We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.
Scramblases traslocano fosfolipidi attraverso il doppio strato di membrana bidirezionale in modo ATP-indipendente. Il primo scramblase per essere identificati e biochimicamente verificato è stato opsin, la apoprotein della rodopsina fotorecettori. Rhodopsin è un recettore accoppiato alla proteina G localizzato in rod fotorecettori membrane a disco della retina dove è responsabile per la percezione della luce. Attività scramblase di Rhodopsin non dipende dal suo ligando 11- cis -retinal, cioè, il opsin apoprotein è anche attivo come scramblase. Sebbene fosfolipidi costitutiva e regolato scrambling svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare, solo pochi scramblases fosfolipidi sono stati identificati finora oltre opsin. Qui si descrive un saggio di fluorescenza a base di attività di scramblase opsin. Opsina viene ricostituito in grandi liposomi unilamellari composti di fosfatidilcolina, phosphatidylglycerol e una quantità traccia di fluorescenza NBD marcato PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-il) ammino] esanoile} – sn -glycero-3-phosphocholine). attività Scramblase è determinata misurando la misura in cui le molecole NBD-PC situati nel foglietto interno della vescicola sono in grado di accedere al foglietto esterno dove la loro fluorescenza viene eliminata chimicamente da un agente riducente che non può attraversare la membrana. I metodi che descriviamo hanno applicabilità generale e può essere utilizzato per identificare e caratterizzare le attività scramblase di altre proteine di membrana.
La rodopsina fotorecettore, un G protein-coupled receptor prototipo (recensito ad esempio in riferimento 1), è il primo scramblasi essere identificati e biochimicamente verificato 2,3. Scramblases sono trasportatori fosfolipidi che aumentano il tasso intrinsecamente lento movimento transbilayer fosfolipide a fisiologicamente livelli appropriati in un bidirezionale, modalità ATP-indipendenti 4-6. Esempi di loro azioni possono essere trovati nel reticolo endoplasmatico e batterica membrana citoplasmatica dove è necessaria scrambling costitutivo per l'omeostasi di membrana e la crescita, così come per una varietà di percorsi di glicosilazione 5. Scrambling fosfolipide regolamentata è necessaria per esporre fosfatidilserina (PS) sulla superficie delle cellule apoptotiche dove agisce come un "mangia-me" -signal per macrofagi 7 e fornisce una superficie procoagulante sulle piastrine attivate per catalizzare la produzione di fattore proteicos necessaria per la coagulazione del sangue. In membrane disco fotorecettori, l'attività scrambling di rodopsina è stato suggerito di contrastare lo squilibrio fosfolipidi tra i due volantini membrana del doppio strato che viene generato dalla ATP-dipendente, lipidi unidirezionale flippase ABCA4 4,8,9 10-12.
Nonostante l'importanza fisiologica di scramblases, la loro identità è rimasta inafferrabile fino rodopsina è stato segnalato come un scramblase nei dischi dei fotorecettori 2, i membri della famiglia di proteine TMEM16 sono stati identificati come Ca 2+ scramblases -dipendenti necessari per l'esposizione di PS a livello della membrana plasmatica (recensione in riferimento 13), e la proteina batterica FTSW stato proposto come scramblase richiesto un lipide II per la sintesi del peptidoglicano 14. Queste scoperte sono state basate sulla ricostituzione delle proteine purificate in liposomi e dimostrazione di attività scramblase nelle proteoliposomi risultanti mediante la metodologia describcato qui. Altri potenziali scramblases 15-21 – Le proteine MurJ e AMJ implicati nella biosintesi peptidoglicano, WzxE e proteine correlate implicati in rimescolando precursori O-antigene, le proteine MPRF bisogno di traslocare phosphatidylglycerol aminoacylated attraverso la membrana citoplasmatica batterica, e membri della famiglia Xkr8 che sono stati proposti esporre PS sulla superficie delle cellule apoptotiche – restano da testare biochimicamente. Questo mette in evidenza l'importanza di un saggio robusto per identificare e caratterizzare l'attività scramblase.
Qui, descriviamo la ricostituzione di opsin purificata, la apoprotein della rodopsina fotorecettore, in grandi vescicole unilamellari (luvs), e la successiva analisi dell'attività scramblase nelle proteoliposomi risultante utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Ci sono diversi protocolli ben descritto in letteratura per l'espressione eterologa e purificazione di opsin, quindi non ci saràdescriverlo in questo protocollo; usiamo i protocolli descritti nelle Goren et al. 3, che i rendimenti FLAG-tag, opsina termostabile a circa 100 ng / ml a 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).
Ricostituzione si ottiene trattando luvs con detersivo sufficiente in modo che si gonfiano, ma non si sciolgono. In queste condizioni, una proteina di membrana – fornita in forma di micelle proteina-detergente – integrerà nei liposomi e diventare ricostituito nella membrana del liposoma alla rimozione del detersivo, causando proteoliposomi. Per ricostituire opsin (ottenuto come proteina purificata nello 0,1% (w / v) DDM), luvs sono preparati da una miscela di POPC (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl- SN -glycero-3- [fosfo-rac- (1-glicerolo)]) e satura di DDM prima di aggiungere opsina e NBD-PC. Il detergente viene poi rimosso mediante trattamento del campione con perle di polistirene.
<p c lass = "jove_content"> Il principio alla base del saggio basato sulla fluorescenza è mostrato nella Figura 1B. Luvs sono simmetricamente ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC o un altro giornalista di fosfolipidi fluorescente NBD marcato (Figura 1A). In aggiunta ditionito, un non fluorescente dianione membrana impermeant, molecole NBD-PC nel foglietto esterno delle luvs sono resi come nitro-gruppo di NBD è ridotta ad un ammino-gruppo non fluorescente. Poiché né molecole NBD-PC né ditionito sono in grado di attraversare la membrana sulla scala temporale dell'esperimento (<10 min), questo si traduce in una riduzione del 50% del segnale fluorescente. Tuttavia, se i liposomi sono ricostituiti con una scramblase, molecole NBD-PC nel foglietto interno possono rimescolare rapidamente all'esterno dove vengono ridotti. Ciò comporta la perdita totale della fluorescenza nel caso ideale (Figura 1C).es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di attività scramblase Il saggio utilizza una fluorescenza NBD marcato reporter di lipidi; NBD-PC è mostrato (A). Le grandi vescicole unilamellari sono ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC. Ricostituzione produce vescicole simmetriche, con NBD-PC distribuito equamente negli opuscoli esterne ed interne. Ditionito (S 2 O 4 2-) riduce chimicamente il nitro-gruppo di NBD ad un ammino-gruppo non fluorescente. Trattamento di liposomi privi di proteine con ditionito (B, top) causa una riduzione del 50% della fluorescenza poiché solo le molecole NBD-PC nel foglietto esterno vengono ridotti: ditionito è caricato negativamente e non possono attraversare la membrana per reagire con molecole NBD-PC nel foglietto interno. Trattamento dithionite di proteoliposomi opsin contenenti (B, in basso), vale a dire, proteoliposomi scramblase-attiva, si traduce in perdita di 100% di fluorescence come opsina facilita il movimento di NBD-PC tra l'interno e il foglietto esterno. (C) mostra le tracce di fluorescenza idealizzate ottenuti sul trattamento liposomi senza proteine e proteoliposomi opsin contenenti con ditionito. Il tasso di perdita di fluorescenza è la stessa in entrambi i casi che indicano che la riduzione chimica dei NBD da ditionito è limitante, e che scrambling avviene ad una velocità uguale o superiore alla velocità della reazione chimica. Tracce ottenuti da un esperimento reale sono mostrati in figura 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
I metodi che descriviamo possono essere utilizzati per ricostituire e saggiare altre proteine purificate, nonché miscele di proteine di membrana ottenute, ad esempio, estraendo microsomi con detergente 22.
Il saggio di attività scramblase ci ha permesso inizialmente di determinare che opsin ha fosfolipidi attività scramblase 2. Il test ha anche permesso di caratterizzare l'attività scramblase di opsin testando specificità (abbiamo usato una varietà di lipidi giornalista NBD-etichettati come NBD-fosfatidiletanolamina, marcato con NBD su una catena acilica come mostrato ad NBD-PC in Figura 1A, o headgroup, NBD-sfingomielina o NBD- fosfatidilserina 2), l'effetto di vescicol…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
Dodecyl-β-d-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
LIPEX 10 mL extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
2.0 mL Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
Zetasizer | Malvern | DLS |