Abstract
Die Entwicklung von Biomaterialien erhöht signifikant das Potential für eine gezielte Arzneimittelabgabe an eine Vielzahl von Zell- und Gewebetypen, einschließlich den pankreatischen β-Zellen. Darüber hinaus Biomaterial Partikel, Hydrogele und Gerüste bieten auch eine einzigartige Gelegenheit, steuerbaren Medikamentenabgabe aufrechterhalten, zu verabreichen zu ß-Zellen in Kultur und transplantierte Gewebe-Modelle. Diese Technologien ermöglichen die Untersuchung der Kandidaten β-Zell-Proliferation Faktoren intakte Inseln und translational relevanten System. Außerdem β-Zell - Proliferation in einem Kultursystem die Wirksamkeit und Durchführbarkeit der Kandidatenbestimmungsfaktoren für die Stimulierung ist von entscheidender Bedeutung vor uns auf in - vivo - Modellen zu bewegen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zusammenarbeit Kultur intakte Maus Inselchen mit biologisch abbaubaren Verbindung von Interesse (COI) beladene Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) Mikrokugeln für die Zwecke der die Auswirkungen der anhaltenden Bewertung der in - situ - Freisetzung of mitogenen Faktoren auf β-Zellproliferation. Diese Technik beschreibt im Detail, wie PLGA-Mikrokügelchen zu erzeugen, um eine gewünschte Ladung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien enthält. Während die beschriebene Technik rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) als Beispiel verwendet wird, könnte eine Vielzahl von COI ohne weiteres verwendet werden. Zusätzlich verwendet dieses Verfahren 96-Well-Platten, die Menge der Reagenzien zu minimieren, notwendig, β-Zellproliferation zu beurteilen. Dieses Protokoll kann ohne weiteres auf die Verwendung des alternativen Biomaterialien und anderen endokrinen Zelleigenschaften angepasst werden, wie das Überleben von Zellen und Differenzierungsstatus.
Introduction
Pancreatic β-Zellen sind die einzigen Insulin-produzierenden Zellen im Körper und sind kritisch Blutzucker Homöostase aufrechtzuerhalten. Während gesunde Individuen ausreichend β-Zellmasse aufweisen und Funktion richtig Blutzucker, Personen mit Diabetes durch unzureichende β-Zellmasse charakterisiert und / oder Funktions 1,2 regulieren. Es ist vorgeschlagen worden , dass β-Zell - Proliferation induzierende letztlich β-Zellmasse erhöhen und Glukose - Homöostase bei Patienten mit Diabetes 3 wieder herzustellen. Allerdings Evaluierung und Validierung von potentiellen β-Zell-proliferative Verbindungen in intakten Inseln ist notwendig, bevor wirksame Therapien entwickelt werden können. Die Transplantation von menschlichen Kadaver Inseln in Personen mit Diabetes stellt Blutzucker-Homöostase für einige Zeit, aber die Verfügbarkeit und den Erfolg dieses experimentellen Verfahrens wird durch einen Mangel an menschlichen Inselchen für Transplantation und von ß-Zelltod in den kleinen Inseln achtern behinderter Transplantation 4. Selbst mit der Entdeckung von Faktoren , die die Vermehrung von Insulin-produzierenden Zellen zu induzieren, eine große Herausforderung noch existiert , diese Faktoren zu den relevanten Stellen in vivo zu liefern. Eine Strategie für eine nachhaltige lokale Auslieferung von β-Zellen-proliferative Verbindungen ist Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA). PLGA hat eine Geschichte der Verwendung in FDA Drug - Delivery - Produkte zugelassen seiner hohen Sicherheit durch, die biologische Abbaubarkeit und erweiterte Freisetzungskinetik 5. Insbesondere ist PLGA ein Copolymer aus Lactid und Glycolid , das mit Wasser durch Hydrolyse abgebaut wird entweder in vivo oder in Kultur zu Milchsäure und Glykolsäure, die natürlich Metaboliten im Körper auftreten. Die verkapselte Wirkstoff-Verbindung kann sowohl durch Diffusion und / oder Abbau gesteuerte Freisetzungsmechanismen in die Umgebung freigesetzt werden. Verkapselung von COI bietet Schutz vor enzymatischem Abbau, die Verbesserung der Bioverfügbarkeit des Reagens gegenüber unencapsulated COI 5. Wir schlagen vor , dass PLGA - Mikrokügelchen verwendet werden können Kandidatenverbindungen auf intakte Inseln in Kultur zu verabreichen, und letztlich in vivo. Testen der Wirksamkeit von PLGA β-Zell - Mitogene zu verabreichen vivo zu Inselchen ex ist kritisch , vor der Transplantation Protokolle untersucht werden.
Derzeit gibt es keine Technik, β-Zellproliferation in lebenden Tieren zu messen. Experimente Wirksamkeit potenzieller proliferative Verbindungen in vivo zu beurteilen , daher Verabreichung dieser Verbindungen erfordern Tiere zu leben, mit anschließender Trennung und Verarbeitung von Bauchspeicheldrüsen für Immunmarkierung. Solche Protokolle sind teuer und mühsam, und erfordern die Verbindung systemisch verabreicht werden, ohne Garantie, dass sie die Inseln zu erreichen. Umgekehrt sind einige immortalisierte β-Zelllinien für die Untersuchung von Insulin-produzierenden Zellen in Kultur zur Verfügung, aber diese Zellinien fehlt das islet Architektur und environment gefunden in lebenden Organismen 6. Immortalisierte β-Zelllinien sind auch als mit einem viel höheren Grad an Replikations als endogene β-Zellen in vivo charakterisiert, wodurch Analyse von Verbindungen komplizieren die Proliferation induzieren. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, das intakte Inseln, isoliert aus erwachsenen Mäusen verwendet. Im Gegensatz zu β-Zelllinien behalten intakte Inseln normale Inselarchitektur. Ebenso reduziert im Gegensatz zu Experimenten in vivo durchgeführt, Verabreichen proliferative Verbindungen direkt mit kultivierten intakte Inseln signifikant die Menge an Reagenzien , die genau erforderlich ist , um β-Zell - Proliferation zu messen.
Die vorliegende Studie verwendet PLGA ein COI, in diesem Beispiel rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) zu verabreichen. Das hier beschriebene Verfahren verleiht einen signifikanten Vorteil gegenüber der Verabreichung von rohen Verbindung zu kultivierten Inseln, wie es für eine kontinuierliche Freisetzung der Verbindung in th erlaubte Medien. Bemerkenswert ist, kann dieser Assay eine Vielzahl von Proteinen und Antikörpern von Interesse intakte Inseln zu verabreichen, werden modifiziert. Auswirkungen auf andere endokrine Zelltypen, einschließlich α-Zellen, ebenfalls analysiert werden.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und durchgeführt.
1. Labeling COI mit Fluorophore (Optional)
- Wähle einen fluoreszierenden Farbstoff, der mit einer freien primären Amin (beispielsweise auf einem Protein), wie beispielsweise Succinimidylester oder Fluorescein - Derivate reagieren, Mikrokügelchen Ladung zu visualisieren. Auflösen 8x molarer Überschuß (bezogen auf Mol COI) von Fluorophor in 200 ul Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Resuspendieren von 50 mg COI bis zu einem Endvolumen von 800 ul in einem Fahrzeug-Lösung (Endkonzentration von 62,5 ng / ul). Die Trägerlösung wird in Abhängigkeit von der Quelle des COI variieren.
HINWEIS: Typische Fahrzeuglösungen umfassen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder DMSO. - Fügen Sie alle Fluorophor / DMSO-Lösung aus Schritt 1.1 und resuspendieren COI. Vortex über Nacht bei 4 ° C. Alternativ vortexen der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur(RT) für 4 Stunden.
- Im Anschluss an die Markierungsreaktion überschüssiges Fluorophor eine Entsalzungs Spalte.
- Drain-Speicherpuffer von Entsalzungssäule und spüle mit 16 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Entsorgen Sie durch alle fließen.
- Fügen Sie die fluoreszenzmarkierten COI an die Entsalzungssäule. Eluieren mit 1,2 ml VE-Wasser und sammeln durch den Fluss.
- Wiederholen Sie Elutionsschritt zusätzlich viermal, das Hinzufügen jedes Mal 1,2 ml VE-Wasser und die Strömung durch als getrennte Probe zu sammeln.
- Gefriert alle gesammelten Strömung durch Proben bei -80 ° C lyophilisieren und gemäß den Anweisungen des Herstellers für 24 Std.
2. COI belasteten Microsphere Herstellung über die Wasser-in-Öl-in-Wasser - Emulsion Solvent Evaporation Method
- 1 mg des fluoreszenzmarkierten COI zu 100 ul entionisiertem Wasser die erste Wasserphase (W1) zu bilden.
- Man löst 65 mg Poly (milch-co-glykol acid) (50:50 Lactid: Glycolid, Molekulargewicht 54.000 - 69.000) in 750 & mgr; l Dichlormethan in einem Reaktionsgefäß. Ultrasonicate für 10 bis 30 s (bei 160 W), um vollständig den PLGA aufzulösen. Dies bildet die Ölphase (O).
- In allen der W1-Phase erzeugt in Schritt 2.1 auf die O-Phase in einer tropfenweise Art und Weise. Verwendung eines handgehaltenen Homogenisator bei 20.000 rpm für 30 sec Emulgieren der W1 / O-Phase zu bilden.
- Fügen alle der W1 / O-Phase in eine tropfenweise Art und Weise zu 15 ml einer 1% (Gewicht / Volumen) wässrigen Poly (vinylalkohol) (PVA) -Lösung und Emulgieren für 30 sec unter Verwendung eines handgehaltenen Homogenisator bei 20.000 rpm .
- Übertragen die Emulsion erzeugt in Schritt 2.4 in einen 200-ml-Rundkolben und unterliegen einer 635 mm Hg Vakuum am Rotationsverdampfer für 1 Stunde unter Verwendung des Lösungsmittels und erzeugen die wässrige Phase zu entfernen.
- Aliquot 1 ml der wässrigen Phase erzeugt, in Schritt 2,5 bis vierzehn Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der wässrigen Lösung in die Mikrozentrifugenröhrchen bei 7.500xg für 8 min.
HINWEIS: Bei diesem Schritt werden die Mikrokügelchen in der verbleibenden wäßrigen Lösung und sind mit dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens eingeengt. - Vorsichtig 900 ul der wässrigen Lösung aus den mit einer Mikropipette Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen, Pipettieren, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören.
- Waschen Sie die Mikrokügelchen von überschüssigem PVA durch Zugabe von 1 ml Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen entionisiert. Zentrifuge bei 7.500 × g für 8 min und wieder vorsichtig 900 ul einer wässrigen Lösung von den Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mikropipette, Pipettieren zu entfernen, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören.
ANMERKUNG: Die restlichen 100 & mgr; l wässrige Lösung enthält, die erzeugten Mikrokugeln.
- Waschen Sie die Mikrokügelchen von überschüssigem PVA durch Zugabe von 1 ml Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen entionisiert. Zentrifuge bei 7.500 × g für 8 min und wieder vorsichtig 900 ul einer wässrigen Lösung von den Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mikropipette, Pipettieren zu entfernen, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören.
- Fixieren Sie die wässrigen Mikrokügelchen Lösung erzeugt in Schritt 2.7 bei -80 ° C.
- Lyophilisieren Mikrokugeln mit einem Lyophilisator Verwendung nach HerstellerAnweisungen und bei -20 ° C.
HINWEIS: Messen Beladungseffizienz des COI durch vollständiges Auflösen von PLGA - Mikrokügelchen und die Proteinkonzentration relativ zu einer Standardkurve des freien Proteins 7 zu bestimmen. - Als negative Kontrolle, eine Charge von "leeren" Mikrokugeln erzeugen (im Folgenden als Steuermikrokugeln bezeichnet).
HINWEIS: Die Erzeugung von Steuermikrokugeln ist identisch zu der Erzeugung von hydrophilen COI-beladenen Mikrosphären, ohne COI zusätzlich zu 800 ul der Trägerlösung in Schritt 1.2. Spiel Steuer Partikel in Massenkonzentration von PLGA in Bezug auf COI belasteten PLGA-Mikrokügelchen für β-Zellen-Mitogen-Assay.
3. Herstellung von Islet Kultur, Medien und Pre-Test Medien
- Bereiten 200 ml Medium für die Kultur von intakten Maus Inselchen: RPMI 1640 Medium mit 11 mM Glukose supplementiert, 10% Pferdeserum, 100 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin (nachstehend als istlassen Kulturmedien).
Anmerkung 1: Im Gegensatz zu fötalem Rinderserum (FBS), Pferdeserum fehlt Plazentalaktogen, ein Induktor von β-Zellproliferation, die Analyse in dem Proliferationsassay confounds.
ANMERKUNG 2: Wenn die PLGA-Mikrokugeln nicht sterilisiert werden vor der Verwendung, die Zugabe von Antibiotika zu den Kulturmedien von entscheidender Bedeutung mikrobiologische Verunreinigungen zu vermeiden. - Entfernen 25 ml islet Kulturmedien mit einer elektronischen Pipettiervorrichtung und in einem 50 ml konischen Röhrchen. Ergänzen die 25 ml islet Kulturmedien in der 50 ml konischen Röhrchen mit einer Endkonzentration von 0,2 mM EGTA die Vorassay-Medien zu erzeugen.
HINWEIS: Die Zugabe von EGTA leicht lockert Zell-Zell-Kontakte in den kleinen Inseln ohne Inselarchitektur zu verändern. Dies hilft, die COI sicherstellen können, die inneren Zellen der Insel zu erreichen und hilft Nekrose der zentralen Insel zu verhindern.
4. Die Anzucht von Intact Maus Inselchen
- Isolieren intakter Inseln aus einem vorher ausgewählten Stamm, Geschlecht, age und Genotyp der Mäuse nach einer Routine Kollagenaseverdau des Pankreas 8,9. Pool zusammen Inseln aus wie Proben.
- Aliquot 40 Inselchen in eine Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte in 200 ul islet Kulturmedien. Optisch Größe-Spiel Inseln pro Vertiefung (eine genaue Beurteilung der Insel equivalency (IEQ) zwischen den Proben ist nicht erforderlich). Füllen Sie leere Brunnen unmittelbar neben Brunnen mit kleinen Inseln mit 200 & mgr; l sterilem Wasser eine Verdampfungspuffer zur Verfügung zu stellen. Kultur Inselchen in Medien über Nacht bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO 2.
5. Wieder Suspension von COI-geladen und die Kontrolle von PLGA Microspheres
- Nachdem über Nacht islet Erholung resuspendieren Mikrokügelchen durch Zugabe Vorassay-Medien zu einem Aliquot von lyophilisiertem COI belasteten PLGA-Mikrokügelchen, so dass die Endkonzentration von COI in dem Reaktionsgefäß beträgt 10 ng / & mgr; l (die Menge des COI in einer gegebenen Menge an die erzeugten microssphäre wurde in Schritt 2.9) bestimmt. Beschallen die resuspendierten COI-beladenen Mikrokügelchen in einem Eiswasserbad für 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C.
- Resuspendieren Steuer PLGA-Mikrokugeln durch Zugabe des gleichen Volumens Vorassay-Medien zu einer gleichen Masse von lyophilisierten Kontroll PLGA-Mikrokügelchen. Beschallen die resuspendierten Steuer PLGA-Mikrokügelchen in einem Eiswasserbad für 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C.
- Optisch bestätigen Mikrokugeln durch Pipettieren von 2 ul resuspendiert Mikrokugeln zwischen zwei Glasplättchen verteilt sind. Visualisieren Mikrokugeln mit einem 40X-Objektiv auf einem Epifluoreszenz oder Hellfeldmikroskop verwendet wird.
- Wenn eine nennenswerte Aggregation von Mikrosphären ist noch sichtbar, beschallen in einem Eiswasserbad für weitere 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C und repeat Visualisierung resuspendiertes Mikrokugeln.
6. Behandlung von Inselchen mit COI-geladen oder Steuer PLGA Microspheres </ P>
- Für jede Vertiefung mit COI-beladenen Mikrosphären behandelt werden, Assaymedium herzustellen, indem man die 10 ng / & mgr; l der resuspendierten COI-Mikrokügelchen mit bereits Testmedium auf ein Endvolumen von 100 & mgr; l und einer vorbestimmten Endkonzentration verdünnt wird.
HINWEIS: Die optimale Endkonzentration des Proteins wird für jeden COI für diesen Assay verwendet, variieren. Idealerweise werden eine Reihe von Endkonzentrationen getestet. - Für jede Vertiefung als Kontrolle verwendet werden, Steuerassaymedium herzustellen, indem die resuspendierten Steuer PLGA-Mikrokügelchen Verdünnung in Schritt 5.2 mit dem gleichen Verdünnungsvolumen erzeugten verwendet 6.1 Die COI-beladenen Mikrosphären in Schritt zu verdünnen.
HINWEIS: Islets behandelt mit Kontrollassaymedium wird als negative Kontrolle dienen Erfassung irgendeiner Wirkung zu ermöglichen, die leere Mikrokugeln auf die experimentellen Ergebnisse haben können. - Entfernen Sie vorsichtig 100 ul der Inselkulturmedien aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette, so dass keine kleinen Inseln aus den Vertiefungen verdrängt werden. fügen Sie vorsichtig 100 μl Assaymedium oder 100 & mgr; l Kontrollassaymedium zu jeder Vertiefung.
- Inkubieren Inselchen bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO 2 für drei Tage.
7. Dispergierwerkzeuge Intact Inselchen auf Objektträger
- Nach drei Tagen mit einer Mikro verwenden, um sorgfältig Testmedien aus allen Vertiefungen entfernen und zu entsorgen, um nicht-Inseln zu entfernen. fügen Sie vorsichtig 200 ul PBS zu Inselchen sie der Testmedien zu waschen. Entfernen Sie vorsichtig und PBS mit einer Mikropipette zu verwerfen und sanft Inseln wieder mit einem zusätzlichen 200 & mgr; l PBS waschen.
- Entfernen und entsorgen PBS mit einer Mikropipette und fügen 100 ul 0,025% Trypsin, 2 mM EDTA-Lösung. 3 min bei RT inkubieren. Pipettieren Inselchen in der Trypsin-EDTA-Lösung nach oben und unten je 2 min bis Inseln werden visuell in einzelne Zellen dispergiert und bestätigt werden (beachten Sie, dass einige kleine Klumpen von Zellen noch vorhanden sein können) mit einem Lichtmikroskop. Übertragen Sie das gesamte Volumen jeder Vertiefung einzelnerly in labeled- Mikrozentrifugenröhrchen.
- In 400 ul der Inselkulturmedien zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen, die Trypsin-vermittelte Zell-Dissoziation zu stoppen.
- Zentrifuge Proben für 5 min bei 100 × g bei 4 ° C Inselzellen auf den Boden des Mikrozentrifugenröhrchen zu pelletieren.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand einer Mikropipette und Pellet in 200 ul frische Inselkultur-Medien.
- Unter Verwendung eines Zyto-Zentrifuge, distanzierte Zentrifuge Inseln bei 140 × g für 3 min auf geladene Objektträger.
- Luft trocknen Dias bei RT für 10 min, ziehen dann einen Rahmen um die dissoziierte Inselchen mit einem hydrophoben Markierungsstift.
- Fix-Zellen mit 75 & mgr; l 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 10 min. Entfernen Sie die 4% PFA und vorsichtig waschen Zellen in 75 & mgr; l PBS zweimal. Nach dem Waschen permeabilisieren Zellen mit 75 & mgr; l 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min. Dann waschen Sie die Zellen mit 75 & mgr; l PBS.
Achtung: PFA ist bekannt, allergen, krebserregend und giftig. 8. Immunofluoreszenz Kennzeichnung von Dissociated Inselchen für Insulin und die Zellproliferation Marker, Ki67 - Bereiten Sie eine feuchte Kammer durch zwei nasse Handtücher in den Boden einer 100 Dia Kapazität Objektträger Box platzieren.
- Die Objektträger flach nach unten (Zellen nach oben) in der feuchten Kammer. Vorbereiten Proben für die Markierung durch die PBS aus dem vorhergehenden Waschschritt Aspirieren einer Mikropipette und Zugabe von 75 & mgr; l Blockierlösung (5% normalem Eselserum (NDS) in PBS) zu jeder Folie zu blockieren unspezifische Bindung von Antikörpern an den Proben. Inkubiere Objektträger in Lösung für 1 Stunde bei RT blockiert.
- enthält Meerschweinchen-anti-Insulin und Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörpern, verdünnt auf 1 & mgr; g / ml in 5% NDS in PBS vorsichtig absaugen Lösung unter Verwendung einer Mikropipette blockieren und 75 & mgr; l primärer Antikörper-Lösung hinzu. für 1 h bei RT inkubiert.
HINWEIS: Alternative Marker der Zellproliferation umfassen wuchernden cell nuclear antigen (PCNA) und Phosphohistone H3 (PH 3), - vorsichtig absaugen primären Antikörper-Lösung mit einer Mikropipette und spülen Sie die Zellen mit 75 & mgr; l PBS. Absaugen PBS mit einer Mikropipette und spülen Zellen zwei Mal mit je 75 & mgr; l PBS. Inkubieren jede Probe mit 75 & mgr; l anti-Meerschweinchen-Cy5 sekundären Antikörper und Anti-Kaninchen sekundären Antikörpers Cy3 bis 2 & mgr; g / ml verdünnte Lösung für 1 h bei RT in blockieren.
HINWEIS: Verwenden Sie mit dem gleichen oder spektral überlappende Fluorophore markierte Antikörper verwenden, die bereits verwendet wurde, um die Mikrokugeln beschriften nicht zweitrangig. - Absaugen sekundären Antikörper-Lösung mit einer Mikropipette und Inkubation in 75 & mgr; l von 300 nM DAPI in PBS für 3 min bei RT mit. Absaugen DAPI mit einer Mikropipette und spülen Sie in VE-Wasser für 5 min.
- Vorsichtig absaugen Wasser aus Proben mit einer Mikropipette. Spot eine Tropfen (etwa 100 ul) von schnelltrocknend Befestigungslösung verblassungshemmenden Reagenz auf einem Deckglas enthält. Kehren Sie die Mikroskop-Objektträger Probenseite nach unten, onde Montagelösung. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas gegen den Schieber eine Pipettenspitze mit Blasen zu entfernen und überschüssige Flüssigkeit mit einem weichen Reinigungstuch abwischen. Erlauben Deck über Nacht bei RT trocknen.
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer angeschlossenen Kamera zur Bildaufnahme. Für jeden Fluorophor, bestimmen die optimale Belichtungszeit (in der Regel 20 msec für DAPI, 40-80 msec für Insulin und 250 msec für Ki67). Sicherzustellen Bildaufnahmeparameter für alle Proben gleich sind.
- Für jede Probe zählen manuell 3000 Insulin-positiven Zellen und derer zählen, wie viele sind auch Ki67-positiv. Nur zählen Insulin-positive Zellen, die eine gut definierte und deutlich sichtbaren Kern haben. Der prozentuale Anteil proliferierender β-Zellen für jede Probe durch die Anzahl der Ki67-positiv / Insulin-positive Zellen durch die Gesamtzahl von Insulin-positiven Zellen Dividieren und Multiplizieren mit 100.
- Nach determining den Prozentsatz für jede Probe β-Zellen von proliferierenden, festzustellen, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied in Proliferations β-Zellen zwischen Kontroll- und experimentellen Proben vorhanden ist, indem Ergebnisse mit einer Einweg-ANOVA unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software statistischen Analyse.
9. Bildaufnahme und Analyse
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Representative Results
Figur 1 ist eine visuelle Darstellung der Mikrokugeln unter Verwendung des obigen Protokolls erzeugt. Das hier beschriebene Protokoll ergibt rhCTGF beladenen Mikrokügelchen in verschiedenen Größen. Der größte Teil der Mikrokügelchen zwischen 1 und 10 & mgr; m im Durchmesser sein, obwohl einige Mikrokugeln kann größer (Abbildung 2). Falls gewünscht, können Mikrokügelchen eine Größe basierend auf Herstellungsparameter abgestimmt und optimiert werden , wie beispielsweise Homogenisierung Geschwindigkeit und Zeit, Tensidkonzentration eingesetzt, und die relativen Volumina jeder Wasser / Öl / Wasser - Phase 10.
Folgende Verteilung von intakten Inseln behandelt mit PLGA - Mikrokugeln und anschließender Immunmarkierung ist es üblich , Bereiche der Probe zu sehen , ohne jede Kennzeichnung in zwischen den Zellen (Abbildung 3). Während die meisten der Mikrokügelchen, die noch intakt, nachdem die Kultur Behandlungsdauer sind,während der Waschschritte entfernt wird, bleiben einige nachdem die Inseln auf den Objektträger gesponnen werden. Diese Mikrokugeln verursachen die lochartigen Strukturen während der Bildgebung sichtbar gemacht. Diese Restmikrokügelchen typischerweise nicht stören anschließende Quantifizierung.
Nach der Bebilderung kann der Prozentsatz der Ki67-positiv / Insulin-positive Zellen durch manuell die Gesamtzahl der markierten Zellen quantifiziert werden oder unter Verwendung von Analyse-Software-Image. Bisher haben wir gezeigt , dass rekombinante humane Bindegewebe - Wachstumsfaktor (rhCTGF) Maus β-Zellproliferation in intakten Inseln ex vivo 11 stimulieren kann. Mit dem oben genannten Protokoll erzielten wir PLGA-Mikrokügelchen enthält rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Behandlung von intakten Inselchen mit rhCTGF-PLGA-Mikrokügelchen für 3 Tage in einem ähnlichen Anstieg der Proliferation β-Zellen führte, wie zuvor mit der rohen Protein berichtet, die zeigen, dass das Protein nicht lo tat se jede Funktionalität während der Mikrosphären Generation (Abbildung 4).
Abb . 1: Die visuelle Darstellung von PLGA Microspheres Durch einen Fluoreszenzfarbstoff in den Herstellungsprotokoll enthält, kann PLGA - Mikrokügelchen mit einem Epifluoreszenz - Mikroskop sichtbar gemacht werden. Maßstabsbalken entspricht 200 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2: Größenverteilung von PLGA Microspheres Obwohl Größenverteilung variieren kann, werden die meisten Mikrokügelchen weniger als 10 & mgr; m im Durchmesser.arget = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Immunfluoreszenz - Visualisierung von Dispersed Proliferierendes β-Zellen Verstreute Inseln sind für den Proliferationsmarker Ki67 (rot) und Insulin (grün) immun β-Zellen vermehren zu markieren. Nuclei sind mit DAPI (blau) markiert. Die Pfeile zeigen die Ki67-positive / Insulin-positiven Zellen. Sternchen (*) zeigen unabgebaut Mikrokugeln. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Quantifizierung und Analyse von β-Zell - ProProliferation. Inselchen mit unterschiedlichen Mengen an rhCTGF-PLGA - Mikrokügelchen behandelt. Die Anzahl der Ki67-positiv / Insulin-positiven Zellen wurde manuell von allen Proben gezählt und als Prozentsatz der Gesamtzahl von Insulin-positiven β-Zellen exprimiert. X-Achse entspricht der Endkonzentration von rhCTGF in jeder Behandlung. statistische Signifikanz wurde durch Tukey-Mehrfachvergleichstest folgte mit einem one-way ANOVA bestimmt. Die statistische Signifikanz wurde bei p ≤ 0,05 festgelegt. Die Fehlerbalken stellen die Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Studie der β-Zellproliferation in Kultur wird typischerweise durch mehrere Schwierigkeiten behindert. Zunächst verewigt β-Zelllinien werden durch höhere Grad der Proliferation gekennzeichnet als das, was in endogenen β-Zellen in lebenden Inseln zu finden ist. Außerdem fehlt diesen immortalisierten Zelllinien die normale Architektur kritisch für die normale β-Zellfunktion. Diese beiden Tatsachen machen es schwierig , zu bestimmen , ob die Resultate mit dem verewigte β-Zelllinien erhalten wird wahr halten , wenn sie in vivo oder in vollständigen Inseln getestet. Unsere beschriebenen Protokoll, die frisch isolierten intakten Maus Inselchen verwendet, umgeht diese Probleme , wie die Insel Architektur beibehalten und β-Zellproliferation ist vergleichbar mit der in vivo gefunden.
Ein signifikantes Problem, wenn intakte Inseln Züchten ist die Möglichkeit, die Zellen innerhalb des Insel Kern wird Hypoxie-induzierter Nekrose unterziehen oder nicht an rhCTGF ausgesetzt werden. Aus diesem Grund wird eine abschließendeKonzentration von 0,1 mM EGTA wird den Medien hinzugefügt Kontakte Zell-Zell ohne Unterbrechung islet Architektur zu lösen. Wir haben früher veröffentlicht , dass die Zugabe von EGTA allein β-Zell - Proliferation steigern, vermutlich aufgrund der erhöhten Zugang von Nährstoffen und Mitogene in den Medien zur islet Kern 12. Die Zunahme der β-Zellproliferation als Antwort auf EGTA könnte auch zur Abnahme der Zell-Zell - Kontakt selbst 13,14 fällig. Die Medien in diesem Protokoll beschrieben ist auch mit Pferdeserum anstelle des traditionellen fötalem Rinderserum. Diese Substitution wird aufgrund des Vorhandenseins von Plazentalaktogen in fötalem Rinderserum hergestellt, die β-Zellproliferation auf eigene stimulieren, potentiell Analyse komplizieren im Proliferationstest.
Bestimmung der relativen Toxizität der PLGA-Mikrokugeln (mit oder ohne die COI) auf die Inselzellen können durch Immunofluoreszenz-Analyse von ma beurteilenrkers von Zelltod oder DNA - Schäden, einschließlich TUNEL oder γ-H2AX 15,16. Obwohl die Zugabe von PLGA - Mikrokügelchen wurde ex vivo keine offensichtlichen schädlichen Auswirkungen auf kleinen Inseln gezeigt, sollten die Nutzer der Auswirkungen bewusst sein , die Mikrokugeln auf die Bildanalyse haben. Wie in Figur gezeigt , 3 und im Ergebnisteil erwähnt, können nicht abgebauten Mikrokugeln als dunkle Flecken in Immunofluoreszenz - Bilder offensichtlich sein, mit Mikrokugeln auftritt , wenn steigende Konzentrationen verwendet werden.
Es sollte beachtet werden, daß das beschriebene Protokoll zugeschnitten wurde mit isolierten Maus-Inselzellen zu arbeiten. Als solches ist es unklar, ob identischen Bedingungen mit kleinen Inseln funktionieren alternative von Organismen geerntet, wie Ratte und Mensch. Bemerkenswert ist , geerntet Inseln aus verschiedenen Organismen oft unterschiedliche optimale Kultivierungsbedingungen und unterschiedliche Grade der β-Zellen - Proliferation 17,18 haben.
Zahlreiche biomaterials sind potentiell verfügbar rhCTGF zu isolierten Inseln, einschließlich Poly (Thioketal-urethan) und Poly (Propylensulfid) 19 zu verabreichen. Wir wählten aufgrund einige bemerkenswerte Eigenschaften auf PLGA zu konzentrieren, die sie besitzt. Erstens ist PLGA ein relativ erschwinglich Reagenz und die Mikrokügelchen können mit Standardausrüstung (Zentrifuge, Homogenisator, lyophilizer) in den meisten Forschungseinrichtungen erzeugt werden. PLGA ist ein künstliches Polymer , das Präzedenzfall für den erfolgreichen Einsatz in der FDA zugelassene Geräte aufgrund ihrer Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit hat, und seine Fähigkeit , Raten Verbindung Release 20 zu modulieren. PLGA abbaut durch Hydrolyse in Gegenwart von Wasser, seine Ladung in dem Verfahren freigesetzt wird. Die chemische Zusammensetzung der PLGA - Teilchen kann so zugeschnitten werden , dass eine Verbindung , die in vivo über einen Zeitraum von mehreren Wochen freigesetzt wird. PLGA hat auch in präklinischen Tierversuchen und klinischen Therapien lokal verabreichen Verbindungen zu den verschiedenen Organen und tissu verwendet wordenes 21,22. Andere hydrophobe Polymere können auch bei der Erzeugung von biologisch abbaubaren Mikrokugeln verwendet werden. Diese Polymere können auf bestimmte Umweltstimuli reagieren, wie beispielsweise pH, der Temperatur und der Gegenwart reaktiver Sauerstoffspezies 23,24. Daher sollten die Forscher sorgfältig überlegen, welche Biomaterial für ihre Studien am geeignetsten ist.
Jeder Forscher Verwendung PLGA oder anderen Biomaterialien, zu studieren β-Zell - Proliferation ex vivo sollte zwischen den Wirkungen von verkapselten COI bewusst Potentialunterschiede im Vergleich zu nicht verkapselten COI. So könnte beispielsweise die Lieferung von rhCTGF über PLGA ändern, den Grad der Zeitsteuerung und der β-Zellproliferationsinduktion im Vergleich zur Behandlung mit nicht eingekapseltem Protein. Laufende Studien in unserem Labor untersuchen derzeit diese Potentialdifferenzen.
Die Analyse der β-Zellproliferation in kultivierten Inselchen ist ein leistungsfähiges Modell für die Identifizierung und mestischen Ablauf Analyse von β-Zellen-Mitogene. Mit dem beschriebenen Test zeigen wir hier eine relativ schnelle und kostengünstige Methode zur Herstellung eines COI zu isolierten kultivierten Inseln mit einer verlängerten Freisetzung Lieferfahrzeug zu verwalten. Dieser Test sollte auf fast jedem COI von Interesse, und unsere Wahl zu konzentrieren sich auf CTGF ist lediglich auf der Grundlage seiner bisher veröffentlichten Fähigkeit zur Stimulierung β-Zell - Proliferation in vivo und ex vivo 11 anwendbar sein. Darüber hinaus kann dieser Test die Wirksamkeit und Sicherheit der Verwendung von PLGA als Verabreichungsmethode zu validieren, bevor Modelle voran, wo Inseln in lebenden Organismen transplantiert werden. Insgesamt bietet das beschriebene Protokoll eine neue Art und Weise Verbindungen zu kultivierten Inseln mit einem breiteren Auswirkungen zu verwalten auf die Sicherheit von PLGA zu transplantierbaren Gewebes zu messen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
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