Summary

リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblasesは、ATP非依存的に双方向膜二重層を横切ってリン脂質を移動さ。識別され、生化学的に検証された最初のスクランブラーゼはオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質でした。ロドプシンは、光の知覚の原因である網膜の桿体ディスク膜に局在するGタンパク質共役受容体です。ロドプシンのスクランブ活動、 すなわち 、そのリガンド11- シス -レチナールに依存しないアポタンパク質オプシンは、スクランブラーゼとしても活躍。スクランブリング構成および調節リン脂質は、細胞生理学において重要な役割を果たしているが、わずか数リンscramblasesこれまでオプシン他に特定されています。ここでは、オプシンのスクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイを記載しています。オプシンは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及び蛍光NBD標識PCの微量(1-Pで構成される大単層リポソームに再構成され、almitoyl -2- {6- [7-ニトロ2-1,3ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル} – SN -glycero -3-ホスホコリン)。スクランブラーゼ活性は、小胞の内部小葉に位置NBD-PCの分子はその蛍光が化学的に膜を通過することができない還元剤によって除去される外層にアクセスすることができる程度を測定することによって決定されます。我々が説明した方法は、一般的な適用性を有しており、他の膜タンパク質のスクランブ活動を特定し、特徴付けるために使用することができます。

Introduction

光受容体ロドプシン、(参照1、例えばレビュー)プロトタイプのGタンパク質共役型受容体は、同定され、生化学的に2,3を検証するための最初のリン脂質スクランブラーゼです。 Scramblasesは、双方向、ATPに依存しない方法4-6で二層間のリン脂質の動きに、生理学的に適切なレベルの本質的に遅い速度を向上させるリン脂質トランスポーターです。彼らの行動の例としては、小胞体および構成スクランブリングは、膜の恒常性と成長のためだけでなく、グリコシル化経路5の様々なために必要とされる細菌の細胞質膜で見つけることができます。規制リン脂質スクランブリングは、それが、マクロファージ7は、「食べる・私」-signalとして作用し、タンパク質因子の産生を触媒する活性化血小板の凝血促進表面を提供する、アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリン(PS)を露出させるために必要とされます血液凝固に必要なのです。感光ディスク膜に、ロドプシンのスクランブル活性は、ATP依存性により生成される二重層の二つの膜リーフレットの間のリン脂質の不均衡を相殺することが提案されている、一方向性脂質は、ABCA4 4,8,9 10-12フリッパーゼ。

ロドプシンは、原形質膜でのPS露出のために必要2+依存性scramblasesが(参照して見直さ2、TMEM16タンパク質ファミリーのメンバーは、Caとして同定された感光体ディスクでスクランブラーゼとして報告されるまでscramblasesの生理学的重要性にもかかわらず、彼らのアイデンティティはとらえどころのないままでした13)、および細菌タンパク質FTSWは、ペプチドグリカン合成14のために必要な脂質IIスクランブとして提案されました。これらの発見は、方法論のdescribを使用して、得られたプロテオにおけるリポソーム及びスクランブ活動のデモンストレーションで精製されたタンパク質の再構成に基づいていましたここ編。他の潜在的なscramblases 15-21 -ペプチドグリカン生合成に関与MurJとAMJタンパク質、WzxEとO抗原前駆体をスクランブリングに関与し、関連するタンパク質、細菌の細胞質膜を横切ってアミノアシル化ホスファチジルを移行することが必要なMprFタンパク質、および提案されているXkr8ファミリーメンバーアポトーシス細胞の表面上にPSを露出させるためには、 – 生化学的に試験されていません。これは、スクランブ活動を識別し、特徴付けるための堅牢なアッセイの重要性を強調しています。

ここでは、精製されたオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質、大型単層小胞(LUVを)に、蛍光ベースのアッセイを使用して、得られたプロテオリポソー​​ム内のスクランブ活動のその後の分析の再構成を説明します。いくつかのよく記載されているプロトコルは、したがって、私たちはしません、オプシンの異種発現および精製のための文献で利用可能がありますこのプロトコルでそれを記述。我々は約100ngでFLAGタグ、耐熱性オプシン得ゴーレン 3に記載されたプロトコルを使用/ 0.1%μL(w / v)のドデシルマルトシド(DDM)。

再構成は、彼らが膨潤するが溶解しないように、十分な洗剤でたLUVを処理することにより達成されます。これらの条件下では、膜タンパク質 – タンパク質 – 界面活性剤ミセルの形態で供給される – は、リポソーム内に統合し、プロテオリポソー​​ムを生じ、界面活性剤の除去時にリポソーム膜に再構成となるであろう。 (0.1%(w / v)のDDMで精製タンパク質として得られる)オプシンを再構成するために、たLUVはPOPC(1-パルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン)とPOPGの混合物(1-から調製されますパルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3- [ホスホrac-(1-グリセロール)])とオプシンとNBD-PCを追加する前に、DDMで飽和。界面活性剤は、その後、ポリスチレンビーズとサンプルを処理することによって除去されます。

<p c LASS = "jove_contentは">蛍光ベースのアッセイの基礎となる原理は、図1Bに示されています。 LUVをは対称的にNBD-PCまたは他のNBD標識蛍光リン脂質レポーター( 図1A)の微量で再構成されています。ジチオナイトを追加することで、NBDのニトロ基のような膜非透過性ジアニオン、LUVをの外側のリーフレットにおけるNBD-PC分子がレンダリングされる非蛍光は、非蛍光アミノ基に還元されます。 NBD-PC分子もジチオンいずれも実験(<10分)の時間スケールで膜を通過することができるように、これは、蛍光シグナルの50%の減少をもたらします。リポソームをスクランブで再構成されている場合は、内部リーフレットにおいてNBD-PCの分子は、それらが低減されている外部に迅速にスクランブルすることができます。これは、理想的な場合( 図1C)における蛍光の総損失をもたらします。

エス/ ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
図1:スクランブラーゼ活性アッセイの概略図アッセイは、蛍光NBD標識化レポーター脂質を使用しています;。 NBD-PCが示されている(A)。大型単層小胞は、NBD-PCの微量で再構成されています。再構成は、外側と内側のリーフレットに均等に分配NBD-PCで、対称的な小胞を生成します。亜ジチオン酸(S 2 O 4 2-)は 、化学的に非蛍光アミノ基とNBDのニトロ基を低減します。ジチオン酸は、負に帯電し、NBD-PCの分子と反応する膜を通過することはできません:外葉で唯一のNBD-PC分子が低減されるので、ジチオナイト(B、上)とのタンパク質を含まないリポソームの治療は、蛍光の50%の減少を引き起こします内側のリーフレットインチオプシン含有プロテオリポソーム(B、下)、 すなわち 、スクランブラーゼ活性のプロテオリポソーム、Fの100%損失の結果の亜ジチオン治療オプシンとしてluorescenceは、内側と外側のリーフレットの間NBD-PCの移動を容易にします。 (C)は、亜ジチオン酸でタンパク質を含まないリポソームとオプシン含有プロテオリポソームを処理して得られた理想化された蛍光トレースを示します。蛍光損失率は、亜ジチオン酸によるNBDの化学的還元は、スクランブリングは、化学反応の速度以上の速度で発生し、その律速であることを示す両方の場合で同じです。実際の実験から得られたトレースを図3に示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

我々が説明した方法は、他の精製されたタンパク質、ならびに界面活性剤22とミクロソームを抽出することにより、例えば、得られた膜タンパク質の混合物を再構成し、アッセイするために使用することができます。

Protocol

リポソームおよびプロテオリポソー​​ムの調製リポソーム生成ガラスシリンジを使用して、POPCのモル比で52.5モル脂質を得るために、丸底フラスコに(クロロホルム中、25 mg / mlで)および160μlのPOPG(クロロホルム中、25 mg / mlで)1,435μlのPOPCを追加:POPG = 9:1。 (何の水浴を溶媒のこのボリュームのために必要とされていない)145回転の回転速度で回転蒸発器を用いて…

Representative Results

我々は、蛍光ベースのアッセイを使用して、そのスクランブ活動を特徴づけるためたLUVへオプシンの再構成を説明します。私たちは、スクランブルオプシン媒介リン脂質の速度に下限を配置するとオプシンは、機能的に小胞に再構成したオリゴマー状態を決定するために、結果を分析します。 最適な再構成条件を特定す?…

Discussion

スクランブラーゼ活性アッセイは、オプシンは、リン脂質スクランブラーゼ活性2を持っているかを決定するために、もともと私たちを可能にしました。アッセイはまた、(私たちは、図1AにNBD-PCのために示すように、アシル鎖にNBDで標識されたようなNBD-ホスファチジルエタノールアミンなどのNBD標識化レポーター脂質、さまざまなを使用、または上で私たちは、特異性?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-d-maltoside  Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 mL extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 mL Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

References

  1. Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
  2. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
  3. Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
  4. Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
  5. Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an’ what’s the reason for?. ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
  6. Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
  7. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
  8. Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
  9. Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
  10. Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
  11. Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
  12. Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
  13. Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
  14. Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
  15. Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
  16. Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
  17. Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
  18. Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
  19. Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
  20. Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
  21. Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
  22. Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
  23. Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
  24. Rigaud, J. -. L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  25. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
  26. Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
  27. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
  28. Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
  29. Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
  30. Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
  31. Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
  32. Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
  33. Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).

Play Video

Cite This Article
Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

View Video