인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석
Summary
We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.
Abstract
Scramblases는 양방향 ATP 독립적 인 방식으로 막 이중층에 걸쳐 인지질을 이동시키다. 첫 번째 scramblase 식별 및 생화학, 감광체 로돕신의 아포 단백질을 옵신했다 확인합니다. 로돕신은 빛의 인식을 담당하는 망막의로드 시각 디스크 막에 지역화 G 단백질 결합 수용체이다. 로돕신의 scramblase 활동이 리간드 11- 시스 레티 날, 즉에 의존하지 않는다는 아포 단백질의 옵신도 scramblase으로 활성화됩니다. 스크램블링 구조적 및 규제 인지질 세포 생리에있어 중요한 역할을하지만, 몇 인지질 scramblases 지금까지 옵신 또한 확인되었다. 여기에서 우리는 옵신의 scramblase 활동의 형광 기반의 분석을 설명합니다. 옵신은 포스파티딜콜린, 포스파티딜 형광 NBD 표지 PC (1-P의 추적 량으로 구성된 대규모 단일 층 리포좀에 재구성almitoyl -2- {6- [7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazole -4- 일) – 아미노] – 헥사 노일} – SN -glycero -3- 포스 포 콜린). Scramblase 활성 소포의 내부 전단에 위치 NBD-PC 분자들이 형광 화학적 막을 교차 할 수있는 환원제에 의해 제거되어 외주 전단에 액세스 할 수있는 정도를 측정함으로써 결정된다. 우리는 설명 방법은 일반적인 적용을 다른 막 단백질의 scramblase 활동을 확인하고 특성화하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
감광체 로돕신 (문헌 1 예 검토)는 원형 G 단백질 – 결합 수용체가 발견되는 인지질 제 scramblase이고 생화학 2,3- 검증. Scramblases는 transbilayer 인지질 운동의 본질적으로 느린 속도를 증가 인지질 수송있는 양방향의 생리 학적으로 적절한 수준으로, ATP 독립적 인 방식 4-6. 그 동작의 예는 소포체와 항시 스크램블링은 물론 당화 경로 (5)의 다양한 멤브레인 항상성 및 성장에 필요한 박테리아 세포질 막에서 발견 될 수있다. 이 역할 여기서 규제 인지질 사멸 세포의 표면에 포스파티딜 세린 (PS)을 노출시키기 위해 필요한 스크램블링 식세포 7 – 신호 "나 먹을"단백질 인자의 생산을 촉진하는 활성화 된 혈소판에 응고 된 표면을 제공한다혈액 응고에 필요한 s의. 감광체 디스크 세포막, 로돕신의 스크램블링 활성을 ATP 의존적 단방향 지질에 의해 생성 된 이중층 두 막 전단지 간 인지질 불균형을 상쇄 제안 ABCA4 4,8,9 10-12 flippase되었다.
로돕신은 세포막에서의 PS 노출에 필요한 2+ 의존적 scramblases가 (기준 검토 (2), TMEM16 단백질 가족의 구성원이 CA로 확인되었다 광 수용체 디스크에 scramblase로보고 될 때까지 scramblases의 생리적 중요성에도 불구하고, 자신의 정체성이 애매 남아 13) 및 지질 II는 펩티도 글리 칸 합성 (14)에 필요한 scramblase으로 박테리아 단백질 FtsW 제안 하였다. 이 발견은 방법론 describ를 사용하여 결과 테오의 리포좀의 정제 된 단백질의 재구성 및 scramblase 활동의 데모를 기반으로 한여기 에드. 다른 잠재적 scramblases 15-21 – 펩티도 글리 생합성에 연루 MurJ와 AMJ 단백질, WzxE 및 관련 단백질이 O 항원 전구체를 스크램블링에 연루, MprF 단백질은 세균 세포질 막에 걸쳐 아미 노아 실화 포스파티딜를 이동시키다하는 데 필요한, 그리고 Xkr8 가족 구성원이 제안되었다 그 사멸 세포의 표면에 노출되도록 PS는 – 생화학 시험 될 남아있다. 이 식별 scramblase 활동을 특징 강력한 분석의 중요성을 강조한다.
여기서는 형광 계 분석을 이용하여 얻어진 테오에 큰 단일 층 소포 (LUVs)로 정제 옵신의 재구성, 감광체 로돕신의 아포 단백질, 및 scramblase 활동 이후의 분석을 설명한다. 이종 표현과 옵신 정화용 문학에서 사용할 수있는 몇 가지 잘 설명 프로토콜은 따라서 우리는하지 않습니다있다이 프로토콜에 대해 설명; 우리는 약 100 NG에 FLAG 태그가, 내열성 옵신 수득 고렌 외. (3)에 설명 된 프로토콜을 사용 / 0.1 %에 μL (w / v)의 dodecylmaltoside (DDM).
재구성은 팽창하지만, 용해되지 않도록 충분한 세제 LUVs 처리함으로써 달성된다. 이러한 조건 하에서, 막 단백질 – 단백질 세제 미셀의 형태로 공급이 – 리포좀에 통합되며 테오 결과 세제 분리 한 리포솜 멤브레인으로 재구성된다. (0.1 % (w / v)의 DDM으로 정제 된 단백질로서 수득) 옵신을 재구성하기 LUVs은 POPC (1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린) 및 POPG의 혼합물 (1- 제조 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- [포스 라 세미 (1 글리세롤)]) 및 옵신 및 NBD-PC를 첨가하기 전에 포화 DDM. 세제는 폴리스티렌 비드와 함께 샘플을 처리하여 제거한다.
<p c 아가씨 = "jove_content는"> 형광 계 분석의 기초가되는 원리는도 1b에 도시된다. LUVs 대칭 NBD-PC 또는 다른 NBD 형광 표지 된 인지질 기자 (도 1a)의 미량으로 재구성된다. 온산 추가에, NBD의 니트로 기와 같은 막 impermeant가 음이온은 LUVs의 외측 소엽에서 NBD-PC 분자 렌더링 비 형광 비 형광 아미노기로 환원된다. 도 NBD-PC 분자 나 온산 실험 (<10 분)의 시간 – 스케일 막을 통과 할 수있는 바와 같이, 이는 형광 신호의 50 % 감소를 초래한다. 리포좀은 scramblase로 재구성되는 경우, 내부 전단에 NBD-PC 분자들이 감소 외부로 신속 스크램블링 할 수있다. 이것은 이상적인 경우 (도 1C)에서 형광의 총 손실을 초래한다.에스 / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. 그림 1 : scramblase 활동 분석의 도식 표현은 분석은 형광 NBD 표지 기자 지질을 사용; NBD-PC가 표시된다 (A). 대형 단일 층 소포는 NBD-PC의 미량으로 재구성된다. 재구성은 외부 및 내부 전단지에 균등하게 분산 NBD-PC와 함께, 대칭 소포를 생성합니다. 온산 (S 2 O 4 2-) 화학적으로 비 형광 아미노 그룹에 NBD의 니트로 그룹을 줄일 수 있습니다. 온산 (B, 위쪽) 무 단백질 리포좀의 치료는 감소 외측 전단만을 NBD-PC 분자 보낸 형광의 50 % 감소를 일으키는 : 디티 마이너스로 하전되고, NBD-PC 분자와 반응 할 수있는 멤브레인을 통과 할 수없는 내부 전단지입니다. 옵신 함유 테오 (B, 아래)의 온산 치료 즉, scramblase 활동 테오, F의 100 % 손실 결과같은 옵신 luorescence는 내부와 외부 사이에 전단 NBD-PC의 이동을 용이하게한다. (C)는 온산과 무 단백질 리포좀 옵신 – 함유 테오 처리하여 얻어진 형광 이상화 트레이스를 나타낸다. 형광 손실률은 온산 의해 NBD의 화학적 환원 스크램블링은 화학 반응의 속도 이상인 속도로 발생하고, 그 속도 – 제한임을 나타내는 두 경우 모두 동일하다. 실제 실험에서 얻은 흔적을 그림 3에 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
우리가 설명 된 방법은 다른 단백질 정제뿐만 아니라 세제 마이크로 솜 (22)을 추출하여, 예를 들어, 얻어진 막 단백질의 혼합물을 재구성하고 분석하는데 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
scramblase 활동 분석은 옵신는 인지질의 scramblase 활동이이 결정하기 위해 원래 우리를 활성화. 분석은 또한 우리 특이성을 테스트하여 옵신의 scramblase 활성을 특성화하도록 허용 (우리는도 1a에 NBD-PC에 대해 표시 나에로 아실 체인 NBD 표지 NBD – 포스파티딜 에탄올 아민 등의 NBD 표지 된 리포터 지질의 다양한 사용 헤드 그룹, NBD-핑고 마이 엘린 또는 NBD-의 포스파티딜 2) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-d-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 mL extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 mL Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS | |
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