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Biochemistry

Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

doi: 10.3791/54635 Published: September 20, 2016

Abstract

Scramblases translocan fosfolípidos través de la bicapa de membrana bidireccionalmente de una manera independiente de ATP. La primera escramblasa a ser identificado y bioquímicamente verificada fue opsina, la apoproteína de la rodopsina de los fotorreceptores. La rodopsina es un receptor acoplado a proteína G localizados en las membranas de disco varilla de fotorreceptores de la retina donde es responsable de la percepción de la luz. Actividad escramblasa de rodopsina no depende de su ligando 11- cis retinal, es decir, la opsina apoproteína también es activo como un escramblasa. Aunque fosfolípido constitutiva y regulada de aleatorización jugar un papel importante en la fisiología celular, sólo unos pocos scramblases fosfolípidos han sido identificados hasta el momento, además de opsina. Aquí se describe un ensayo basado en la fluorescencia de la actividad escramblasa de opsina. Opsina se reconstituye en grandes liposomas unilamelares compuestos de fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol y una cantidad traza de fluorescencia NBD marcado con PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoil} - sn -glicero-3-fosfocolina). actividad escramblasa se determina midiendo el grado en que las moléculas de NBD-PC situados en la cara interna de la vesícula son capaces de acceder a la cara externa, donde su fluorescencia se elimina químicamente por un agente reductor que no pueden atravesar la membrana. Los métodos que describimos tienen aplicabilidad general y se pueden utilizar para identificar y caracterizar las actividades escramblasa de otras proteínas de membrana.

Introduction

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La rodopsina fotorreceptor, una proteína G-receptor acoplado prototípico (revisado por ejemplo en la referencia 1), es la primera escramblasa fosfolípido ser identificados y bioquímicamente verificada 2,3. Scramblases son transportadores de fosfolípidos que aumentan la tasa intrínsecamente lenta de transbilayer movimiento fosfolípido a fisiológicamente niveles apropiados en un bidireccional, de manera independiente de ATP 4-6. Ejemplos de sus acciones se pueden encontrar en el retículo endoplásmico y la membrana citoplasmática bacteriana donde aleatorización constitutiva se necesita para la homeostasis de la membrana y el crecimiento, así como para una variedad de vías de glicosilación 5. Se necesita fosfolípido regulada aleatorización para exponer la fosfatidilserina (PS) en la superficie de las células apoptóticas, donde actúa como un "comer-me" -señal de macrófagos 7 y proporciona una superficie procoagulante de las plaquetas sanguíneas activadas para catalizar la producción de la proteína factors es necesario para la coagulación de la sangre. En las membranas de disco fotorreceptoras, la actividad de aleatorización de la rodopsina se ha sugerido para contrarrestar el desequilibrio de fosfolípidos entre las dos valvas de membrana de la bicapa que se genera por el dependiente de ATP, de lípidos unidireccional flipasa ABCA4 4,8,9 10-12.

A pesar de la importancia fisiológica de scramblases, su identidad sigue siendo difícil hasta la rodopsina se informó como un escramblasa en discos fotorreceptoras 2, los miembros de la familia de proteínas TMEM16 fueron identificados como Ca 2+ scramblases dependientes necesarios para la exposición de PS en la membrana plasmática (revisado en referencia 13), y se propuso la proteína bacteriana FtsW como escramblasa requiere un lípido II para la síntesis de peptidoglicano 14. Estos descubrimientos se basan en la reconstitución de proteínas purificadas en liposomas y la demostración de la actividad escramblasa en los proteoliposomas resultantes utilizando la metodología described aquí. Otros posibles scramblases 15-21 - las proteínas MurJ y AMJ implicados en la biosíntesis del peptidoglicano, WzxE y proteínas relacionadas implicadas en la codificación precursores de antígeno O, proteínas MPRF necesario para trasladar fosfatidilglicerol aminoacylated través de la membrana citoplasmática bacteriana, y miembros de la familia Xkr8 que se han propuesto para exponer PS en la superficie de las células apoptóticas - permanecen a ensayar bioquímicamente. Esto pone de relieve la importancia de un sólido ensayo para identificar y caracterizar la actividad escramblasa.

A continuación, describimos la reconstitución de la opsina purificada, la apoproteína de la rodopsina de los fotorreceptores, en grandes vesículas unilaminares (LUVs), y posterior análisis de la actividad escramblasa en los proteoliposomas resultantes utilizando un ensayo basado en fluorescencia. Hay varios protocolos bien descrita en la literatura disponibles para la expresión heteróloga y la purificación de la opsina, por lo tanto, no lo harádescribirla en este protocolo; utilizamos los protocolos descritos en Goren et al. 3 que el rendimiento de FLAG-etiquetados, opsina termoestable a aproximadamente 100 ng / l en 0,1% (w / v) dodecilmaltósido (DDM).

La reconstitución se consigue mediante el tratamiento de LUVs con detergente suficiente para que se hinchan pero no se disuelven. En estas condiciones, una proteína de membrana - se suministra en forma de micelas de proteína-detergente - integrará en los liposomas y llegar a ser reconstituido en la membrana del liposoma después de la retirada de detergente, lo que resulta en proteoliposomas. Para reconstituir la opsina (obtenida como una proteína purificada en 0.1% (w / v) DDM), LUVs se preparan a partir de una mezcla de POPC (1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfocolina) y POPG (1- palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3- [fosfo-rac- (1-glicerol)]) y se saturó con DDM antes de añadir la opsina y NBD-PC. El detergente se elimina a continuación mediante tratamiento de la muestra con perlas de poliestireno.

lass = "jove_content"> El principio subyacente del ensayo basado en la fluorescencia se muestra en la Figura 1B. LUVs son simétricamente reconstituirse con una cantidad traza de NBD-PC u otro reportero fosfolípido fluorescente marcado con NBD (Figura 1A). En la adición de ditionito, un no fluorescente dianión membrana impermeable, las moléculas de NBD-PC en el prospecto exterior de las LUVs se representan como el nitro-grupo de NBD se reduce a un grupo amino no fluorescente. Como ni moléculas NBD-PC ni ditionito son capaces de atravesar la membrana en la escala de tiempo del experimento (<10 min), esto se traduce en la reducción de 50% de la señal fluorescente. Sin embargo, si los liposomas se reconstituyen con un escramblasa, las moléculas de NBD-PC en el prospecto interior pueden codificar rápidamente hacia el exterior en el que se reducen. Esto resulta en la pérdida total de la fluorescencia en el caso ideal (Figura 1C).

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. Figura 1: Representación esquemática del ensayo de actividad escramblasa El ensayo utiliza un fluorescente reportero lípidos NBD-marcado; Se muestra NBD-PC (A). Grandes vesículas unilamelares se reconstituyen con una cantidad traza de NBD-PC. La reconstitución produce vesículas simétricas, con NBD-PC distribuido por igual en los folletos exterior e interior. Ditionito (S 2 O 4 2-) reduce químicamente el grupo nitro de NBD a un grupo amino no fluorescente. El tratamiento de los liposomas libres de proteínas con ditionito (B, arriba) provoca una reducción del 50% de la fluorescencia, ya que sólo las moléculas de NBD-PC en el exterior prospecto se reducen: ditionito está cargado negativamente y no puede atravesar la membrana para reaccionar con las moléculas de NBD-PC en el prospecto interior. Tratamiento ditionito de proteoliposomas que contiene opsina-(b, abajo), es decir, proteoliposomas escramblasa-activa, da como resultado la pérdida del 100% de la fluorescence como opsina facilita el movimiento del NBD-PC entre el interior y el exterior prospecto. (C) muestra trazas de fluorescencia idealizadas obtenidos en el tratamiento de los liposomas libres de proteínas y proteoliposomas que contiene opsina-con ditionito. La tasa de pérdida de fluorescencia es la misma en ambos casos que indican que la reducción química de NBD por ditionito es limitante de la velocidad, y que de aleatorización se produce a una velocidad igual o mayor que la velocidad de la reacción química. Las huellas obtenidas a partir de un experimento real se muestran en la Figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los métodos que describimos se pueden utilizar para reconstituir y el ensayo de otras proteínas purificadas, así como mezclas de proteínas de membrana obtenidos, por ejemplo, mediante la extracción de microsomas con detergente 22.

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Protocol

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1. Preparación de liposomas y proteoliposomas

  1. formación de liposomas
    1. Usando una jeringa de vidrio, añadir 1.435 POPC l (25 mg / ml, en cloroformo) y 160 POPG l (25 mg / ml, en cloroformo) a un matraz de fondo redondo para obtener 52,5 mol lípidos en una relación molar de POPC: POPG = 9: 1.
    2. Secar los lípidos de 30 min usando un evaporador rotatorio a una velocidad de rotación de 145 rpm (no se necesita baño de agua para este volumen de disolvente), a continuación, transferir el matraz a un desecador de vacío durante al menos 3 horas o durante la noche, a temperatura ambiente (RT).
    3. Hidratar la película lipídica seca con 10 ml de HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM (en adelante como tampón A) girando suavemente el matraz hasta un homogéneos resultados, suspensión turbias;
      NOTA: La concentración de lípidos en esta etapa se espera que sea 5,25 mM como no hay pérdidas deberían haber ocurrido hasta ahora.
    4. Sonicar la suspensión en un baño de agua durante 10 min a temperatura ambiente con una frecuencia of 40 kHz. La solución se verá un poco más clara.
    5. El uso de un extrusor, pasar la suspensión 10 veces a través de una membrana con un tamaño de poro 400 nm, seguido por un segundo ciclo de extrusión con 4 pases a través de una membrana con un tamaño de poro 200 nm.
      NOTA: El diámetro medio de las LUVs resultantes es de ~ 175 nm. Si es necesario, el tamaño y la homogeneidad de las LUVs se pueden comprobar por Dynamic Light Scattering de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    6. Cuantificar la concentración de fosfolípidos de la suspensión LUV como se describe en la sección 1.2).
      NOTA: Debido a las pérdidas durante la extrusión, la concentración suele ser alrededor de 3,6 mM.
    7. Almacenar los LUVs a 4 ° C durante aproximadamente 2 semanas si no se utiliza inmediatamente.
  2. La cuantificación de fosfolípidos
    NOTA: para determinar la concentración de fosfolípidos de la suspensión LUV utilizada para la reconstitución, así como la de los proteoliposomas que eventualmente se generan, una parte alícuota de la muestra es Subjected a la oxidación por el ácido perclórico. Este procedimiento rompe fosfolípidos para la liberación de fosfato inorgánico que luego se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico en comparación con las normas 23.
    1. Preparar una solución madre 40 mM de fosfato de sodio (Na 2 HPO 4) en agua destilada desionizada.
    2. Diluir la solución madre con agua destilada desionizada para obtener 4 mM y 0,4 mM de soluciones que servirán como patrones de calibración de trabajo.
    3. Uso de las soluciones de trabajo, preparar los estándares en tubos de 13 x 100 mm 2 de vidrio que van de 0 a 80 nmol de fosfato de sodio en un volumen final de 50 l.
    4. Tomar 10 l cada una de las muestras LUV y proteoliposoma que se cuantifiquen y se diluye con 40 l de ddH2O en 13 tubos de vidrio x 100 mm2.
      NOTA: Como la concentración de lípidos de los LUVs y proteoliposomas está en el intervalo desde 2,5 hasta 5 M, los 10 l de la muestra deberá contener desde 25 hasta 50 nmol de fósforo lipídico.
    5. Se añade ácido perclórico 300 l de cada uno de los patrones y las muestras y el calor durante 1 hora a 145 ° C en un bloque de calentamiento. Ponga canicas en los tubos para evitar la evaporación.
    6. Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente y se añade 1 ml de ddH2O
    7. Añadir 400 l cada uno de molibdato recién preparada de 12 g / l de amonio y ascorbato de sodio / L de 50 g y agitar para mezclar.
    8. El calor durante 10 minutos a 100 ° C con mármoles en la parte superior de los tubos. Retire los tubos del bloque de calefacción y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
    9. Medir la absorbancia de las muestras contra la (muestra patrón que contiene fosfato de sodio 0 nmol) en blanco con un espectrómetro para una longitud de onda de 797 nm.
    10. Determinar el contenido de fosfato de muestras en la curva estándar de calibración.
  3. La reconstitución de Opsin
    NOTA: Es necesario determinar las condiciones óptimas de hinchamiento para la reconstitución ya que estos dependen de la naturaleza del detergente, asícomo la composición de lípidos y la concentración de los LUVs. Como LUV cambian sus propiedades de dispersión de luz sobre el proceso de la inflamación puede ser controlada por la medición de absorbancia (Figura 2) tal como fue revisado por Rigaud y Levy 24 y Geertsma et al. 25.
    1. Pipetear 800 l de LUVs (de la Sección 1.1, como la recuperación de lípidos después de la extrusión es 70%, la concentración esperada de LUVs es fosfolípido 3,6 mM) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
    2. Añadir 5,3 l de tampón A y 34,7 l de 10% (w / v) DDM disolvió en tampón A.
    3. Incubar durante 3 horas a temperatura ambiente con mezcla de extremo a extremo.
    4. Mientras tanto preparar las perlas de poliestireno:
      1. Utilice 400 mg de cuentas por muestra y pesar en un vaso de precipitados de vidrio.
      2. Lavar dos veces con metanol, tres veces con agua y una vez con tampón A. Para cada lavado utilice el paso 5 ml de líquido y se agita lentamente durante 10 minutos.
        NOTA: Se recomienda preparar el poliestirenolos granos para las varias muestras a la vez, por ejemplo, pesan en 6 g de perlas y se lavan con 75 ml de líquido. perlas en exceso se pueden almacenar en un refrigerador durante varios días.
    5. Durante los últimos 30 minutos de la desestabilización de la vesícula secar el fosfolípido marcado con NBD en un tubo de vidrio con tapón de rosca ( 'reconstitución tubo de cristal'): por ejemplo, 9,5 l de NBD-PC (1 mg / ml en cloroformo, con un rendimiento de 0,4% en moles de fosfolípidos totales) se secan bajo una corriente de nitrógeno en un tubo de vidrio y posteriormente se disolvió en 45 l de 0,1% (w / v) en tampón A. DDM
    6. Después de 3 h de desestabilización vesícula añadir el fosfolípido marcado con NBD-disuelto, la proteína solubilizada y DDM-tampón A tal que el volumen final de 1 ml contiene 0,36% (w / v), es decir, 7 mM, DDM.
      1. Por lo tanto, para generar los liposomas libres de proteínas (usado como una muestra de control) añadir 45 l de NBD-PC (disuelto en 0,1% de DDM), 60 l de 0,1% de DDM y 55 l de tampón A; proteoliposomas para añadir, para el examenPLE, 40 l de proteína (de una solución madre típica de ~ 110 ng / l) en 0,1% DDM, 45 l de NBD-PC (disuelto en 0,1% de DDM), 20 l de 0,1% de DDM y 55 l de tampón A .
        NOTA: El orden de adición debe ser como se indica.
    7. Mezclar la muestra para un fin hr adicional sobre el extremo a temperatura ambiente.
    8. Añadir 80 mg de las perlas de poliestireno preparadas e incubar la muestra con-extremo sobre extremo de mezclar durante 1 hora a RT.
    9. A continuación añadimos una 160 mg adicional de perlas de poliestireno y se incuba con-extremo sobre extremo de mezcla para un 2 hr adicional a temperatura ambiente.
    10. Transferir la muestra (dejando las perlas de poliestireno pasado detrás) a un tubo de vidrio con tapón de rosca que contiene 160 mg de perlas de poliestireno frescas y mezclar durante la noche a 4 ° C.
      NOTA: La forma más fácil de transferir la muestra y evitar la succión hasta perlas es el uso de una pipeta Pasteur que se empuja a la parte inferior del tubo de vidrio con un poco de presión positiva. Una vez que la punta de la pipeta está firmemente en elparte inferior del tubo, a continuación, la muestra puede ser retirada fácilmente sin interferencia de las perlas.
    11. A la mañana siguiente, la transferencia de la muestra a un tubo de microcentrífuga sin llevar más de las bolas y colocarlo en el hielo en la preparación para el ensayo de actividad escramblasa.

2. Ensayo de la actividad escramblasa

NOTA: La intensidad de fluorescencia de liposomas o proteoliposomas diluidas con tampón A se controla con el tiempo tras la adición de ditionito en un espectrómetro de fluorescencia. Para obtener una intensidad de partida estable, la fluorescencia se registra durante al menos 50 segundos (o hasta que se consigue una señal estable) antes de la adición de ditionito a una muestra constantemente agitada y luego es seguido por al menos 500 segundos después de la adición de ditionito.

  1. Añadir 1.950 l de tampón A a una cubeta de plástico que contiene una mini barra de agitación.
  2. Añadir 50 l de la proteo preparada (liposomas) y dejar que la muestra se equilibre en el espectrofotómetro de fluorescenciametros con agitación constante durante varios segundos.
  3. Mientras tanto preparar una solución de 1 M de ditionito en 0,5 M Tris no tamponada (por ejemplo, para dos muestras pesar 20 mg de ditionito en un tubo de microcentrífuga y se disuelven en 114 l 0,5 M Tris directamente antes del uso y mantener en hielo para la siguiente enfriado en hielo muestra).
    NOTA: La solución de ditionito debe prepararse poco y no debe ser utilizado más de 20 min después de la preparación; si muchas mediciones se deben hacer, alícuotas de ditionito se pueden pesar de antemano y se disuelven justo antes de su uso.
  4. Iniciar la monitorización de la fluorescencia (excitación 470 nm, emisión 530 nm, anchura de rendija de 0,5 nm).
  5. Añadir 40 l de la solución de ditionito de 1 M a la cubeta 50 seg después de comenzar la grabación de fluorescencia (utilizar el septum en la tapa de la cámara de cubeta si es posible) y continuar registrando la fluorescencia para un 4-600 sec más.
  6. Analizar los datos tal como se describe en la sección 3.

3.Análisis de los datos

  1. Cinética de la aleatorización
    1. Caracterizar la traza de la fluorescencia de cada muestra obtenida por el ensayo de actividad escramblasa mediante la definición de la fluorescencia inicial, F i, antes de la adición de ditionito, y la fluorescencia de punto final, M, alcanzado después de> 400 seg. F i se determina para cada muestra como el valor medio de la fluorescencia para el período de 30 segundos antes de la adición de ditionito.
    2. Determinar los datos de punto final correspondientes a la extensión de la reducción de fluorescencia, R = 100 • F / F i. Usamos los términos R L para los liposomas libres de proteínas y R P para proteoliposomas que contiene opsina.
  2. Determinar el peso molecular de la reconstituidas funcionalmente escramblasa
    1. Convertir los datos de reducción de la fluorescencia de acuerdo con la siguiente ecuación:
      p (≥1 escramblasa) = (R P - R L) / (R max - R L) (Ecuación 1)
      NOTA: ¿Dónde R max es la reducción máxima que se obtiene cuando la proteína suficiente se reconstituye de manera que todas las vesículas de la muestra poseen al menos un escramblasa funcional, y p es la probabilidad de que una vesícula particular en una muestra reconstituida se "activa escramblasa-', es decir, que posee al menos un escramblasa funcional. El valor de R L es típicamente 45%, mientras que 3 R max es típicamente 82,5% 3, en lugar del 100% esperado (R puede ser determinado experimentalmente para proteoliposomas opsina con un PPR de> 1 mg / mmol max). Como R max <100%, se supone que una subpoblación de las vesículas es refractario a la reconstitución. Para R max = 82,5%, la fracción de vesículas que no puede aceptar la proteína es 0,35.
    2. Describir la relación entre p (≥1 escramblasa) y PPR (mg de proteína / fosfolípido mmol) por las estadísticas de Poisson de la siguiente manera:
      p (≥1 escramblasa) = 1 - e NOTA: En caso de m = número de scramblases por vesículas y α = constante ajuste mono-exponencial en unidades de mg de fosfolípidos proteína / mmol.
    3. Como una fracción de las vesículas no contribuye a la aleatorización incluso a alta PPR (véase la discusión), modificar la ecuación a:
      p (≥1 escramblasa) = 1 - exp (-PPR * / α) (Ecuación 3)
      NOTA: En caso de PPR * = PPR / (1- f), donde f es la población de vesículas refractaria o, en este caso, PPR * = PPR / 0,65 (Ecuación 4).
      NOTA: La constante de ajuste α se determina mediante el ajuste de un gráfico de p (≥1 escramblasa) versus PPR * con una función mono-exponencial. Si opsina (peso molecular 41,7 kDa) reconstituye funcionalmente en vesículas de 175 nm de diámetro (cada vesícula tiene 280.000 fosfolípidos 26) como un monómero, alfa = 0,187 mg mmol -1. Si opsina dimerizes antes de la reconstitución 3 para producir vesículas escramblasa-activo, entonces α= 0,37 mg mmol -1. Si en lugar de PPR PPR * iban a ser utilizados para el análisis, a continuación, los valores alfa correspondiente sería 0,122 y 0,244 mg mmol -1. Estos valores predichos para α asumen que todas las moléculas de opsinas son funcionalmente competente. Si sólo una fracción de las moléculas es competente para codificar los lípidos, a continuación, los valores correspondientes de α será más grande.

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Representative Results

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Se describe la reconstitución de la opsina en LUVs para caracterizar su actividad escramblasa usando un ensayo basado en fluorescencia. Se analizan los resultados para establecer un límite inferior de la tasa de fosfolípidos mediada opsina codificación y para determinar el estado en el que oligomérica opsina reconstituye funcionalmente en las vesículas.

Para identificar las condiciones óptimas de la reconstitución, es necesario determinar empíricamente la cantidad de detergente que se debe utilizar para engrosar las LUVs de modo que son receptivos a la inserción de la proteína. Tal experimento se ilustra en la Figura 2A. Las alícuotas de POPC: LUV POPG son tratados con diferentes cantidades de DDM durante 3 horas y la absorbancia de la muestra se mide a 540 nm, una medida de la turbidez y por lo tanto del tamaño de la vesícula. La densidad óptica medida a 540 nm (OD 540) gráfico muestra que las vesículas se hinchan como DDM concentración se incrementa 4-6 mM, alcanzar un punto de saturación a alrededor de 7 mM antes de comenzar a solubilizar (correspondiente a la pérdida de turbidez y la señal de OD 540) como DDM se incrementa aún más. NBD-PC se añade después de que el tratamiento con detergente y las muestras se incubaron adicionalmente durante una hora antes de ser tratado con perlas de poliestireno para eliminar el detergente. La distribución transbicapa de NBD-PC se determina midiendo la pérdida de fluorescencia después de la adición de ditionito a las vesículas (como se describe más arriba). Por lo tanto, NBD-PC se inserta en el prospecto exterior de las vesículas en ausencia de detergente, indicado por su completa accesibilidad a ditionito. Para vesículas tratadas con> DDM 2 mM, NBD-PC es capaz de distribuir simétricamente en ambas valvas de modo que una vez que se elimina DDM 50% de la NBD-PC está protegido de ditionito.

La figura 2B muestra un experimento de desestabilización de la reconstitución similar (redibujado de la referencia 2 </ Sup>), esta vez el seguimiento de la reconstitución de la opsina. En este experimento se puede ver que mM DDM 7 es necesaria para la reconstitución opsina tal que NBD-PC se convierte cuantitativamente (> 80%) accesible a ditionito como resultado de la opsina mediada por aleatorización.

Figura 2
Figura 2:. Reconstitución de NBD-PC y la opsina en vesículas detergentes desestabilizado (A) Las alícuotas de las vesículas se tratan con una gama de concentraciones de detergente (0-9 mM) mediante la mezcla de extremo a extremo durante 3 horas a temperatura ambiente . Al final del periodo de incubación se mide la absorbancia de las muestras a 540 nm (línea de color negro). A continuación se añade NBD-PC (disuelto en 0,1% w / v DDM) y la muestra se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente antes de que el detergente se elimina por tratamiento perlas de poliestireno. Los liposomas resultantes se analizan por el fluor ensayo de reducción de escent (línea roja) para determinar el grado en que NBD-PC se reconstituye de forma simétrica. (B) Como en (A) pero en este vesículas experimento forma a partir de fosfolípidos de huevo (PC de huevo / ácido fosfatídico de huevo, 9: 1 mol / mol) se desestabilizó con DDM, y se añadió opsina junto con NBD-PC, lo que resulta en una reducción de la fluorescencia de aproximadamente 80% una vez que la proteína se reconstituye de manera eficiente y capaz de facilitar la codificación de NBD-PC (modificado de referencia 2). Aunque NBD-PC se reconstituyó simétricamente en DDM 2 mM, las condiciones ideales para la reconstitución de la opsina se eligieron alrededor del pico de OD 540 absorbancia, es decir, el punto en el que las vesículas eran altamente hinchado debido a detergente intercalado, pero aún no solubilizado (indicado por la flecha). Para POPC / POPG (9: 1 mol / mol) vesículas, una concentración de 8 mM DDM se encontró que era óptima, tanto para NBD-PC y reconstitución opsina./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El grado de reducción de la fluorescencia aumenta con la cantidad de opsina utilizada para la reconstitución. La figura 3A muestra trazas de fluorescencia obtenidas en la adición de ditionito de NBD-PC-que contiene liposomas libres de proteínas (rastros de negro) y proteoliposomas reconstituidos con opsina en diferentes proporciones de proteína a fosfolípidos (PPR, en unidades de mg de proteína por fosfolípidos mmol, rastros rojos); las trazas se han normalizado por lo que todos ellos tienen la misma fluorescencia inicial (F i) valor para la visualización más fácil. ataques monoexponencial de las trazas indican las constantes de tiempo muy similares, que van desde 20 hasta 25 s; como la tasa de reducción NBD-PC ditionito mediada en liposomas libres de proteínas es la misma que en los proteoliposomas, sólo es posible colocar una estimación más baja de la tasa de opsina mediada aleatorización (ver text para más detalles). La Figura 3B muestra los datos analizados obtenidos de los ensayos de reducción de la fluorescencia para producir tramas de p (≥1) escramblasa (la probabilidad de una vesícula que tiene al menos un escramblasa) frente a la peste de pequeños rumiantes medida experimentalmente (relacionado con PPR * como se discutió anteriormente). La comparación de la forma monoexponencial de los resultados experimentales en ataques hipotéticas correspondientes a opsina se reconstituye como una presentación de monómero, dímero o tetrámero que opsina reconstituye funcionalmente como un dímero.

figura 3
Figura 3:. Escramblasa actividad de opsina trazas (A) de fluorescencia correspondientes a ditionito tratamiento de vesículas reconstituidas con cantidades NBD-PC y opsina que oscilan entre 0 a 4,95 g, se indica por la cuña. La cantidad más baja de opsina reconstituida corresponde a un PPR de 0,21 mg / mmol, lasegunda cantidad más alta de 0,43 mg / mmol y la cantidad más alta de 1,3 mg / mmol, 10 o opsinas por vesículas en promedio. Ditionito se añadió a la hora indicada (flecha) y la fluorescencia NBD fue supervisado por un 400 s suplementarios. El grado máximo de reducción de fluorescencia visto en este experimento fue de 85% mientras que la media de muchos experimentos es del 82,5%. (B) la dependencia de proteínas de aleatorización. Los datos de experimentos similares a panel A se analizaron usando la estadística de Poisson para generar un gráfico de la probabilidad de vesículas que tienen al menos un escramblasa (p ≥1 escramblasa) frente a la proteína a fosfolípido (PPR) de las vesículas (proteína se cuantificó post- reconstitución mediante análisis de Western Blot 3 y fosfolípido se determinó mediante la medición de fosfato inorgánico liberado en la hidrólisis ácida). La línea roja representa un ajuste mono-exponencial de los datos; las líneas grises discontinuas representan ajustes mono-exponencial para la reconstitución de la opsina en 170 nm de diámetro vesicles como monómeros, dímeros preformados o tetrámeros preformadas. A medida que el eje x representa la peste de pequeños rumiantes medido experimentalmente (en lugar de PPR * (véase el texto principal)), las constantes de ajuste corresponden a peste de pequeños rumiantes en lugar de PPR * Valores, como se explica en el texto principal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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El ensayo de actividad escramblasa nos permitió originalmente para determinar que la opsina tiene actividad escramblasa fosfolípido 2. El ensayo también nos permitió caracterizar la actividad escramblasa de opsina por evaluación de la especificidad (se utilizó una variedad de lípidos reportero marcados con NBD tales como NBD-fosfatidiletanolamina, marcado con NBD en una cadena de acilo como se muestra para NBD-PC en la Figura 1A, o en el grupo de cabeza, NBD-esfingomielina o NBD- fosfatidilserina 2), el efecto de la composición lipídica de la vesícula (por ejemplo, el colesterol en diferentes cantidades como constituyente de la vesícula), y si los diferentes estados conformacionales de la opsina y la rodopsina actividad todos muestran escramblasa. Estos análisis revelaron que la actividad escramblasa de rodopsina es muy rápido (> 10.000 fosfolípidos por segundo), no específico para el fosfolípido e independiente de estado conformacional de la rodopsina o si contiene o no su cromóforo retinal 2,3. Aquí,presentamos un método detallado para generar proteoliposomas que contienen opsina y demostramos cómo ensayar estas preparaciones para la actividad escramblasa fosfolípido.

El protocolo de reconstitución descrito está optimizado para la composición de lípidos dado y para la reconstitución de la opsina después de que se purificó por cromatografía de afinidad usando DDM como detergente solubilizante. La composición de los lípidos, así como el detergente puede ser cambiado de acuerdo a las necesidades del experimentador, aunque las condiciones de reconstitución ideales para condiciones alteradas tienen que ser determinado mediante la realización de la "hinchazón-experimento" que se describe en la Figura 2. DDM es empíricamente bien adaptado para el mantenimiento de la opsina en condición estable y activo. Sin embargo, otros detergentes tales como octil-β-glucósido, CHAPS o Triton X-100 se pueden utilizar siguiendo los protocolos similares. Triton X-100 es un detergente ampliamente usado para la reconstitución de unión a ATP transportadores de casete (transportadores ABC) como su efficiency en la mediación de la reconstitución de la membrana es mayor que de otros detergentes y también tarda menos tiempo para equilibrar con liposomas preformados 24.

Es posible determinar el estado oligomérico de la opsina funcionalmente reconstituida si se obtiene el grado de reducción fluorescente para muestras reconstituidas con diferentes cantidades de opsina, es decir, en un intervalo de proporciones de proteína a fosfolípidos (PPR). Con el fin de hacer esto, la peste de pequeños rumiantes de las vesículas reconstituidas debe ser medido de forma explícita como la recuperación de proteínas y fosfolípidos pueden variar. la recuperación de fosfolípidos se puede determinar por el ensayo de fosfato descrito en la sección 1.2, mientras que la recuperación de proteína se puede estimar por análisis Western Blot cuantitativo en el que las proteínas purificadas utilizadas para reconstituciones se utilizan para generar una curva de calibración que permite la comparación de la recuperación de muestras reconstituidas a través el rango de PPR probado (como se explica en detalle en la referencia 3).

El ensayo de actividad de escramblasa se basa en la suposición de que ditionito de no penetrar en las vesículas. Este punto puede ser verificada mediante atrapando un reportero NBD marcado soluble dentro de las vesículas y la determinación de si se puede reducir por ditionito. Para este propósito, NBD-glucosa (12,6 mM añadido después de la desestabilización de la vesícula) se utiliza en lugar de NBD-PC. Esta molécula soluble en agua queda atrapada dentro de los proteoliposomas una vez que las vesículas se sellan y por lo tanto deben ser protegidos de ditionito. Para hacer que el NBD-glucosa totalmente accesible para la reducción, se puede añadir Triton X-100 (1% w / v) que luego se traduce en reducción del 100% 3,27.

Los proteoliposomas pueden caracterizarse para verificar que la reconstitución tanto de la lípido reportero y proteína es simétrica. El anterior se logra mediante experimentos de desactivación colisional utilizando iones yoduro mientras que el segundo se basa en una estrategia de protección de la proteasa usando la proteasa que AspNcorta en un sitio específico cerca de la C-terminal de la opsina 3.

La transición de la fluorescencia inicial (F i) determinados en el ensayo de actividad escramblasa para el punto final de fluorescencia (F) es compleja, pero para nuestros propósitos se puede aproximar razonablemente por una sola función de decrecimiento exponencial. La constante de tiempo asociada con el decaimiento exponencial (20 seg) es aproximadamente la misma para los liposomas inactivos y, proteoliposomas activo que contiene opsina-que indican que aleatorización se produce tan rápido o más rápido que la velocidad a la que el fluoróforo NBD se reduce en ditionito. Así, el ensayo de actividad escramblasa tiene una resolución de tiempo pobre (limitado por ditionito de la química de reducción), que actualmente sólo permite la clasificación de los mutantes en activo, muy lento o inactivo. Esta clasificación podría ser visto por el escramblasa regulada por calcio TMEM16 27: a altas niveles de Ca 2+, la disminución de la fluorescencia reveló una constante de tiempo similar al del that visto en liposomas libres de proteínas, lo que indica que el paso limitante es la reducción química de la NBD-fluoróforo por ditionito de lípidos de aleatorización. Por el contrario, a bajos niveles de Ca 2 + no se alcanzó el estado de equilibrio de la reducción de fluorescencia después de 900 seg, por lo que es posible distinguir entre los dos componentes cinéticos, uno asignado a la reducción de ditionito de la valva exterior y el más lento a la exposición de NBD-lípidos internos lóbulos, al exterior.

La discrepancia entre la pérdida de 100% del valor teórico de la fluorescencia en ditionito tratamiento de vesículas preparadas con alta PPR (Figura 1C) frente a la realidad experimental donde es difícil exceda ~ reducción del 85% (Figura 3A) sugiere que una fracción de las vesículas es refractario de la reconstitución. Esta fracción podría corresponder a vesículas que el sello temprana durante el proceso de reconstitución como detergente es adsorbido en las perlas de poliestireno y sonPor lo tanto, ya no es capaz de recibir la proteína. Para el análisis se describe en la sección 3, se asumió que esta población refractaria corresponde a una fracción f de las vesículas totales. Si asumimos que la mitad de las moléculas de NBD-PC (la piscina de NBD-PC en el exterior prospecto) en las vesículas refractarios está disponible para ditionito de reducción, a continuación, calculamos f = 2 • (1 - R max / 100), o 0,35 cuando R max = 82,5%.

De montaje de p (≥1 escramblasa) versus PPR * datos con una ecuación de mono-exponencial ofrece la α constante en forma, de la que es posible determinar si la opsina reconstituye funcionalmente como un monómero o dímero, o una mezcla de estados incluyendo multímeros de orden superior . La interpretación de estos resultados se complica si una fracción de moléculas de opsina no puede funcionar en aleatorización. Si bien esto es poco probable dada las condiciones en las que se purifica opsina que garantizan que conserva toda su proteína Gactividades del receptor, un valor de α que corresponde a la inserción funcional de dímeros también podrían interpretarse como la inserción funcional de monómeros a partir de una preparación de opsina donde la mitad de las proteínas son inactivos como scramblases. Un punto adicional a considerar es que el análisis que se presenta supone que las vesículas utilizadas para la reconstitución son homogéneos en tamaño. En realidad, las vesículas tienen una gama de diámetros que se caracterizan por una distribución Gaussiana con una desviación estándar correspondiente a aproximadamente un tercio del diámetro medio. Afortunadamente, el resultado del análisis de p (≥1 escramblasa) versus PPR * datos no se ve afectada significativamente por la consideración de la heterogeneidad de vesículas y por lo que el análisis simple que presentamos es suficiente para describir los datos.

Una posible limitación de los métodos que hemos descrito es que el procedimiento de gran intensidad de trabajo no permite mediciones de alto rendimiento de un número muy elevado de muestras de unand que la heterogeneidad de vesículas podría perturbar la lectura. El primer problema podría superarse mediante el uso de un formato de placa de microtitulación para el ensayo escramblasa; el segundo podría resolverse en el futuro por medio de ensayos de vesículas individuales mediante microscopía TIRF.

El ensayo para medir la actividad ditionito escramblasa puede considerarse como muy fiable y robusta una vez que se establecen los procedimientos de desestabilización y reconstitución. Un enfoque alternativo para cuantificar el transporte transmembrana de los fosfolípidos, que también permite la verificación de los resultados obtenidos a partir del ensayo de ditionito, es retro-extracción de de cadena corta NBD-lípidos desde el exterior prospecto de las vesículas utilizando graso bovino libre de ácidos albúmina de suero 22. Back-extracción, así como el ensayo de ditionito también se han empleado para caracterizar e identificar flipasas de las ATPasas de tipo P4 y transportadores ABC 28-33.

A medida que las herramientas que aquí se presentan se pueden adaptar fácilmente de acuerdo con diferent necesita los procedimientos descritos son versátiles y ayudarán en la identificación y caracterización de scramblases de fosfolípidos en el futuro. El aprendizaje de la identidad de muchos de estos, incluyendo la de la escramblasa necesaria para la expansión de las membranas biógenas durante el crecimiento celular es de importancia fisiológica máxima.

Para obtener información adicional y la descripción detallada de análisis de datos, se recomienda acudir a las publicaciones anteriores de nuestro laboratorio 2-4,27, así como otros 22,25,28,30.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

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References

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Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad
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Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

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