Summary

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblases fosfolípidos translocar através da bicamada de membrana bidireccionalmente de uma forma independente de ATP. A primeira a ser identificada scramblase bioquimicamente e verificou-se opsina, a apoproteína da rodopsina dos fotorreceptores. A rodopsina é um receptor acoplado a proteína G localizado em membranas de discos haste fotorreceptoras da retina, onde é responsável pela percepção da luz. Atividade scramblase da rodopsina não depende do seu ligando 11- cis-retinal, ou seja, a opsina apoproteína também atua como um scramblase. Embora fosfolípido constitutiva e regulada scrambling desempenhar um papel importante na fisiologia da célula, apenas alguns scramblases de fosfolípidos foram identificados até agora, além de opsina. Descrevemos aqui um ensaio baseado em fluorescência de actividade scramblase de opsina. Opsina é reconstituído em grandes lipossomas unilamelares compostos por fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol e uma quantidade traço de fluorescente marcado com NBD PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoil} – sn-glicero-3-fosfocolina). scramblase actividade é determinada medindo a extensão em que as moléculas de NBD-PC localizados no folheto interno da vesícula é capaz de aceder ao folheto exterior, onde a sua fluorescência é eliminado quimicamente por um agente de redução que não pode atravessar a membrana. Os métodos que descrevem têm aplicabilidade geral e podem ser utilizados para identificar e caracterizar as actividades scramblase de outras proteínas de membrana.

Introduction

A rodopsina dos fotorreceptores, um receptor acoplado a proteína G prototípico (revisto por exemplo, na referência 1), é a primeira scramblase a ser identificado e bioquimicamente verificada 2,3. Scramblases são transportadores de fosfolipídios que aumentam a taxa intrinsecamente lenta de transbilayer movimento fosfolipídios para fisiologicamente níveis apropriados em um bidirecional, forma ATP-independente 4-6. Exemplos de as suas acções podem ser encontradas no retículo endoplasmático e na membrana citoplasmática de bactérias, onde constitutiva de cifragem é necessária para a homeostase da membrana e crescimento, bem como para uma variedade de vias de glicosilação 5. Fosfolípido scrambling regulada é necessária para expor a fosfatidilserina (PS) sobre a superfície de células apoptóticas, onde actua como um "comer-me" -signal para macrófagos 7 e proporciona uma superfície de pró-coagulante nas plaquetas sanguíneas activadas para catalisar a produção do factor de proteínass necessário para a coagulação do sangue. Em membranas de discos fotorreceptoras, actividade de cifragem de rodopsina foi sugerido para compensar o desequilíbrio de fosfolípido entre os dois folhetos da membrana de bicamada que é gerado pelo ATP-dependente, lípido unidireccional flipase ABCA4 4,8,9 10-12.

Apesar da importância fisiológica da scramblases, a sua identidade permanecido elusivos até rodopsina foi reportado como um scramblase em discos fotorreceptoras 2, membros da família de proteínas TMEM16 foram identificados como de Ca2 + dependentes de scramblases necessários para a exposição de PS na membrana plasmática (revisto em referência 13), e a proteína bacteriana FTSW foi proposto como um lípido II scramblase necessária para a síntese do peptidoglicano 14. Estas descobertas basearam-se na reconstituição de proteínas purificadas em lipossomas e demonstração de actividade scramblase nas proteolipossomas resultante utilizando a metodologia described aqui. Outros potenciais scramblases 15-21 – as proteínas MurJ e AMJ implicados na biossíntese dos peptidoglicanos, WzxE e proteínas relacionadas implicada na cifragem precursores de O-antigénio, proteína MprF necessário para translocar fosfatidilglicerol aminoacilado através da membrana citoplasmática de bactérias, e membros da família Xkr8 que têm sido propostos para expor PS na superfície de células apoptóticas – continuam a ser testado bioquimicamente. Isso destaca a importância de um ensaio robusto para identificar e caracterizar a atividade scramblase.

Aqui, nós descrevemos a reconstituição de opsina purificada, a apoproteína da rodopsina de fotorreceptores, em vesículas unilamelares grandes (LUV), e a análise subsequente da actividade de scramblase nas proteolipossomas resultantes usando um ensaio baseado em fluorescência. Existem vários protocolos descritos poços disponíveis na literatura para a expressão heteróloga e purificação de opsina, portanto, não serádescrevê-lo neste protocolo; usamos os protocolos descritos em Goren et ai. 3 que produz FLAG-tag, opsina termoestável a cerca de 100 ng / ul em 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

A reconstituição é conseguida por tratamento com LUV detergente suficiente para que elas incham mas não se dissolvem. Sob estas condições, uma proteína de membrana – fornecido na forma de micelas de detergente-proteína – irá integrar-se os lipossomas e tornar-se reconstituída para a membrana do lipossoma após a remoção de detergente, resultando em proteolipossomas. Para reconstituir opsina (obtido na forma de uma proteína purificada em 0,1% (w / v) DDM), LUV são preparados a partir de uma mistura de POPC (1-palmitoil-2-oleoyl–sn-glicero-3-fosfocolina) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl–sn-glicero-3- [fosfo-rac- (1-glicerol)]) e saturou-se com DCM antes de adicionar opsina e NBD-PC. O detergente é então removido por tratamento da amostra com contas de poliestireno.

<p c lass = "jove_content"> O princípio subjacente ao ensaio baseado em fluorescência é mostrado na Figura 1B. LUV são simetricamente reconstituída com uma quantidade vestigial de NBD-PC ou outro fosfolípido repórter fluorescente NBD-rotulado (Figura 1A). Por adição de ditionito, um dianião de membrana-impermeabilizante, moléculas de NBD-PC na monocamada externa dos LUV são tornadas não-fluorescente como a nitro-grupo de NBD é reduzido a um grupo amino não-fluorescente. Como nem moléculas NBD-PC nem ditionito são capazes de atravessar a membrana sobre a escala de tempo da experiência (<10 minutos), o que resulta em redução de 50% do sinal de fluorescência. No entanto, se os lipossomas são reconstituídos com uma scramblase, moléculas de NBD-PC no folheto interno pode precipitação rapidamente para o exterior, onde eles são reduzidos. Isso resulta na perda total de fluorescência, no caso ideal (Figura 1C).

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. Figura 1: Representação esquemática do ensaio de actividade scramblase O ensaio utiliza um repórter lípido marcado com NBD fluorescente; NBD-PC é mostrado (A). As grandes vesículas unilamelares são reconstituídos com uma quantidade vestigial de NBD-PC. Reconstituição produz vesículas simétricas, com NBD-PC distribuído igualmente nos folhetos exteriores e interiores. Ditionito de (S 2 O 4 2-) quimicamente reduz o grupo nitro de NBD para um grupo amino não-fluorescente. Tratamento de lipossomas livres de proteínas com ditionito (B, parte superior) provoca uma redução de 50% da fluorescência uma vez que apenas as moléculas de NBD-PC na monocamada externa são reduzidas: ditionito é carregada negativamente e não pode atravessar a membrana para reagir com as moléculas de NBD-PC no folheto interno. Tratamento ditionito de proteolipossomas contendo opsina (B, parte inferior), isto é, proteolipossomas scramblase-activo, resulta em perda de 100% do Fluorescence como opsina facilita o movimento de NBD-PC entre o interior e o folheto externo. (C) mostra vestígios de fluorescência obtidos idealizadas no tratamento de lipossomas livres de proteínas e proteolipossomas contendo opsina com ditionito. A taxa de perda de fluorescência é o mesmo em ambos os casos, indicando que a redução química de NBD por ditionito é limitante da taxa, e que o embaralhamento ocorre a uma velocidade igual ou maior do que a velocidade da reacção química. Traços obtidos a partir de um experimento real são mostrados na Figura 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os métodos que descrevem pode ser utilizado para a reconstituição e ensaio de outras proteínas purificadas, bem como misturas de proteínas de membrana obtida, por exemplo, por extracção com detergente 22 microssomas.

Protocol

1. Preparação dos lipossomas e proteolipossomas Formação de lipossomas Usando uma seringa de vidro, adiciona 1435 ul POPC (25 mg / ml, em clorofórmio) e 160 ul POPG (25 mg / ml, em clorofórmio) para um balão de fundo redondo para se obter 52,5 umol lípidos numa razão molar de POPC: POPG = 9: 1. Secam-se os lípidos para 30 min, utilizando um evaporador rotativo a uma velocidade de rotação de 145 rpm (sem banho de água é necessária para este volume de solvente), e depois transf…

Representative Results

Descreve-se a reconstituição de opsina em LUV para caracterizar a sua actividade scramblase usando um ensaio baseado em fluorescência. Analisamos os resultados para colocar um limite inferior na taxa de fosfolípido mediada por opsina cifragem e para determinar o estado oligomérico em que opsina reconstitui funcionalmente para as vesículas. Para identificar as condições óptimas de reconstituição, é necessário deter…

Discussion

O ensaio de atividade scramblase permitiu-nos inicialmente para determinar que opsina tem actividade scramblase 2. O ensaio também permitiu-nos caracterizar a actividade scramblase de opsina por meio de testes de especificidade (foi utilizada uma variedade de lípidos repórter NBD-rotulados como NBD-fosfatidiletanolamina, marcado com NBD em uma cadeia de acilo, tal como mostrado para NBD-PC na Figura 1A, ou na headgroup, NBD-esf ingomielina ou NBD- fosfatidilserina 2), o efeito d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-d-maltoside  Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 mL extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 mL Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

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Cite This Article
Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

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