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Biochemistry

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

doi: 10.3791/54635 Published: September 20, 2016

Abstract

Scramblases fosfolípidos translocar através da bicamada de membrana bidireccionalmente de uma forma independente de ATP. A primeira a ser identificada scramblase bioquimicamente e verificou-se opsina, a apoproteína da rodopsina dos fotorreceptores. A rodopsina é um receptor acoplado a proteína G localizado em membranas de discos haste fotorreceptoras da retina, onde é responsável pela percepção da luz. Atividade scramblase da rodopsina não depende do seu ligando 11- cis-retinal, ou seja, a opsina apoproteína também atua como um scramblase. Embora fosfolípido constitutiva e regulada scrambling desempenhar um papel importante na fisiologia da célula, apenas alguns scramblases de fosfolípidos foram identificados até agora, além de opsina. Descrevemos aqui um ensaio baseado em fluorescência de actividade scramblase de opsina. Opsina é reconstituído em grandes lipossomas unilamelares compostos por fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol e uma quantidade traço de fluorescente marcado com NBD PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoil} - sn-glicero-3-fosfocolina). scramblase actividade é determinada medindo a extensão em que as moléculas de NBD-PC localizados no folheto interno da vesícula é capaz de aceder ao folheto exterior, onde a sua fluorescência é eliminado quimicamente por um agente de redução que não pode atravessar a membrana. Os métodos que descrevem têm aplicabilidade geral e podem ser utilizados para identificar e caracterizar as actividades scramblase de outras proteínas de membrana.

Introduction

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A rodopsina dos fotorreceptores, um receptor acoplado a proteína G prototípico (revisto por exemplo, na referência 1), é a primeira scramblase a ser identificado e bioquimicamente verificada 2,3. Scramblases são transportadores de fosfolipídios que aumentam a taxa intrinsecamente lenta de transbilayer movimento fosfolipídios para fisiologicamente níveis apropriados em um bidirecional, forma ATP-independente 4-6. Exemplos de as suas acções podem ser encontradas no retículo endoplasmático e na membrana citoplasmática de bactérias, onde constitutiva de cifragem é necessária para a homeostase da membrana e crescimento, bem como para uma variedade de vias de glicosilação 5. Fosfolípido scrambling regulada é necessária para expor a fosfatidilserina (PS) sobre a superfície de células apoptóticas, onde actua como um "comer-me" -signal para macrófagos 7 e proporciona uma superfície de pró-coagulante nas plaquetas sanguíneas activadas para catalisar a produção do factor de proteínass necessário para a coagulação do sangue. Em membranas de discos fotorreceptoras, actividade de cifragem de rodopsina foi sugerido para compensar o desequilíbrio de fosfolípido entre os dois folhetos da membrana de bicamada que é gerado pelo ATP-dependente, lípido unidireccional flipase ABCA4 4,8,9 10-12.

Apesar da importância fisiológica da scramblases, a sua identidade permanecido elusivos até rodopsina foi reportado como um scramblase em discos fotorreceptoras 2, membros da família de proteínas TMEM16 foram identificados como de Ca2 + dependentes de scramblases necessários para a exposição de PS na membrana plasmática (revisto em referência 13), e a proteína bacteriana FTSW foi proposto como um lípido II scramblase necessária para a síntese do peptidoglicano 14. Estas descobertas basearam-se na reconstituição de proteínas purificadas em lipossomas e demonstração de actividade scramblase nas proteolipossomas resultante utilizando a metodologia described aqui. Outros potenciais scramblases 15-21 - as proteínas MurJ e AMJ implicados na biossíntese dos peptidoglicanos, WzxE e proteínas relacionadas implicada na cifragem precursores de O-antigénio, proteína MprF necessário para translocar fosfatidilglicerol aminoacilado através da membrana citoplasmática de bactérias, e membros da família Xkr8 que têm sido propostos para expor PS na superfície de células apoptóticas - continuam a ser testado bioquimicamente. Isso destaca a importância de um ensaio robusto para identificar e caracterizar a atividade scramblase.

Aqui, nós descrevemos a reconstituição de opsina purificada, a apoproteína da rodopsina de fotorreceptores, em vesículas unilamelares grandes (LUV), e a análise subsequente da actividade de scramblase nas proteolipossomas resultantes usando um ensaio baseado em fluorescência. Existem vários protocolos descritos poços disponíveis na literatura para a expressão heteróloga e purificação de opsina, portanto, não serádescrevê-lo neste protocolo; usamos os protocolos descritos em Goren et ai. 3 que produz FLAG-tag, opsina termoestável a cerca de 100 ng / ul em 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

A reconstituição é conseguida por tratamento com LUV detergente suficiente para que elas incham mas não se dissolvem. Sob estas condições, uma proteína de membrana - fornecido na forma de micelas de detergente-proteína - irá integrar-se os lipossomas e tornar-se reconstituída para a membrana do lipossoma após a remoção de detergente, resultando em proteolipossomas. Para reconstituir opsina (obtido na forma de uma proteína purificada em 0,1% (w / v) DDM), LUV são preparados a partir de uma mistura de POPC (1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfocolina) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3- [fosfo-rac- (1-glicerol)]) e saturou-se com DCM antes de adicionar opsina e NBD-PC. O detergente é então removido por tratamento da amostra com contas de poliestireno.

lass = "jove_content"> O princípio subjacente ao ensaio baseado em fluorescência é mostrado na Figura 1B. LUV são simetricamente reconstituída com uma quantidade vestigial de NBD-PC ou outro fosfolípido repórter fluorescente NBD-rotulado (Figura 1A). Por adição de ditionito, um dianião de membrana-impermeabilizante, moléculas de NBD-PC na monocamada externa dos LUV são tornadas não-fluorescente como a nitro-grupo de NBD é reduzido a um grupo amino não-fluorescente. Como nem moléculas NBD-PC nem ditionito são capazes de atravessar a membrana sobre a escala de tempo da experiência (<10 minutos), o que resulta em redução de 50% do sinal de fluorescência. No entanto, se os lipossomas são reconstituídos com uma scramblase, moléculas de NBD-PC no folheto interno pode precipitação rapidamente para o exterior, onde eles são reduzidos. Isso resulta na perda total de fluorescência, no caso ideal (Figura 1C).

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. Figura 1: Representação esquemática do ensaio de actividade scramblase O ensaio utiliza um repórter lípido marcado com NBD fluorescente; NBD-PC é mostrado (A). As grandes vesículas unilamelares são reconstituídos com uma quantidade vestigial de NBD-PC. Reconstituição produz vesículas simétricas, com NBD-PC distribuído igualmente nos folhetos exteriores e interiores. Ditionito de (S 2 O 4 2-) quimicamente reduz o grupo nitro de NBD para um grupo amino não-fluorescente. Tratamento de lipossomas livres de proteínas com ditionito (B, parte superior) provoca uma redução de 50% da fluorescência uma vez que apenas as moléculas de NBD-PC na monocamada externa são reduzidas: ditionito é carregada negativamente e não pode atravessar a membrana para reagir com as moléculas de NBD-PC no folheto interno. Tratamento ditionito de proteolipossomas contendo opsina (B, parte inferior), isto é, proteolipossomas scramblase-activo, resulta em perda de 100% do Fluorescence como opsina facilita o movimento de NBD-PC entre o interior e o folheto externo. (C) mostra vestígios de fluorescência obtidos idealizadas no tratamento de lipossomas livres de proteínas e proteolipossomas contendo opsina com ditionito. A taxa de perda de fluorescência é o mesmo em ambos os casos, indicando que a redução química de NBD por ditionito é limitante da taxa, e que o embaralhamento ocorre a uma velocidade igual ou maior do que a velocidade da reacção química. Traços obtidos a partir de um experimento real são mostrados na Figura 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os métodos que descrevem pode ser utilizado para a reconstituição e ensaio de outras proteínas purificadas, bem como misturas de proteínas de membrana obtida, por exemplo, por extracção com detergente 22 microssomas.

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Protocol

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1. Preparação dos lipossomas e proteolipossomas

  1. Formação de lipossomas
    1. Usando uma seringa de vidro, adiciona 1435 ul POPC (25 mg / ml, em clorofórmio) e 160 ul POPG (25 mg / ml, em clorofórmio) para um balão de fundo redondo para se obter 52,5 umol lípidos numa razão molar de POPC: POPG = 9: 1.
    2. Secam-se os lípidos para 30 min, utilizando um evaporador rotativo a uma velocidade de rotação de 145 rpm (sem banho de água é necessária para este volume de solvente), e depois transferir o frasco para um secador de vácuo durante pelo menos três horas, ou durante a noite, à temperatura ambiente (RT).
    3. Hidratar a película de lípido seca com 10 ml de HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM (daqui em diante referido como tampão A) agitando suavemente o balão até uma homogéneos, resultados suspensão turva;
      NOTA: A concentração de lípido nesta fase deve ser de 5,25 mM como não há perdas deve ter ocorrido até agora.
    4. Sonicar a suspensão num banho de água durante 10 min à temperatura ambiente com uma frequência óF 40 kHz. A solução vai olhar um pouco mais clara.
    5. Usando um extrusor, passar a suspensão a 10 vezes através de uma membrana com um tamanho de poro de 400 nm, seguido de um segundo ciclo de extrusão com 4 passagens através de uma membrana com um tamanho de poro de 200 nm.
      NOTA: O diâmetro médio dos LUV resultantes é de ~ 175 nm. Se necessário, o tamanho e homogeneidade dos LUV podem ser verificados por dispersão de luz dinâmica de acordo com as instruções do fabricante.
    6. Quantificar a concentração de fosfolípidos da suspensão LUV como descrito na secção 1.2).
      NOTA: Devido às perdas durante a extrusão, a concentração é geralmente cerca de 3,6 mM.
    7. Armazenar os LUV a 4 ° C durante cerca de 2 semanas se não for usado imediatamente.
  2. Quantificação Phospholipid
    NOTA: Para determinar a concentração de fosfolípidos da suspensão LUV utilizada para a reconstituição, bem como a dos proteolipossomas que, eventualmente, são gerados, uma alíquota da amostra é subjected à oxidação pelo ácido perclórico. Este procedimento decompõe fosfolípidos para libertar fosfato inorgânico que é em seguida quantificado por um ensaio colorimétrico, em comparação com os padrões de 23.
    1. Prepara-se uma solução estoque de 40 mM de fosfato de sódio (Na 2 HPO 4) em água desionizada destilada.
    2. Diluir a solução estoque com água destilada deionizada para obter 4 mM e 0,4 mM soluções que servirão como padrões de calibração de trabalho.
    3. Usando as soluções de trabalho, preparar padrões em tubos de 13 x 100 mm 2 de vidro que vão de 0 a 80 nmoles de fosfato de sódio, num volume final de 50 ul.
    4. Tomar 10 ul de cada uma das amostras e LUV proteolipossoma a serem quantificados e dilui-se com 40 jil de ddH2O em 13 tubos x 100 mm 2 de vidro.
      NOTA: Como a concentração de lípidos das LUV e proteolipossomas está na gama de 2,5-5 | iM, os 10 ul da amostra deve conter 25-50 nmol de lípido de fósforo.
    5. Adiciona-se ácido perclórico a 300 ul a cada um dos padrões e amostras e calor durante 1 hora a 145 ° C num bloco de aquecimento. Colocar os tubos em berlindes para prevenir a evaporação.
    6. Deixe os tubos arrefecer até à temperatura ambiente e adiciona-se 1 ml de ddH 2 O.
    7. Adicionar 400 ul de cada recém-preparada de 12 g de molibdato de L / de amónio e 50 g / l de ascorbato de sódio e agitar com vortex para misturar.
    8. Aquecer durante 10 min a 100 ° C com berlindes no topo dos tubos. Retire os tubos do bloco de aquecimento e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente.
    9. Medir a absorção das amostras contra a (amostra padrão contendo fosfato de sódio 0 nmol) em branco com um espectrómetro, num comprimento de onda de 797 nm.
    10. Determinar o teor de fosfato de amostras em relação à curva padrão de calibração.
  3. Reconstituição de Opsina
    NOTA: É necessário determinar as condições óptimas para a reconstituição de inchamento uma vez que estes dependem da natureza do detergente, bemcomo a composição de lípido e concentração das LUV. Como LUV alterar as suas propriedades de dispersão de luz no inchaço do processo pode ser monitorizada por medição da absorvência (Figura 2) como revisto por Rigaud e Levy 24 e Geertsma et ai. 25.
    1. Pipetar 800 l de LUV (a partir da Secção 1.1, tal como a recuperação de lípido após a extrusão é de 70%, a concentração esperada de LUV é fosfolípido 3,6 mM) num tubo de microcentrifugação de 2 ml.
    2. Adicionar 5,3 mL de tampão A e 34,7 ul de 10% (w / v) DDM dissolvido em tampão A.
    3. Incubar durante 3 h à temperatura ambiente com mistura-sobre-extremidade final.
    4. Enquanto isso, prepare as esferas de poliestireno:
      1. Use 400 mg de contas por amostra e pesá-los para fora em um copo de vidro.
      2. Lavar duas vezes com metanol, três vezes com água e uma vez com tampão A. Para cada utilização passo de lavagem de 5 ml de líquido e agita-se lentamente durante 10 min.
        NOTA: Recomenda-se a preparar o poliestirenogrânulos para várias amostras ao mesmo tempo, por exemplo, pesam em 6 g de pérolas e lava-se com 75 ml de líquido. grânulos excesso pode ser armazenado num frigorífico durante vários dias.
    5. Durante os últimos 30 min de desestabilização vesícula secar o fosfolípido NBD-rotulados num tubo com tampa de rosca de vidro ( 'reconstituição tubo de vidro'): por exemplo, 9,5 ul de NBD-PC (1 mg / ml em clorofórmio, obtendo-se 0,4% em mol de fosfolípidos totais) são secas sob uma corrente de azoto num tubo de vidro e subsequentemente dissolvido em 45 ul de 0,1% (w / v) em tampão A. DDM
    6. Após 3 h de desestabilização vesícula adicionar o fosfolipido Dissolveu-NBD-marcado, a proteína solubilizada e DDM-tampão A de tal modo que o volume final de 1 ml contém 0,36% (w / v), isto é, 7 mM, DDM.
      1. Assim, para gerar lipossomas livres de proteínas (utilizado como uma amostra de controlo) adicionar 45 ul de NBD-PC (dissolvidos em 0,1% de DDM), 60 ul de 0,1% de DDM e 55 ul de tampão A; para proteolipossomos acrescentar, para o examePLE, 40 ul de proteína (a partir de uma solução-mãe típica de ~ 110 ng / ul) em 0,1% de DDM, 45 ul de NBD-PC (dissolvidos em 0,1% de DDM), 20 ul de 0,1% de DDM e 55 ul de tampão A .
        NOTA: A ordem de adição deve ser conforme listado.
    7. Misturar a amostra para um fim horas adicionais sobre a extremidade, à temperatura ambiente.
    8. Adicionar 80 mg de pérolas de poliestireno preparadas e incubar a amostra com a extremidade-sobre-extremidade mistura durante 1 h à TA.
    9. Em seguida adicione um adicional de 160 mg de grânulos de poliestireno e incubar com ponta-a-ponta a mistura durante mais 2 horas à temperatura ambiente.
    10. Transferir a amostra (deixando os grânulos de poliestireno passados ​​para trás) a um tubo de vidro com tampa de rosca contendo 160 mg de grânulos de poliestireno frescos e misturar durante a noite a 4 ° C.
      NOTA: A maneira mais fácil de transferir a amostra e evitar sugando grânulos é a utilização de uma pipeta de Pasteur, que é empurrada para a parte inferior do tubo de vidro com uma pequena pressão positiva. Uma vez que a ponta da pipeta é firmemente nofundo do tubo, em seguida, a amostra pode ser retirada facilmente, sem interferência a partir das esferas.
    11. Na manhã seguinte, transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga sem carregar sobre contas e colocar no gelo na preparação para o ensaio da atividade scramblase.

2. Ensaio de Actividade scramblase

NOTA: A intensidade de fluorescência de lipossomas ou proteolipossomas diluídas com tampão A é monitorizada ao longo do tempo após a adição de ditionito num espectrómetro de fluorescência. Para se obter uma intensidade de partida estável, a fluorescência é registada por pelo menos 50 segundos (ou até que um sinal estável é alcançada) antes de adicionar ditionito a uma amostra constantemente agitada e é, então, seguido por, pelo menos, 500 segundos após a adição de ditionito.

  1. Adicionar 1,950 mL de tampão A a uma tina de plástico contendo um mini-barra de agitação.
  2. Adicionar 50 ul da Proteo preparada (lipossomas) e deixar equilibrar a amostra no espectrofotómetro de fluorescênciamedidor com agitação constante durante vários segundos.
  3. Enquanto isso preparar uma solução de 1 M de ditionito em Tris 0,5 M não tamponada (por exemplo, para duas amostras pesam-se 20 mg de ditionito num tubo de microcentrifugação e dissolve-se em 114 mL de gelo frio de Tris 0,5 M directamente antes da utilização e manter em gelo para o próximo amostra).
    NOTA: A solução de ditionito deve ser preparada imediatamente e não deve ser usado mais de 20 minutos após a preparação; Se muitas medições estão a ser feitas, alíquotas de ditionito pode ser pesado com antecedência e dissolveu-se imediatamente antes da utilização.
  4. Iniciar a monitorização da fluorescência (excitação 470 nm, emissão a 530 nm, fenda de largura de 0,5 nM).
  5. Adicionar 40 ul da solução de ditionito de 1 M para a cuvete 50 segundos depois de começar a gravação de fluorescência (use o septo na tampa da câmara de cuvete se possível) e continuar a gravar a fluorescência para um outro 400-600 seg.
  6. Analisar os dados conforme descrito na seção 3.

3.Análise de dados

  1. Cinética de Scrambling
    1. Caracterizar o rastreio de fluorescência de cada amostra obtida pelo ensaio de actividade scramblase definindo a fluorescência inicial, F I, antes de se adicionar ditionito, e a fluorescência de ponto final, F, alcançado após> 400 seg. F i é determinada para cada amostra como o valor médio de fluorescência para o período de 30 segundos antes da adição de ditionito.
    2. Determinar os dados de ponto de extremidade correspondente à extensão da redução da fluorescência, R = 100 • F / F i. Usamos os termos R L para os lipossomas livres de proteínas e R P para proteolipossomas contendo opsina.
  2. Determinação do peso molecular do Funcionalmente reconstituído scramblase
    1. Converter os dados de redução de fluorescência de acordo com a seguinte equação:
      P (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (Rmax - R L) (Equação 1)
      NOTA: Onde Rmax é a redução máxima que é obtida quando a proteína suficiente é reconstituído de modo a que todas as vesículas na amostra possuem pelo menos um scramblase funcional, e P é a probabilidade de que uma vesícula particular numa amostra reconstituída é 'scramblase-activo ", isto é, que possui pelo menos um scramblase funcional. O valor de R L é tipicamente 45% 3 enquanto que Rmax é tipicamente 82,5% 3, em vez do esperado 100% (R máx pode ser determinada experimentalmente para proteolipossomas opsina com um PPR de> 1 mg / mmol). Como Rmax <100%, presume-se que uma sub-população de vesículas é refractário à reconstituição. Por R max = 82,5%, a fração de vesículas que é incapaz de aceitar a proteína é de 0,35.
    2. Descrever a relação entre P (≥1 scramblase) e PPR (mg de proteína / fosfolípido mmol) por estatística de Poisson da seguinte forma:
      P (≥1 scramblase) = 1 - e NOTA: em que m = número de scramblases por vesícula e α = constante ajuste de mono-exponencial em unidades de mg de proteína fosfolípido / mmol.
    3. Como uma fracção das vesículas não contribui para a cifragem mesmo em alta PPR (ver discussão), modificar a equação:
      P (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equação 3)
      NOTA: Se PPR * = PPR / (1- f), em que f é a população de vesículas ou refractário, neste caso, PPR * = PPR / 0,65 (Equação 4).
      NOTA: O α constante ajuste é determinada ajustando um gráfico de p (≥1 scramblase) versus PPR * com uma função mono-exponencial. Se opsina (peso molecular 41,7 kDa) reconstitui funcionalmente em vesículas de 175 nm de diâmetro (cada vesícula tem 280.000 fosfolipídios 26) como um monômero, a = 0,187 mg mmol -1. Se opsina dimeriza antes da reconstituição 3, para se obter vesículas scramblase-activo, em seguida, α= 0,37 mg mmol -1. Se em vez de PPR PPR * estavam a ser utilizados para a análise, em seguida, os valores correspondentes ct seria 0,122 e 0,244 mg mmol -1. Estes valores previstos para α assumir que todas as moléculas opsina são funcionalmente competente. Se apenas uma fracção das moléculas é competente para embaralhar lípidos, em seguida, os valores correspondentes de α será maior.

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Representative Results

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Descreve-se a reconstituição de opsina em LUV para caracterizar a sua actividade scramblase usando um ensaio baseado em fluorescência. Analisamos os resultados para colocar um limite inferior na taxa de fosfolípido mediada por opsina cifragem e para determinar o estado oligomérico em que opsina reconstitui funcionalmente para as vesículas.

Para identificar as condições óptimas de reconstituição, é necessário determinar empiricamente a quantidade de detergente que deve ser utilizada para inchar as LUV de modo que eles são receptivos a inserção de proteínas. Tal experiência está ilustrada na Figura 2A. Alíquotas de POPC: LUV POPG são tratados com quantidades diferentes de DDM durante 3 horas e a absorvência da amostra é medida a 540 nm, uma medida de turvação e, portanto, do tamanho das vesículas. A densidade óptica medida a 540 nm (OD 540) gráfico mostra que as vesículas de inchar como DDM concentrção é aumentada de 4-6 mm, chega a um ponto de saturação a cerca de 7 mm, antes de começar a solubilizar (correspondente à perda de turvação e o sinal de OD 540) como DDM é aumentada ainda mais. NBD-PC é adicionado após o tratamento de detergente e as amostras são incubadas durante mais uma hora antes de ser tratada com esferas de poliestireno para remover o detergente. A distribuição transbilayer de NBD-PC é determinada por medição da perda de fluorescência após a adição de ditionito de vesículas (como descrito acima). Assim, NBD-PC insere na monocamada externa das vesículas, na ausência de detergente, indicada por sua acessibilidade completa de ditionito. Para vesículas tratados com> DDM 2 mM, NBD-PC é capaz de distribuir de forma simétrica em ambos os folhetos de modo que uma vez que o DDM é removido 50% do NBD-PC é protegido de ditionito.

A figura 2B mostra um experimento de desestabilização-reconstituição semelhante (redesenhado de referência 2 </ Sup>), desta vez acompanhando a reconstituição de opsina. Nesta experiência, pode ser visto que o DDM 7 mM é necessária para a reconstituição opsina tal que NBD-PC torna-se quantitativamente (> 80%) acessível a ditionito como resultado da cifragem mediada por opsina.

Figura 2
Figura 2:. Reconstituição de NBD-PC e opsina em vesículas desestabilizado-detergente (A) Alíquotas das vesículas são tratadas com uma gama de concentrações de detergente (0-9 mM) através da mistura de ponta-a-ponta durante 3 h à temperatura ambiente . No final do período de incubação, a absorvância das amostras a 540 nm é medida (linha preta). NBD-PC (dissolvidos em 0,1% w / v DDM) é então adicionado e a amostra é incubada durante mais 1 h à temperatura ambiente antes de o detergente é removido por tratamento com esferas de poliestireno. Os lipossomas resultantes são analisados ​​pelo Fluor ensaio de redução escent (linha vermelha) para determinar a extensão em que NBD-PC é simetricamente reconstituído. (B) como em (a), mas neste vesículas experiência formadas a partir de fosfolípidos de ovo (PC de ovo / ovo ácido fosfatídico, 9: 1 mol / mol) foram desestabilizado com DDM, e opsina foi adicionado em conjunto com NBD-PC, resultando numa redução de fluorescência de cerca de 80%, quando a proteína é eficientemente reconstituído e capaz de facilitar a codificação de NBD-PC (modificado a partir de referência 2). Embora NBD-PC foi simetricamente reconstituído em DDM 2 mM, as condições ideais para a reconstituição de opsina foram escolhidos em torno do pico de OD 540 de absorvância, isto é, o ponto em que as vesículas foram altamente inchados devido ao detergente intercalada mas ainda não solubilizado (indicado pela flecha). Para POPC / POPG (9: 1 mol / mol) de vesículas, uma concentração de 8 mM de DDM foi encontrado para ser óptima para ambos NBD-PC e reconstituição opsina./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A extensão da redução da fluorescência aumenta com a quantidade de opsina utilizada para a reconstituição. A Figura 3A mostra vestígios de fluorescência obtidos na adição de ditionito de NBD-PC contendo lipossomas livres de proteínas (traço negro) e proteolipossomas reconstituídos com opsina a proteína diferente de rácios de fosfolípidos (PPR, em unidades de mg de proteína por fosfolípido mmol, traços vermelhos); os vestígios foram normalizadas de modo a que todos eles têm o mesmo fluorescência inicial (F i) o valor de visualização mais fácil. encaixa monoexponencial dos traços indicam constantes de tempo muito semelhantes, variando 20-25 seg; como a taxa de redução de NBD-PC mediada por ditionito em lipossomas livres de proteínas é a mesma como nas proteolipossomas, só é possível colocar uma estimativa inferior da velocidade de opsina mediada por embaralhamento (ver text para mais detalhes). A Figura 3B mostra os dados analisados, obtidos a partir dos ensaios de fluorescência de redução para se obter lotes de P (≥1) scramblase (a probabilidade de uma vesícula que tem pelo menos um scramblase) versus o PPR medidos experimentalmente (relacionada com PPR * como discutido acima). Comparação do ajuste monoexponencial dos resultados experimentais em ataques hipotéticos correspondentes a opsina ser reconstituído como uma apresentação de monômero, dímero ou tetrâmero que opsina reconstitui funcionalmente como um dímero.

Figura 3
Figura 3:. Scramblase actividade de opsina vestígios (A) de fluorescência que corresponde ao tratamento ditionito de vesículas reconstituídos com NBD-PC e opsina quantidades que variam entre 0-4,95 ug, indicado pela cunha. A menor quantidade de opsina reconstituído corresponde a um PPR de 0,21 mg / mmol, asegunda maior quantidade de 0,43 mg / mmol e a maior quantidade de 1,3 mg / mmol, ou 10 opsins por vesícula, em média. Foi adicionado ditionito na hora indicada (seta) e NBD fluorescência foi monitorizada durante mais 400 segundos. A extensão máxima de redução de fluorescência visto neste experimento foi de 85% enquanto a média ao longo de muitos experimentos é de 82,5%. (B) a dependência de proteína de cifragem. Dados obtidos em experiências semelhantes a painel A foram analisadas utilizando estatística de Poisson para gerar um gráfico da probabilidade de vesículas que têm pelo menos um scramblase (p ≥1 scramblase) versus a relação de proteína para fosfolípido (PPR) de vesículas (proteína foi quantificada pós- reconstituição por análise de Western Blot e 3 fosfolípido foi determinada medindo o fosfato inorgânico libertado por hidrólise ácida). A linha vermelha representa um ajuste mono-exponencial para os dados; as linhas cinzentas tracejadas representam fits mono-exponencial para a reconstituição da opsina em 170 nm de diâmetro vesicles como monômeros, dímeros pré-formados ou tetrâmeros pré-formadas. À medida que o eixo x representa o PPR medida experimentalmente (em vez de PPR * (ver texto principal)), as constantes de ajuste correspondem a PPR em vez de PPR * valores, como discutido no texto principal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

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O ensaio de atividade scramblase permitiu-nos inicialmente para determinar que opsina tem actividade scramblase 2. O ensaio também permitiu-nos caracterizar a actividade scramblase de opsina por meio de testes de especificidade (foi utilizada uma variedade de lípidos repórter NBD-rotulados como NBD-fosfatidiletanolamina, marcado com NBD em uma cadeia de acilo, tal como mostrado para NBD-PC na Figura 1A, ou na headgroup, NBD-esf ingomielina ou NBD- fosfatidilserina 2), o efeito da composição lipídica das vesículas (por exemplo, colesterol em diferentes quantidades como constituinte de vesículas), e se os diferentes estados conformacionais de opsina e rodopsina todos apresentam actividade scramblase. Estas análises revelaram que a actividade scramblase da rodopsina é muito rápido (> 10.000 fosfolípidos por segundo), não específica para o fosfolípido e independente do estado conformacional da rodopsina ou se é ou não contém o cromóforo da retina 2,3. Aqui,apresentamos um método detalhado para gerar proteolipossomos contendo opsina e mostrou como testar estas preparações para a atividade scramblase.

O protocolo descrito reconstituição é optimizado para a composição lipídica dada e para a reconstituição de opsina depois de ter sido purificado por cromatografia de afinidade utilizando DDM como detergente de solubilização. A composição lipídica, bem como o detergente pode ser alterada de acordo com as necessidades do experimentador, embora as condições de reconstituição ideais para condições alteradas tem que ser determinada efectuando o "inchaço-experimento" descrito na Figura 2. DDM é empiricamente bem adequada para a manutenção de opsina em condição estável e ativa. No entanto, outros detergentes tais como octil-β-glucósido, CHAPS ou Triton X-100 pode ser utilizado de acordo com protocolos semelhantes. Triton X-100 é um detergente amplamente utilizado para a reconstituição de transportadores cassete de ligação a ATP (ABC) como transportadores sua efficieNCY na mediação reconstituição membrana é maior do que de outros detergentes e também leva menos tempo para equilibrar com lipossomas pré-formados 24.

É possível determinar o estado oligomérico da opsina funcionalmente reconstituída se a extensão da redução fluorescente é obtido para amostras reconstituídas com diferentes quantidades de opsina, ou seja, ao longo de um intervalo de proteína para os rácios de fosfolípidos (PPR). A fim de fazer isso, o PPR das vesículas reconstituídos devem ser explicitamente medidos como a recuperação de proteínas e fosfolipídios podem variar. recuperação de fosfolípido pode ser determinado pelo ensaio de fosfato descrito na secção 1.2, enquanto que a recuperação da proteína pode ser estimada através da análise quantitativa de Western Blot em que as proteínas purificadas utilizadas para reconstituições são utilizados para gerar uma curva de calibração que permite comparação com a recuperação de amostras reconstituídas através PPR a gama testada (tal como explicado em detalhe em referência 3).

O ensaio de actividade scramblase é construído sobre a suposição de que ditionito não permeia para as vesículas. Este ponto pode ser verificado por aprisionamento um repórter marcado com NBD solúvel dentro das vesículas e determinar se ele pode ser reduzida por ditionito. Para este efeito, NBD-glucose (12,6 | iM adicionados após desestabilização da vesícula) é utilizado em vez de NBD-PC. Esta molécula solúvel em água é aprisionado dentro dos proteolipossomas uma vez as vesículas são selados e deve, portanto, ser protegidos de ditionito. Para tornar o NBD-glicose totalmente acessíveis para a redução, de Triton X-100 pode ser adicionado (1% w / v), o que resulta na redução de 100% 3,27.

Os proteolipossomas pode ser caracterizada para confirmar que a reconstituição de tanto o lípido e proteína repórter é simétrica. O primeiro é conseguido por meio de experimentos de extinção colisões usando íons iodeto, enquanto o último é baseado em uma estratégia de proteção de protease usando AspN protease quecorta num local específico perto do terminal C de opsina 3.

A transição a partir da fluorescência inicial (F i) determinado no ensaio de actividade scramblase para a fluorescência de ponto final (F) é complexa, mas para os nossos propósitos, pode ser razoavelmente aproximada por uma única função de decaimento exponencial. A constante de tempo associada com a queda exponencial (20 seg) é praticamente o mesmo para os lipossomas, e inactivos proteolipossomas contendo opsina activo, para indicar que o embaralhamento ocorre mais rápido, ou mais rápida do que a taxa à qual o fluoróforo NBD é reduzida por ditionito. Assim, o ensaio da atividade scramblase tem uma resolução de tempo pobres (limitada pela dithionite química de redução), que actualmente apenas permite a classificação dos mutantes em ativos, muito lento ou inativo. Esta classificação pode ser visto para o scramblase regulado pelo cálcio TMEM16 27: em altas níveis de Ca 2+, o decaimento da fluorescência revelou uma constante de tempo semelhante ao thaT visto em lipossomas livres de proteínas, indicando que o passo limitante da velocidade, é a redução química do NBD-fluoróforo por ditionito de lípido scrambling. Pelo contrário, a níveis baixos de Ca2 + o estado estacionário de redução de fluorescência não foi alcançado depois de 900 segundos, o que torna possível distinguir entre os dois componentes, um cinéticos atribuído à redução do ditionito de folheto exterior e a mais lenta para a exposição de NBD-lípidos interiores-folheto para o exterior.

A discrepância entre o previsto perda de 100% de fluorescência de ditionito de tratamento de vesículas preparadas com alta PPR (Figura 1C) versus a realidade experimental onde é difícil exceder redução de ~ 85% (Figura 3A) sugere que uma fracção das vesículas é refractário para reconstituição. Esta fracção pode corresponder a vesículas que selo cedo durante o processo de reconstituição como detergente é adsorvido nas contas de poliestireno e sãoportanto, não é capaz de receber proteína. Para a análise descrita na seção 3, assumimos que essa população refratária corresponde a uma fração f do total das vesículas. Se assumirmos que metade das moléculas NBD-PC (a piscina de NBD-PC no folheto externo) nas vesículas refratários está disponível para dithionite redução, em seguida, estimamos f = 2 • (1 - R max / 100), ou 0,35 quando R max = 82,5%.

A montagem de p (≥1 scramblase) versus PPR * dados com uma equação monoexponencial fornece o α constante ajuste, a partir do qual é possível determinar se reconstitui opsina funcionalmente como um monómero ou dímero, ou uma mistura de estados incluindo multímeros de ordem mais elevada . A interpretação destes resultados torna-se complicado se uma fracção de moléculas de opsina não pode funcionar em scrambling. Enquanto isso é improvável, dadas as condições em que opsina é purificada que garantem que ele mantém toda a sua proteína Gactividades do receptor, um valor de α correspondente à inserção de dímeros funcional também pode ser interpretado como a inserção funcional de monómeros a partir de uma preparação de opsina onde metade das proteínas são inactivos como scramblases. Um ponto adicional a considerar é que a análise que apresentamos assume que as vesículas utilizadas para a reconstituição são homogéneas em tamanho. Na realidade, as vesículas têm uma gama de diâmetros caracterizados por uma distribuição de Gauss com um desvio padrão correspondente a cerca de um terço do diâmetro médio. Felizmente, o resultado da análise de P (≥1 scramblase) versus PPR * dados não é significativamente afectada pela consideração da heterogeneidade das vesículas e assim a análise simples que apresentada é suficiente para descrever os dados.

Uma limitação potencial dos métodos descritos que é que o processo de trabalho intensivo não permite medições de alto rendimento de um número muito elevado de amostras de umnd que a heterogeneidade da vesícula possa perturbar a leitura. O primeiro problema pode ser ultrapassado usando um formato de microtitulação de placas para o ensaio de scramblase; o segundo poderia ser resolvido no futuro por ensaios de vesícula único meio de microscopia TIRF.

O ensaio para medir a actividade ditionito scramblase pode ser considerado como muito fiável e robusto, uma vez os procedimentos de desestabilização e reconstituição são estabelecidos. Uma abordagem alternativa para quantificar o transporte transmembranar de fosfolípidos, que também permite a verificação dos resultados obtidos a partir do ensaio de ditionito, retro-extracção é de cadeia curta-NBD-lípidos a partir do folheto exterior das vesículas, utilizando gordos bovino livre de ácido de albumina de soro 22. A extracção inversa, bem como o ensaio de ditionito também têm sido utilizados para caracterizar e identificar flippases das ATPases do tipo P4 e transportadores ABC 28-33.

Como as ferramentas aqui apresentadas pode ser facilmente adaptado de acordo com a diferennt precisa os procedimentos descritos são versáteis e vai ajudar na identificação e caracterização scramblases fosfolipídios no futuro. Aprender a identidade de muitas destas, incluindo o da scramblase necessário para a expansão de membranas biogénicas durante o crescimento celular é de extrema importância fisiológica.

Para obter informações adicionais e uma descrição detalhada de análise de dados, os leitores são referidas publicações anteriores de nosso laboratório 2-4,27, bem como outros 22,25,28,30.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

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References

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Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade
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Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

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