBD लेबल पीसी (1-पी के एक ट्रेस मात्रा से बना liposomes में पुनर्गठन किया गया हैalmitoyl-2- {6 [7-नाइट्रो-2-1,3-benzoxadiazole-4-YL) अमीनो] hexanoyl} – एस.एन. -glycero-3-phosphocholine)। Scramblase गतिविधि किस हद तक NBD-पीसी पुटिका के भीतरी पत्रक में स्थित अणुओं बाहरी पत्रक जहां उनके प्रतिदीप्ति रासायनिक एक एजेंट को कम करने कि झिल्ली को पार नहीं कर सकता से सफाया कर दिया है का उपयोग करने में सक्षम हैं मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। हम तरीकों का वर्णन सामान्य प्रयोज्यता है और पहचान और अन्य झिल्ली प्रोटीन की scramblase गतिविधियों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
फोटोरिसेप्टर rhodopsin, एक प्रोटोटाइप जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (संदर्भ 1 में उदाहरण के लिए समीक्षा), पहली फॉस्फोलिपिड scramblase पहचाना जा रहा है और biochemically 2,3 सत्यापित। Scramblases फॉस्फोलिपिड ट्रांसपोर्टरों कि transbilayer फॉस्फोलिपिड आंदोलन की आंतरिक रूप से धीमी दर में वृद्धि कर रहे हैं एक द्विदिश में physiologically उचित स्तर तक, एटीपी स्वतंत्र ढंग 4-6। उनके कार्यों के उदाहरण जालिका और बैक्टीरियल cytoplasmic झिल्ली जहां विधान पांव मार झिल्ली homeostasis और विकास के लिए आवश्यक है, साथ ही ग्लाइकोसिलेशन रास्ते 5 की एक किस्म के लिए में पाया जा सकता है। विनियमित फॉस्फोलिपिड पांव मार apoptotic कोशिकाओं की सतह पर phosphatidylserine (पी एस) को बेनकाब करने की जरूरत है, जहां यह रूप में कार्य करता एक "खाने-मुझे" मैक्रोफेज 7 के लिए -signal और प्रोटीन कारक के उत्पादन को उत्प्रेरित करने के लिए सक्रिय ब्लड प्लेटलेट्स पर एक प्रोकोगुलैंट सतह प्रदान करता हैरक्त के थक्के के लिए आवश्यक रहा है। फोटोरिसेप्टर डिस्क झिल्ली में, rhodopsin के पांव मार गतिविधि bilayer कि एटीपी निर्भर, दिशाहीन लिपिड द्वारा उत्पन्न होता है की दो झिल्ली पत्रक के बीच असंतुलन फॉस्फोलिपिड प्रतिक्रिया करने के लिए सुझाव दिया गया है ABCA4 4,8,9 10-12 flippase।
Scramblases के शारीरिक महत्व के बावजूद, उनकी पहचान मायावी बना रहा जब तक rhodopsin फोटोरिसेप्टर डिस्क में एक scramblase 2, TMEM16 प्रोटीन परिवार के सदस्यों सीए के रूप में पहचान की गई 2 + निर्भर प्लाज्मा झिल्ली में पी एस जोखिम के लिए आवश्यक scramblases (संदर्भ में समीक्षा के रूप में सूचित किया गया था 13), और के रूप में एक लिपिड द्वितीय पेप्टीडॉग्लीकैन संश्लेषण के लिए आवश्यक 14 scramblase बैक्टीरियल प्रोटीन FtsW प्रस्तावित किया गया था। इन खोजों कार्यप्रणाली describ का उपयोग कर liposomes में शुद्ध प्रोटीन के पुनर्गठन और जिसके परिणामस्वरूप proteoliposomes में scramblase गतिविधि के प्रदर्शन के आधार पर किया गयायहाँ एड। अन्य संभावित scramblases 15-21 – MurJ और AMJ प्रोटीन पेप्टीडॉग्लीकैन biosynthesis में फंसा, WzxE और संबंधित प्रोटीन हे प्रतिजन व्यापारियों पांव मार में फंसा, एमपीआरएफ प्रोटीन बैक्टीरिया cytoplasmic झिल्ली भर aminoacylated phosphatidylglycerol सरकाना की जरूरत है, और Xkr8 परिवार के सदस्यों को प्रस्तावित किया गया है कि apoptotic कोशिकाओं की सतह पर पी एस बेनकाब करने के लिए – biochemically परीक्षण किया जा रह है। यह एक मजबूत परख के महत्व की पहचान करने और scramblase गतिविधि को चिह्नित करने के लिए प्रकाश डाला गया।
यहाँ, हम एक प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग जिसके परिणामस्वरूप proteoliposomes में शुद्ध opsin के पुनर्गठन, फोटोरिसेप्टर rhodopsin की apoprotein, बड़े unilamellar पुटिकाओं (LUVs) में, और scramblase गतिविधि के बाद के विश्लेषण का वर्णन है। वहाँ कई अच्छी तरह से वर्णित heterologous अभिव्यक्ति और opsin की शुद्धि के लिए साहित्य में उपलब्ध प्रोटोकॉल रहे हैं, इसलिए हम नहीं करेंगेइस प्रोटोकॉल में यह वर्णन; हम प्रोटोकॉल Goren एट अल। 3 में वर्णित के बारे में जो 100 एनजी पर झंडा टैग, थर्मास्टाइबल opsin पैदावार का उपयोग / 0.1% में μl (डब्ल्यू / वी) dodecylmaltoside (DDM)।
पुनर्गठन के लिए पर्याप्त साबुन के साथ LUVs के इलाज के लिए इतना है कि वे प्रफुल्लित लेकिन भंग नहीं है के द्वारा हासिल की है। इन शर्तों के तहत, एक झिल्ली प्रोटीन – प्रोटीन डिटर्जेंट micelles के रूप में आपूर्ति – liposomes में एकीकृत जाएगा और डिटर्जेंट हटाने पर liposome झिल्ली में पुनर्गठित हो जाते हैं, proteoliposomes में जिसके परिणामस्वरूप। (0.1% (w / v) DDM में एक शुद्ध प्रोटीन के रूप में प्राप्त) opsin पुनर्गठित करने, LUVs (POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine) और POPG का एक मिश्रण 1- से तैयार किया जाता है palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3- [phospho-rac- (1-ग्लिसरॉल)]) और opsin और NBD-पीसी जोड़ने से पहले DDM के साथ संतृप्त। डिटर्जेंट तो polystyrene मोती के साथ नमूना के इलाज से निकाल दिया जाता है।
<p c लड़की = "jove_content"> सिद्धांत अंतर्निहित प्रतिदीप्ति आधारित परख चित्रा 1 बी में दिखाया गया है। LUVs संतुलित रूप से NBD-पीसी या अन्य NBD लेबल फ्लोरोसेंट फॉस्फोलिपिड रिपोर्टर (चित्रा 1 ए) के एक मात्रा का पता लगाने के साथ पुनर्गठन कर रहे हैं। dithionite जोड़ने पर, एक झिल्ली impermeant dianion, LUVs के बाहरी पत्रक में NBD-पीसी अणुओं प्रदान कर रहे हैं NBD की नाइट्रो-समूह के रूप में गैर फ्लोरोसेंट एक गैर फ्लोरोसेंट एमिनो समूह के लिए कम है। न NBD-पीसी अणुओं और न ही dithionite प्रयोग (<10 मिनट) की समय-पैमाने पर झिल्ली को पार करने में सक्षम हैं, इस फ्लोरोसेंट संकेत के 50% की कमी का परिणाम है। हालांकि, अगर liposomes एक scramblase साथ पुनर्गठन कर रहे हैं, भीतरी पत्रक में NBD-पीसी अणुओं तेजी से बाहर है, जहां वे कम कर रहे हैं के लिए संघर्ष कर सकते हैं। यह आदर्श मामले (चित्रा 1 सी) में प्रतिदीप्ति का कुल नुकसान में परिणाम है।es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
। चित्रा 1: scramblase गतिविधि परख की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व परख एक फ्लोरोसेंट NBD लेबल संवाददाता लिपिड उपयोग करता है; NBD-पीसी दिखाया गया है (ए)। बड़े unilamellar पुटिकाओं NBD-पीसी की मात्रा का पता लगाने के साथ पुनर्गठन कर रहे हैं। पुनर्गठन NBD-पीसी बाहरी और भीतरी पत्रक में समान रूप से वितरित साथ, सममित पुटिकाओं पैदा करता है। Dithionite (एस 2 हे 4 2-) रासायनिक एक गैर फ्लोरोसेंट एमिनो समूह के लिए NBD की नाइट्रो-समूह को कम करता है। Dithionite (बी, ऊपर) के साथ प्रोटीन से मुक्त liposomes का उपचार बाहरी पत्रक में केवल NBD-पीसी अणुओं के बाद से प्रतिदीप्ति की 50% की कमी का कारण बनता है कम कर रहे हैं: dithionite नकारात्मक आरोप लगाया है और झिल्ली NBD-पीसी अणुओं के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए पार नहीं कर सकते भीतरी पत्रक में। Opsin युक्त proteoliposomes (बी, नीचे), के Dithionite उपचार यानी, scramblase सक्रिय proteoliposomes, एफ के लिए 100% नुकसान में परिणामopsin के रूप में luorescence भीतरी और बाहरी पत्रक के बीच NBD-पीसी की आवाजाही की सुविधा। (सी) dithionite के साथ प्रोटीन से मुक्त liposomes और opsin युक्त proteoliposomes के इलाज पर प्राप्त आर्दश प्रतिदीप्ति निशान से पता चलता। प्रतिदीप्ति हानि की दर का संकेत dithionite द्वारा NBD की रासायनिक कमी दर सीमित है, और है कि पांव मार एक दर के बराबर या रासायनिक प्रतिक्रिया की दर से अधिक पर होता है दोनों ही मामलों में एक ही है। एक वास्तविक प्रयोग से प्राप्त निशान 3 चित्र में दिखाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
हम तरीकों का वर्णन पुनर्गठन और अन्य शुद्ध प्रोटीन, साथ ही प्राप्त की, उदाहरण के लिए, डिटर्जेंट 22 के साथ microsomes निकालने के द्वारा झिल्ली प्रोटीन के मिश्रण की परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Scramblase गतिविधि परख है कि opsin फॉस्फोलिपिड scramblase गतिविधि 2 है निर्धारित करने के लिए मूल रूप से सक्षम होना चाहिए। परख भी हमें विशिष्टता के परीक्षण के द्वारा opsin के scramblase गतिविधि को चिह्नित करने की अनुमति दी है (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-d-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 mL extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 mL Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS | |
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