Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase
Summary
We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.
Abstract
Scramblases translocate פוספוליפידים ברחבי bilayer הממברנה באופן דו-כיווני בצורה ATP-עצמאית. Scramblase הראשון להיות מזוהה ומאומת ביוכימית היה opsin, את apoprotein של rhodopsin קולטי האור. Rhodopsin הוא G חלבון בשילוב קולטן מקומי ממברנות דיסק קולטי אור מוט של הרשתית שבו הוא אחראי על תפיסת האור. פעילות scramblase של Rhodopsin אינה תלויה ליגנד שלה 11- ציס -retinal, כלומר, opsin apoprotein פעיל גם scramblase. למרות פוספוליפידים מכוננים מוסדרים ערבול לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגית תא, רק כמה scramblases פוספוליפידים זוהה עד כה מלבד opsin. כאן אנו מתארים assay מבוסס קרינה של פעילות scramblase של opsin. Opsin הוא מחדש לתוך ליפוזומים unilamellar גדול המורכב phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol וכמות זכר PC שכותרתו NBD ניאון (1-palmitoyl-2- {6- [7-ניטרו-2-1,3-benzoxadiazole-4-י.ל.) אמינו] hexanoyl} – SN -glycero-3-phosphocholine). פעילות Scramblase נקבעת על ידי מדידת המידה שבה מולקולות NBD-PC ממוקמות העלון הפנימי של השלפוחית מסוגלות לגשת העלון החיצוני שבו הקרינה שלהם מתבטלת כימית על ידי סוכן צמצום שאי אפשר לחצות את הממברנה. השיטות נתאר יש תחולה כללית והוא יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין פעילויות scramblase של חלבונים בממברנה אחרים.
Introduction
Rhodopsin קולטי האור, קולטן חלבון בשילוב אבטיפוס G (הנסקרת למשל ביחס 1), הוא scramblase פוספוליפידים הראשון להיות מזוהה מבחינה ביוכימית אומת 2,3. Scramblases הם מובילי פוספוליפידים להגביר את הקצב האיטי מיסודם של transbilayer תנועה פוספוליפידים לרמות מתאימות פיזיולוגית בתוך דו-כיוונית, ATP-עצמאי באופן 4-6. דוגמאות לפעולות שלהם ניתן למצוא ב reticulum endoplasmic הממברנה cytoplasmic חיידקים שבו מכונן ערבול דרוש הומאוסטזיס וצמיחת קרום, כמו גם עבור מגוון רחב של מסלולי glycosylation 5. פוספוליפידים מוסדרים ערבול נדרשת לחשוף phosphatidylserine (PS) על פני השטח של תאים אפופטוטיים שבו היא פועלת כמו "לאכול-לי" -signal עבור מקרופאגים 7 והוא מספק משטח procoagulant על טסיות הדם מופעל כדי לזרז את הייצור של גורם חלבוןs דרוש קרישת דם. בממברנות דיסק קולטי אור, פעילות הערבול של rhodopsin הוצעה כדי לנטרל את חוסר האיזון פוספוליפידים בין שני העלונים הממברנה של bilayer כי מופק על ידי ATP תלוי, השומנים חד כיווני flippase ABCA4 4,8,9 10-12.
למרות החשיבות פיזיולוגיות של scramblases, זהותם נותר חמקמק עד rhodopsin היתה כפי שדווח scramblase דיסקים קולטי האור 2, בני משפחת חלבון TMEM16 זוהו Ca 2+ scramblases תלויי הדרושים חשיפה PS על הממברנה פלזמה (הנסקרת תוך התייחסות 13), ואת החלבון חיידקי FtsW הוצע בתור ליפידים השנייה scramblase הדרושים לסינתזת פפטידוגליקן 14. תגליות אלו התבססו על הכינון מחדש של חלבונים מטוהרים ליפוזומים והדגמה של הפעילות scramblase ב proteoliposomes וכתוצאה מכך באמצעות describ מתודולוגיהאד כאן. Scramblases פוטנציאליות נוספות 15-21 – החלבונים MurJ ו AMJ מעורב ביוסינתזה פפטידוגליקן, WzxE וחלבונים הקשורים מעורב ערבול מבשרי O-אנטיגן, חלבון MprF צריכה translocate phosphatidylglycerol aminoacylated דרך הממברנה cytoplasmic בקטריאלי, ובני משפחה Xkr8 כי הוצעו לחשוף PS על פני השטח של תאים אפופטוטיים – להישאר להיבדק ביוכימית. זה מדגיש את החשיבות של assay חזק כדי לזהות ולאפיין פעילות scramblase.
כאן, אנו מתארים את הכינון מחדש של opsin המטוהר, את apoprotein של rhodopsin קולטי האור, אל שלפוחית unilamellar הגדולה (חביב), ואת ניתוח בדיעבד של פעילות scramblase ב proteoliposomes וכתוצאה מכך באמצעות assay המבוסס-קרינה. ישנם מספר פרוטוקולים היטיבו לתאר זמינים בספרות לביטוי Heterologous וטיהור opsin, ולכן אנחנו לא לתאר את זה בפרוטוקול זה; אנו משתמשים בפרוטוקולים המתואר גורן ואח '. 3 אשר מניב FLAG-מתויג, opsin thermostable בסביבות 100 ng / μl ב 0.1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).
כינון מושג על ידי טיפול חביב עם חומר ניקוי מספיק כך שהם להתנפח אבל אינם נמסים. בתנאים אלה, חלבון הממברנה – סיפק בצורת מיצלות חלבון-דטרגנט – ישתלב ליפוזומים הופכים מחדש לתוך הממברנה ליפוזום עם הסרת חומר ניקוי, וכתוצאה מכך proteoliposomes. כדי לשקם opsin (שהושג כמו פרוטאין טהור ב 0.1% (w / v) DDM), חביבי ערוכים מתערובת של POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine) ו POPG (1- Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3- [-rac- phospho (1-גליצרול)]) ורווי DDM לפני הוספת opsin ו-PC NBD. הדטרגנט מוסר מכן על ידי טיפול המדגם עם חרוזי פוליסטירן.
<p c הילדה = "jove_content"> העיקרון שבבסיס assay הקרינה המבוססת מוצגת באיור 1B. החביבים הם מחדש באופן סימטרי עם כמות זכר-PC NBD או אחרים כתב פוספוליפידים פלורסנט NBD שכותרתו (איור 1 א). על הוספת dithionite, dianion קרום impermeant, מולקולות-PC NBD בעלון החיצוני של חביבי ניתנים ללא ניאון כמו קבוצת ניטרו של NBD מצטמצם אמינו-קבוצה ללא ניאון. כמו לא מולקולות-PC NBD ולא dithionite מסוגלים לחצות את קרום על הזמן בקנה מידה של הניסוי (<10 דק '), זו התוצאה 50% הפחתה של אות ניאון. עם זאת, אם ליפוזומים הם מחדש עם scramblase, מולקולות-PC NBD בעלון הפנימי יכולים לזחול במהירות אל מחוץ שבו הם מופחתים. זו התוצאה של אובדן מוחלט של הקרינה במקרה האידיאלי (תרשים 1C).es / ftp_upload / 54,635 / 54635fig1.jpg "/>
. איור 1: ייצוג סכמטי של assay פעילות scramblase את assay משתמשת שומנים כתבו ניאון שכותרתו NBD; NBD-PC מוצג (א). שלפוחית unilamellar גדולה הן מחדש עם כמות זכר-PC NBD. כינון מייצר שלפוחית סימטרית, עם NBD-PC מופץ באופן שווה את הכרוזים החיצוניים ופנימיים. Dithionite (S 2 O 4 2) כימי מפחית את הקבוצה נטר של NBD אל אמינו-קבוצה ללא ניאון. טיפול של ליפוזומים ללא חלבון עם dithionite (B, למעלה) גורמת ירידה של 50% של הקרינה מאז רק מולקולות-PC NBD בעלון החיצוני מופחתים: dithionite טעון שלילית ולא יכול לחצות את הממברנה להגיב עם מולקולות-PC NBD בעלון הפנימי. טיפול Dithionite של proteoliposomes המכילים opsin (B, למטה), כלומר, proteoliposomes scramblase-פעיל, התוצאות בהפסד 100% של fluorescence כמו opsin מקל תנועה של NBD-PC בין הפנימי לבין העלון החיצוני. (C) מראה עקבות קרינת אידיאליזציה מתקבלות על טיפול ליפוזומים חינם בחלבוני proteoliposomes המכיל opsin עם dithionite. שיעור הפסד קרינה הוא זהה בשני המקרים המציין כי הירידה הכימית של NBD ידי dithionite היא הגבלת קצב, וכי ערבול מתרחש בקצב שווה או גדול מהשיעור של התגובה הכימית. עקבות המתקבלות ניסוי בפועל מוצגות באיור 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
השיטות אנו מתארים ניתן להשתמש בו כדי לשקם ו assay חלבונים מטוהרים אחרים, כמו גם תערובות של חלבונים בממברנה שהושגו, למשל, על ידי מיצוי microsomes עם חומר ניקוי 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
את assay פעילות scramblase אפשרה לנו במקור לקבוע opsin שיש לו פעילות פוספוליפידים scramblase 2. את assay גם אפשר לנו לאפיין את פעילות scramblase של opsin ידי בדיקה סגולית (השתמשנו במגוון של שומנים כתב שכותרתו NBD כגון NBD-phosphatidylethanolamine, שכותרתו עם NBD על שרשרת acyl כפי שמוצג על-PC NBD באיור 1 א &#…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-d-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 mL extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 mL Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS | |
References
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
- Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an’ what’s the reason for?. ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
- Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -. L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
