Protocol
नोट: प्रक्रिया कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक अन्यथा नोट। तापमान नियंत्रित इन्क्यूबेटरों मक्खी पालन के लिए तापमान को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया और पार जब तक अन्यथा नोट कर रहे हैं।
1. तैयारी
- मक्खियों तैयार करें।
- oocyte संग्रह prometaphase समृद्ध।
- स्पष्ट वयस्क स्वस्थ, युवा शेयर या पार संस्कृतियों से मक्खियों। 25 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए उम्र की बोतलें।
नोट: आम तौर पर दो स्वस्थ बोतलें पर्याप्त होगा, हालांकि अधिक कुछ पार संस्कृतियों के लिए आवश्यक हो सकता है। - दो दिनों के बाद, बोतलों से ~ 100 से 300 महिलाओं (जो इस बिंदु पर 0 से 2 दिन पुराने हैं) इकट्ठा। महिलाओं कुंवारी होने की जरूरत नहीं है। खमीर पेस्ट का एक थपका एक शीशी के पक्ष में जोड़े और 30 महिलाओं और 10 से 15 yeasted शीशियों में पुरुषों के प्रत्येक जगह है। 25 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए उम्र शीशियों।
- स्पष्ट वयस्क स्वस्थ, युवा शेयर या पार संस्कृतियों से मक्खियों। 25 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए उम्र की बोतलें।
- Metaphase समृद्ध Oocyte संग्रह।
- ~ 100 से 300 शेयर या पार संस्कृतियों से महिलाओं लीजिएतों। एक शीशी के पक्ष में खमीर पेस्ट का एक थपका जोड़ें और 30 महिलाओं को जगह प्रत्येक yeasted शीशियों में (कोई पुरुषों के साथ जोड़ा)। 25 डिग्री सेल्सियस पर तीन से पांच दिनों के लिए उम्र शीशियों।
- oocyte संग्रह prometaphase समृद्ध।
- समाधान तैयार करें।
नोट: समाधान, कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता जब तक अन्यथा नोट।- संशोधित रॉब के बफर तैयार (5x): 500 मिमी HEPES, 500 मिमी सुक्रोज, 275 मिमी सोडियम एसीटेट, 200 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 50 मिमी ग्लूकोज, 6 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, और 5 मिमी कैल्शियम क्लोराइड। 7.4 पीएच को लाने के लिए पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड: 8 सोडियम हाइड्रोक्साइड: 10 एन 11 का प्रयोग करें। निस्पंदन द्वारा जीवाणुरहित; आटोक्लेव नहीं है। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। पिघलना के रूप में 1x रॉब के प्रति oocyte प्रस्तुत करने के 200 मिलीलीटर तैयार करने ~ की जरूरत है।
- फिक्सेशन समाधान।
- विकल्प # 1: formaldehyde / हेपटैन निर्धारण तैयार करें। फिक्सेशन बफर तैयार: 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) से अधिक 150 मिमी सुक्रोज। का उपयोग करने के लिए, 687.5 μl निर्धारण बफर और 312.5 μl 16% formaldehyde के साथ नए सिरे से बनानाoocyte प्रस्तुत करने का प्रति।
चेतावनी: एक धूआं हुड में formaldehyde समाधान का उपयोग करते समय दस्ताने पहनें। संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार कचरे के निपटान। - # 2 विकल्प: formaldehyde / cacodylate निर्धारण तैयार करें। फिक्स मिश्रण तैयार: 250 मिमी सुक्रोज, 100 मिमी पोटेशियम एसीटेट (7.5 पीएच), 25 मिमी सोडियम एसीटेट (7.0 पीएच), और 25 मिमी EGTA (8.0 पीएच)। का उपयोग करने के लिए, 400 μl के साथ नए सिरे फिक्स मिक्स कर, 100 μl पोटेशियम cacodylate (1 एम, पीएच 7.2), और 500 oocyte प्रस्तुत करने का प्रति μl 16% formaldehyde।
चेतावनी: पोटेशियम cacodylate आर्सेनिक होता है।
- विकल्प # 1: formaldehyde / हेपटैन निर्धारण तैयार करें। फिक्सेशन बफर तैयार: 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) से अधिक 150 मिमी सुक्रोज। का उपयोग करने के लिए, 687.5 μl निर्धारण बफर और 312.5 μl 16% formaldehyde के साथ नए सिरे से बनानाoocyte प्रस्तुत करने का प्रति।
- 1x पीबीएस प्लस 1% या 0.05% ट्राइटन X-100: पीबीएस / ट्राइटन X-100 तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- 1x पीबीएस, (डब्ल्यू / वी) 0.5% बीएसए, और 0.1% बीच 20: पीबीएस बीच 20-गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) (PTB) तैयार करें। एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता।
- प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण (मछली) समाधान में।
- तैयार 20X सोडियम क्लोराइड सोडियम साइट्रेट (एसएससी): 3 एम सोडियम क्लोराइड और 0.3 एम सोडियम साइट्रेट।
- तैयार 2x एसएससी-बीच -20 (SSCT): 2x एसएससी प्लस 0.1% बीच 20। ताजा, ~ 20 oocyte प्रस्तुत करने का प्रति मिलीलीटर बनाओ।
- formamide समाधान तैयार: 2x एसएससी, 0.1% बीच 20, प्लस formamide। ताजा बनाओ, 1 मिलीलीटर 20% formamide, 0.5 मिलीग्राम 40% formamide, और oocyte प्रस्तुत करने का प्रति 2 मिलीलीटर 50% formamide।
चेतावनी: एक धूआं हुड में formamide समाधान का उपयोग करते समय दस्ताने पहनें। संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार कचरे के निपटान। - 2x एसएससी, 50% formamide, और 10% dextran सल्फेट (v / डब्ल्यू): संकरण समाधान तैयार है। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- मछली जांच।
- आदेश ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (दृश्यों के लिए 1 टेबल देखें) एचपीएलसी शुद्धि के साथ और 5 'फ्लोरोसेंट संशोधन (जैसे, Cy3 या Cy5) वांछित। 50 एनजी / μl पर Tris EDTA (ते) में Resuspend।
नोट: सभी समय पर प्रकाश जोखिम से ओलिगोस को सुरक्षित रखें।
- आदेश ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (दृश्यों के लिए 1 टेबल देखें) एचपीएलसी शुद्धि के साथ और 5 'फ्लोरोसेंट संशोधन (जैसे, Cy3 या Cy5) वांछित। 50 एनजी / μl पर Tris EDTA (ते) में Resuspend।
2. देर चरण ड्रोसोफिला oocytes के संग्रह
- जैसा
- कार्बन डाइऑक्साइड के साथ सब ~ 100 से 300 yeasted मक्खियों anesthetize और एक ब्लेंडर युक्त ~ 100 मिलीलीटर 1x रॉब के बफर में जोड़ें। पल्स तीन बार (~ 1 सेकंड प्रत्येक)। के लिए रॉब के दशक में oocytes रखें <20 मिनट के सक्रियण से बचने के लिए।
नोट: वैकल्पिक रूप से, oocytes महिलाओं से हाथ से विच्छेदित किया जा सकता है। इस पद्धति का लाभ यह है कि यह कम महिलाओं की आवश्यकता है। हालाँकि, ध्यान केवल कुछ ही मिनट के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के लिए निवेश की सीमा हाइपोक्सिया 7 के साथ जुड़े कलाकृतियों से बचने के लिए लिया जाना चाहिए।- बड़े जाल (~ 1,500 माइक्रोन) 250 मिलीलीटर बीकर में के माध्यम से फिल्टर बड़े शरीर के अंगों को दूर करने के लिए। कई बरकरार पेट फिर जाल, फिर से पीस सामग्री अतिरिक्त रॉब के बफर का उपयोग, और फिल्टर पर बने हुए हैं। व्यवस्थित ~ 2 मिनट चलो, तो शीर्ष परत बंद aspirate, संभव के रूप में बड़े शरीर के अंगों के रूप में कई को हटाने।
- फाईएक 250 मिलीलीटर बीकर में छोटे मेष (~ 300 माइक्रोन) के माध्यम से lter। पहले बीकर अतिरिक्त रॉब की और लेपित पाश्चर pipet का उपयोग कर के बाहर शेष oocytes कुल्ला। बसने ~ 3 मिनट करते हैं; oocytes बाहर समझौता होगा। महाप्राण बंद सभी लेकिन ~ 10 मिलीलीटर।
- 10 मिलीलीटर के रूप में ज्यादा के रूप में डालो लेपित 5 मिलीलीटर ट्यूब में फिट होगा। , व्यवस्थित तरल निकालने, और शेष के साथ दोहराएँ। अतिरिक्त रॉब की और लेपित पाश्चर pipet का उपयोग बीकर के बाहर शेष oocytes कुल्ला। ~ के लिए 3-5 मिनट के 5 मिलीलीटर ट्यूब में तय है।
- कार्बन डाइऑक्साइड के साथ सब ~ 100 से 300 yeasted मक्खियों anesthetize और एक ब्लेंडर युक्त ~ 100 मिलीलीटर 1x रॉब के बफर में जोड़ें। पल्स तीन बार (~ 1 सेकंड प्रत्येक)। के लिए रॉब के दशक में oocytes रखें <20 मिनट के सक्रियण से बचने के लिए।
3. दवा उपचार (वैकल्पिक)
- कोट प्रत्येक oocyte प्रस्तुत करने के लिए PTB के साथ एक दूसरे 5 मिलीलीटर ट्यूब। उचित विलायक (नियंत्रण) या नशीली दवाओं के 1 मिलीलीटर रॉब के प्रत्येक oocyte प्रस्तुत करने के लिए प्रत्येक (तालिका 2) में जोड़े।
- दूसरी लेपित 5 मिलीलीटर ट्यूब में विभाजित oocytes। बसा, तरल निकालने, और एक ट्यूब में 1 मिलीलीटर रॉब के साथ साथ विलायक जोड़ने और 1 मिलीलीटर रॉब के साथ साथ दवा दूसरी ट्यूब में। नशीली दवाओं के उपचार (तालिका 2) के लिए समय की उचित राशि के लिए डोलना। एलएट बसा।
4. फिक्सेशन
- महाप्राण बंद सभी तरल और तुरंत 1 मिलीलीटर फिक्स जोड़ें।
- विकल्प # 1: संक्रामक / हेपटैन निर्धारण (फिक्सेशन बफर प्लस 5% formaldehyde)।
- एक nutator पर 2.5 मिनट के लिए ठीक करें। 1 मिलीलीटर हेपटैन और भंवर 1 मिनट जोड़ें। बसने ~ 1 मिनट चलो।
- सभी तरल निकालें, और फिर पीबीएस 1x 1 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर 30 सेकंड। बसने ~ 1 मिनट चलो।
- सभी तरल निकालें, और फिर 1x पीबीएस के साथ ट्यूब भरें।
नोट: Oocytes तुरंत इस्तेमाल किया या कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए nutator पर रखा जा सकता है।
- # 2 विकल्प: संक्रामक / cacodylate निर्धारण (मिक्स प्लस 8% formaldehyde और 100 मिमी cacodylate फिक्स)।
- एक nutator पर 6 मिनट के लिए ठीक करें। 2 मिनट तय है। तरल निकालें, और फिर 1x पीबीएस के साथ ट्यूब भरें।
नोट: Oocytes तुरंत इस्तेमाल किया या कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए nutator पर रखा जा सकता है।
- एक nutator पर 6 मिनट के लिए ठीक करें। 2 मिनट तय है। तरल निकालें, और फिर 1x पीबीएस के साथ ट्यूब भरें।
5. झिल्ली हटाना ( "रोलिंग")
- लेपित पाश्चर pipet का प्रयोग, एक गिलास स्लाइड के पाले (रेत-विस्फोट) हिस्से के लिए 500 से 1000 oocytes जोड़ने ~। शरीर के सभी भागों और बाहरी सामग्री का उपयोग कर संदंश निकालें। oocytes बाहर सूखी मत देना; 1x पीबीएस आवश्यक के रूप में जोड़ सकते हैं।
- oocytes और धीरे 'रोल' oocytes सभी झिल्ली तक के शीर्ष पर एक coverslip हटा रहे हैं प्लेस (oocytes भर coverslip के किनारे खींच सबसे अच्छा काम करता है।) समय समय पर खुर्दबीन के नीचे प्रगति की जांच आवश्यक के रूप में अधिक 1x पीबीएस जोड़ने। बहुत अधिक दबाव oocytes को नष्ट कर देगा के रूप में ख्याल रखना।
नोट: immunofluorescence ही, चरण 6. मछली (के साथ या बिना immunofluorescence) के साथ रहूंगा लिए, चरण 7 के साथ जारी है।
6. ड्रोसोफिला oocytes की एंटीबॉडी धुंधला
- निष्कर्षण और अवरुद्ध
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार युक्त ~ 15 मिलीलीटर पीबीएस / 1% ट्राइटन X-100 ट्यूब में लुढ़का oocytes कुल्ला। कोई कम से कम 1.5 घंटे के लिए इस समाधान और कोई और अधिक से अधिक 2 घंटे में डोलना oocytes।यह कदम एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देता है।
- oocytes बसने ~ 2 मिनट हैं। संभव के रूप में कई झिल्ली के साथ तरल निकालें, तो पीबीएस 0.05% ट्राइटन X-100 / जोड़ने।
नोट: झिल्ली लुढ़का oocytes की तुलना में धीमी आदी हो जाएगा। - oocytes बसने ~ 2 मिनट करते हैं, तो सभी लेकिन ~ 1 मिलीलीटर तरल हटा दें। स्थानांतरण oocytes 1.5 मिलीलीटर ट्यूब स्नातक और शेष तरल हटा दें। अवरुद्ध और 1 घंटे के लिए डोलना के लिए 1 मिलीलीटर PTB जोड़ें।
- एंटीबॉडी धुंधला
- भ्रूण के खिलाफ माध्यमिक एंटीबॉडी के पूर्व अवशोषण।
नोट: यह कदम ड्रोसोफिला प्रोटीन के साथ गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बातचीत से पृष्ठभूमि धुंधला समाप्त।- लीजिए और ठेठ प्रक्रिया 8 प्रति ड्रोसोफिला भ्रूण (~ 25 μl) तय कर लो। -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में स्टोर।
- भ्रूण से मेथनॉल निकालें, 15 मिनट के लिए 800 μl मेथनॉल प्लस पीबीएस 1x 200 μl, और डोलना जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला के 500 μl निकालें और पीबीएस 1x 500 μl के साथ बदलें। फिर 15 मिनट के लिए डोलना। (Washes के ~ 1 घंटा की एक कुल के लिए) दो बार दोहराएँ, और फिर PTB में खत्म।
नोट: भ्रूण तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए nutator पर रखा। - तरल निकालें, oocyte प्रस्तुत करने का प्रति 200 μl को PTB के साथ भरने के लिए, और उचित dilutions पर fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने (ध्यान में रखते हुए कि अंतिम मात्रा 300 μl हो जाएगा;। कदम 7.4 देखें) रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर डोलना (बेहतर) या 3 से 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर।
नोट: पूर्व अवशोषित एंटीबॉडी चरण 6.2.4 में इस्तेमाल किया जाएगा।
नोट: जितना संभव हो सके एक बार फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी जोड़ दिया गया है अंधेरे में नमूने रखें।
- , Oocytes से तरल निकालें 300 μl को PTB के साथ भरने के लिए, और उचित dilutions पर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर डोलना रातोंरात (बेहतर) या 3 से 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर।
- धो 1 मिलीलीटर PTB के साथ 15 मिनट प्रत्येक के लिए चार बार oocytes।
- हटानाoocytes से तरल, भ्रूण (पूर्व अवशोषित माध्यमिक एंटीबॉडी) से सतह पर तैरनेवाला के 200 μl जोड़ें। तो फिर 300 μl को PTB के साथ भरें। 3 से 4 घंटा (बेहतर) या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर डोलना।
- 1 मिलीलीटर PTB के साथ 15 मिनट के लिए एक बार oocytes धो, तरल हटा दें। फिर 7 मिनट के लिए 0.5 μl Hoechst 33342 और 500 μl PTB और डोलना जोड़ें।
- 1 मिलीलीटर PTB के साथ 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार oocytes धो लें।
नोट: Oocytes तुरंत एक स्लाइड पर रखा जा सकता है या इमेजिंग के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर PTB में संग्रहित किया जा सकता है।
- भ्रूण के खिलाफ माध्यमिक एंटीबॉडी के पूर्व अवशोषण।
7. मछली (चरण 5 ऊपर से जारी)
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार युक्त ~ 15 मिलीलीटर 2x SSCT ट्यूब में लुढ़का oocytes कुल्ला। oocytes बसने ~ 2 मिनट हैं। संभव के रूप में कई झिल्ली के साथ 0.5 मिलीलीटर तरल, लेकिन सभी ~ निकालें।
नोट: झिल्ली लुढ़का oocytes की तुलना में धीमी आदी हो जाएगा। - स्थानांतरण 0.5 मिलीलीटर ट्यूब oocytes और शेष तरल हटा दें। क्रमिक जोड़ने और 500 μl को दूर20%, 40%, और 50% formamide समाधान, प्रत्येक समाधान में 10 मिनट के लिए nutating।
नोट: Oocytes formamide के उच्च प्रतिशत के साथ धीमी आदी हो जाएगा। - , तरल निकालें तो 1 से 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 500 μl 50% formamide समाधान है, और डोलना जोड़ें।
नोट: अब incubations बेहतर जांच पैठ में परिणाम। - तरल निकालें, कोई और अधिक ~ 100 से μl oocytes पीछे छोड़ रहा है, और 36 μl संकरण समाधान प्लस जांच के 2 μl (50 एनजी / μl) और पानी के 2 μl या एक 2 एन डी जांच (तालिका 1) के 2 μl जोड़ें।
- 3 मिनट (मछली केवल) या 20 मिनट (मछली प्लस immunofluorescence) के लिए 80 डिग्री सेल्सियस, रात भर एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ऊष्मायन द्वारा पीछा के लिए 91 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
नोट: ये कदम thermocycler में प्रदर्शन किया जा सकता है। - तरल न निकालें। 500 μl 50% 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर formamide समाधान और डोलना जोड़ें।
- बसा, तरल निकालने, 500 μl 50% formamide समाधान जोड़ने के लिए, एक1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डी डोलना।
- बसा, तरल निकालने, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 500 μl 20% formamide समाधान है, और डोलना जोड़ें।
- तीन त्वरित washes (तब तरल जोड़ने, हटाने, व्यवस्थित करते हैं, कई बार पलटना, दोहराएँ।) 500 μl 2x SSCT में प्रदर्शन बसा, तरल निकालने, तो 4 घंटे के लिए 500 μl PTB और डोलना जोड़ें।
8. एंटीबॉडी धुंधला मछली के बाद
- , Oocytes से तरल निकालें 300 μl को PTB के साथ भरने के लिए, और 10 μl विरोधी α ट्यूबिलिन एंटीबॉडी FITC संयुग्मित जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, अन्य एंटीबॉडी, इस्तेमाल किया जा सकता ऊपर प्रोटोकॉल के बाद। कमरे के तापमान पर रात भर डोलना।
- 500 μl PTB के साथ 15 मिनट के लिए एक बार oocytes धो, तरल निकालने और फिर 7 मिनट के लिए 0.5 μl Hoechst 33342 और 500 μl PTB और डोलना जोड़ें।
- oocytes 500 μl PTB के साथ 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोएं।
नोट: Oocytes तुरंत एक स्लाइड पर रखा जा सकता है या के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर PTB में संग्रहित किया जा सकता हैइमेजिंग। जितना संभव हो सके एक बार फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी जोड़ दिया गया है अंधेरे में oocytes रखें।
| दोहराएँ नाम | क्रोमोसाम | Oligo अनुक्रम * |
| 359 | एक्स | GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC |
| AACAC | 2 | AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC |
| dodeca | 3 | CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT |
| 1.686 | 2 + 3 | AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG |
| AATAT | 4 (+ y) | AATATAATATAATATAATATAATATAATAT |
| * एरिक जॉइस, निजी संचार, सुलिवान एट अल से अन्य दृश्यों से 359 अनुक्रम। 8 | ||
तालिका 1: ड्रोसोफिला centromeric दोहराता के लिए मछली जांच।
| दवा | विलायक | शेयर एकाग्रता | अंतिम एकाग्रता | उपचार के समय | प्रभाव |
| colchicine | इथेनॉल | 125 मिमी | 150 सुक्ष्ममापी | 10 मिनट या 30 मिनट | अस्थिर गैर kinetochore (10 मिनट) 9 या सभी (30 मिनट) सूक्ष्मनलिकाएं |
| पैक्लिटैक्सेल | DMSO | 10 मिमी | 10 माइक्रोन | दस मिनट | mic स्थिरrotubules |
| Binucleine 2 | DMSO | 25 मिमी | 25 माइक्रोन के | बीस मिनट | बाधित अरोड़ा बी काइनेज 10 |
तालिका 2: ड्रग उपचार।
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Representative Results
तरीकों हम यहाँ वर्णन किया है देर चरण ड्रोसोफिला अर्धसूत्रीविभाजन के तीन चरणों (चित्रा 1) का प्रतिनिधित्व oocytes के संग्रह में परिणाम होगा। Prophase में Oocytes परमाणु लिफाफा की उपस्थिति, जो इस क्षेत्र karyosome (चित्रा 1 ए) के आस-पास में tubulin संकेत के अभाव के कारण दिखाई दे रहा है द्वारा प्रतिष्ठित हैं। Prometaphase परमाणु लिफाफा टूटने के दौरान जो धुरी assembles के बाद की अवधि है। Prometaphase दौरान karyosome एक विशिष्ट आकार मान लिया गया है, 4 वें मुख्य karyosome द्रव्यमान (चित्रा 1 बी) से अलग गुणसूत्रों के साथ अक्सर लम्बी हो रहा है। Prometaphase metaphase, जिस पर ड्रोसोफिला oocytes स्वाभाविक रूप से ovulation तक गिरफ्तारी के साथ समाप्त होती है। Metaphase oocytes में, karyosome एक गोल आकार (चित्रा 1 सी) में मुकर गया है।
हम यहाँ मीटर का वर्णनethods या तो prometaphase या metaphase में oocytes के लिए संतुष्ट करने के लिए ड्रोसोफिला महिलाओं के अंडे बिछाने की गति में हेरफेर करने के लिए। Prometaphase समृद्ध संग्रह से Oocytes अक्सर लम्बी karyosome (2A चित्रा) दिखाने जबकि कुंवारी ड्रोसोफिला महिलाओं, जो लगभग पूरी तरह से अंडे बिछाने खत्म करने से metaphase समृद्ध संग्रह या संग्रह, मुख्य रूप दौर karyosome (चित्रा 2 बी) दिखा। दिलचस्प बात यह है prometaphase समृद्ध संग्रह भी आम तौर पर और अधिक मजबूत स्पिंडल दिखाने, सुझाव है कि ड्रोसोफिला में prometaphase और metaphase के बीच दोनों karyosome और धुरी परिवर्तन oocytes 9।
चित्रा 3 यहाँ वर्णित दो प्रोटोकॉल से प्रतिनिधि छवियों से पता चलता। α ट्यूबिलिन के खिलाफ एंटीबॉडी (धुरी को दिखाने के लिए), CENP-सी (centromeres दिखाने के लिए), और INCENP (केंद्रीय धुरी को दिखाने के लिए) oocytes पर इस्तेमाल किया गया fo के साथ तयrmaldehyde / हेपटैन (चित्रा 3 ए)। मछली प्रोटोकॉल (चित्रा 3 बी) के अनुसार एक α ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ-दाग सह 2 एन डी गुणसूत्र (AACAC) और 3 आरडी गुणसूत्र (dodeca) पर दोहराए centromeric दृश्यों के लिए जांच formaldehyde / cacodylate और साथ तय oocytes पर इस्तेमाल किया गया। जबकि dodeca जांच गुणसूत्र प्रति एक ही ध्यान केंद्रित के रूप में प्रकट होता है AACAC जांच के रूप में कई क्लस्टर foci प्रकट होता है। 10 मिनट के लिए 150 माइक्रोन के colchicine के साथ इलाज किया Oocytes formaldehyde / हेपटैन (चित्रा 3 सी) के साथ तय किया गया। इस उपचार जो गुणसूत्रबिंदु लेबल foci में डीएनए से संपर्क सब सूक्ष्मनलिकाएं में यह परिणाम है सबसे गैर-kinetochore सूक्ष्मनलिकाएं समाप्त,। Oocytes कोशिका द्रव्य में 10 मिनट के शो अत्यधिक सूक्ष्मनलिकाएं के लिए 10 माइक्रोन PACLITAXEL, लेकिन धुरी सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा 3 डी) पर थोड़ा प्रभाव के साथ इलाज किया। 20 मिनट के लिए 25 माइक्रोन के Binucleine 2 के साथ इलाज किया oocytes के अरोड़ा बी काइनेज शो पूरा नुकसान को बाधित करने के लिएधुरी सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा 3E)।
चित्रा 1: परिपक्व ड्रोसोफिला oocytes के तीन चरणों:। Prophase, prometaphase, और मेटाफ़ेज़ prophase में ड्रोसोफिला oocytes की Confocal छवियों (ए), prometaphase (बी), और अर्धसूत्रीविभाजन आई डीएनए के metaphase (सी) नीले रंग में दिखाया गया है और tubulin है मर्ज किए गए चित्र में हरे रंग में दिखाया गया है। (बी) और (सी) में insets सफेद में डीएनए दिखा। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2:ड्रोसोफिला oocytes की Prometaphase- बनाम metaphase समृद्ध संग्रह। Prometaphase समृद्ध (ए) से ड्रोसोफिला oocytes की Confocal छवियों या metaphase समृद्ध (बी) संग्रह। डीएनए नीले रंग में दिखाया गया है और tubulin हरे रंग में दिखाया गया है। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: ड्रोसोफिला oocytes की एंटीबॉडी धुंधला, मछली, और दवा उपचार हरे रंग में नीले रंग में डीएनए और tubulin साथ ड्रोसोफिला oocytes की Confocal छवियों।। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। (ए) formaldehyd में इम्यूनोफ्लोरेसेंसई लाल रंग में INCENP (केंद्रीय धुरी) और CENP-सी (centromeres) सफेद के साथ / हेपटैन निर्धारण। (बी) AACAC साथ formaldehyde / cacodylate निर्धारण में मछली सफेद में दिखाया लाल और dodeca में दिखाया गया है। (सी) लाल रंग में दिखाया CENP-सी के साथ 10 मिनट के लिए 150 माइक्रोन के colchicine के साथ उपचार। 10 मिनट (डी) या 25 माइक्रोन के Binucleine 2 20 मिनट (ई) के लिए के लिए 10 माइक्रोन पैक्लिटैक्सेल साथ उपचार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
ड्रोसोफिला Oocytes मचान
हालांकि एक लम्बी karyosome अक्सर prometaphase oocytes में देखा जाता है, karyosome आकार का उपयोग metaphase oocytes से prometaphase भेद करने के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है। prometaphase दौरान karyosome, एक गोल आकार के रूप में शुरू होता है elongates, और उसके बाद के रूप में oocyte metaphase गिरफ्तारी दृष्टिकोण एक गोल आकार को पलटा। इसका मतलब यह है कि कई prometaphase oocytes एक लम्बी karyosome नहीं है। इसके अलावा, अगर उत्परिवर्ती या दवा इलाज oocytes जांच कर रहे हैं, karyosome आकार को प्रभावित किया जा सकता है, oocytes चरण के लिए इस विधि का उपयोग precluding। क्योंकि अन्य मार्करों भेद करने के लिए इन चरणों में वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं, हम ऊपर वर्णित विधि ड्रोसोफिला महिलाओं के अंडे बिछाने की गति में हेरफेर करने के लिए या तो prometaphase या metaphase में oocytes के लिए संतुष्ट करने के लिए इस्तेमाल करते हैं। तर्क यह है कि अगर oocytes prometaphase में समय की एक विशेष राशि है, और समय आगमन की एक अनिश्चितकालीन राशि खर्चmetaphase में दिलचस्पी है, जो जब तक अंडे बिछाने, तो और अधिक तेजी से अंडे बिछाने रहता है prometaphase oocytes की एक उच्च प्रतिशत की तरफ तिरछा जाएगा, जबकि धीमी अंडे बिछाने के लिए metaphase को समृद्ध करेंगे। कुंवारी महिलाओं को इकट्ठा के रूप में या Gilliland एट अल द्वारा वर्णित है, 2 दिन की तुलना में एक छोटे समय सीमा से अधिक महिलाओं को इकट्ठा। 6 के लिए आवश्यक प्रयास की राशि, prometaphase oocytes में एक सराहनीय वृद्धि के द्वारा पुरस्कृत नहीं है। यह भी इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार oocytes मंच के रूप में पृष्ठीय उपांग झिल्ली के साथ हटा रहे हैं पृष्ठीय उपांग का उपयोग करने के लिए असंभव है। हालांकि यह संभव इस पद्धति का उपयोग 100% निश्चितता के साथ अलग-अलग oocytes चरण के लिए नहीं है, से डेटा prometaphase समृद्ध या metaphase समृद्ध संग्रह इन विभिन्न चरणों 9 के बारे में निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए एक साथ लिया जा सकता है।
ड्रोसोफिला oocytes निषेचित नहीं कर रहे हैं, जब तक वे डिंबवाहिनी के माध्यम से पारित; इसलिए, क्योंकि oocytes वीं के लिए एकत्रई यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल से पहले अंडे बिछाने लिया oocytes की जांच, इन oocytes निषेचित नहीं किया गया है। डिंबवाहिनी के माध्यम से पारित होने के भी oocyte को सक्रिय करने और कोशिका चक्र प्रगति को फिर से शुरू करने के लिए कारण बनता है। तरीके कोशिका चक्र के चरणों की जांच करने के बाद मैं metaphase 11,12 मौजूद हैं, लेकिन इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर हैं।
फिक्सेशन विधि संबंधी बातें
हम देर चरण ड्रोसोफिला oocytes के निर्धारण के लिए दो अलग-अलग विधियों का वर्णन। Formaldehyde / cacodylate निर्धारण विधि पहले Theurkauf और हॉले 3 और formaldehyde / हेपटैन निर्धारण विधि द्वारा वर्णित किया गया था पहले Zou एट अल। 4 से वर्णित किया गया था। इसके अलावा, एक तीसरा तरीका (मेथनॉल निर्धारण) कुछ 13 से प्रयोग किया जाता है, लेकिन यहाँ वर्णित नहीं। बाद formaldehyde / हेपटैन निर्धारण formaldehyde / cacodylate की तुलना में oocyte झिल्ली को हटाने के लिए कुछ हद तक मुश्किल है। इसका कारण यह है "रोलिंग" निर्भरcoverslip और oocyte, और formaldehyde / हेपटैन निर्धारण के बीच घर्षण पर है oocytes अधिक फिसलन बना देता है। इस जोड़े कठिनाई के बावजूद, जब नई एंटीबॉडी परीक्षण के निर्धारण विधि के बारे में हमारी पहली पसंद formaldehyde / हेपटैन क्योंकि यह एंटीबॉडी का बहुमत है कि हम कोशिश की है के लिए सबसे अच्छा काम करता है। दूसरी ओर, हम formaldehyde / cacodylate निर्धारण मछली के लिए, पसंद करते हैं मुख्य रूप से झिल्ली हटाने में आसानी के लिए हालांकि formaldehyde / हेपटैन निर्धारण भी सफल रहा है। इन दोनों पद्धतियों के मेथनॉल निर्धारण की तुलना में बेहतर oocyte आकारिकी की रक्षा, और इसलिए हम केवल एंटीबॉडी के मामलों है कि formaldehyde आधारित निर्धारण के तरीकों को आग रोक रहे हैं में मेथनॉल निर्धारण सलाह देते हैं।
प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, तय इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित करने के क्रम में परिपक्व ड्रोसोफिला oocytes एंटीबॉडी प्रवेश करने के लिए उत्तरदायी प्रतिपादन, अर्थात् oocyte झिल्ली को हटाने के माध्यम से करने के लिए प्रभावी तरीकों का प्रदर्शन करने के लिए। झिल्ली रेमो के लिए वैकल्पिक तरीकोंवैल संभव हो रहे हैं (संदंश 14 या 13 sonication का उपयोग); हालांकि, हम सबसे कुशल और विश्वसनीय तरीका हो पाते हैं "रोलिंग"। लाइव इमेजिंग के लिए तकनीक भी कहीं और वर्णित किया गया है 14-16 और इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर हैं।
मछली अनुशंसाएँ
ड्रोसोफिला oocytes में मछली मूल रूप से Dernburg एट अल। 5 से वर्णित किया गया था। इस प्रोटोकॉल संघनित oocyte गुणसूत्रों को जांच के संकरण के लिए इष्टतम स्थिति प्रदान करने के लिए डिजाइन किया गया था, लेकिन मूल प्रोटोकॉल immunofluorescence के लिए इष्टतम नहीं था। ऊपर वर्णित विधि रूपांतरों हम α ट्यूबिलिन, जो मुख्य रूप से जब मछली प्रदर्शन कर हम क्या उपयोग है की एंटीबॉडी धुंधला बढ़ाने के लिए बनाया है भी शामिल है। अन्य एंटीबॉडी, 80 डिग्री सेल्सियस से विकृतीकरण कदम (चरण 7.5) के तापमान को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
यहाँ सूचीबद्ध जांच के लिए हैंcentromeres पास हेट्रोक्रोमैटिन में दोहराव दृश्यों। क्योंकि इन दृश्यों अत्यधिक दोहराए हैं, जांच कई स्थानों के लिए पानी रखना और सामूहिक संकेतों काफी मजबूत हैं। हम जबकि संघनित karyosome में निहित संभवतः गुणसूत्रों की अनोखी संरचना की वजह से, euchromatin में दृश्यों के लिए जांच के साथ छोटी सी सफलता मिली है।
इमेजिंग
परिपक्व ड्रोसोफिला oocytes, सबसे जीवों की oocytes की तरह, बड़े, एकल कोशिकाओं रहे हैं। इसका मतलब है कि एक भी नाभिक होता है कोशिका द्रव्य की एक बड़ी मात्रा में होता है। सौभाग्य से, इस नाभिक भी ड्रोसोफिला में एक karyosome के रूप में जाना जाता है, को आसानी से पहचाना जा सकता है के रूप में यह आम तौर पर सिर्फ कोर्टेक्स के करीब पृष्ठीय उपांग के नीचे स्थित है। पृष्ठीय उपांग oocyte झिल्ली के साथ हटा दिया जाता है, लेकिन अभी भी karyosome oocyte कोर्टेक्स में छोटे divot खोजने के द्वारा देखा जा सकता है जहां उपांग ओnce थे। सबसे अच्छा चित्र oocytes कि इस divot coverslip का सामना करना पड़ के साथ मुहिम शुरू कर दिया है के बाद से इस उद्देश्य के लिए karyosome निकटतम स्थानों से प्राप्त कर रहे हैं। हालांकि यह बढ़ते करने से पहले इस उन्मुखीकरण में oocytes की व्यवस्था करने के लिए संभव हो सकता है, हम बेतरतीब ढंग से कई oocytes माउंट करने के लिए और फिर पसंदीदा अभिविन्यास में उन लोगों के लिए स्लाइड खोज पसंद करते हैं।
भविष्य के अनुप्रयोगों
भविष्य में यह मार्कर है कि मज़बूती prometaphase मैं और metaphase मैं स्पिंडल भेद की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण होगा। अधिक मज़बूती oocytes चरण के लिए इस तरह के मंच समृद्ध oocytes या लाइव इमेजिंग, जो भी अपने मचान समस्या है की बड़ी संख्या इमेजिंग के रूप में अधिक श्रम गहन विकल्प, पर निर्भरता कम हो जाएगा सक्षम होने के नाते। इस पद्धति का एक बुनियादी विधि है जो ड्रोसोफिला आनुवंशिकी के क्षेत्र में प्रगति का लाभ लेने के लिए के रूप में नए उपकरणों को संशोधित करने या जीन उत्पादों को बाहर दस्तक करने के लिए उपलब्ध हो जाते हैं इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरीके शामिलसीधे नई दवाओं या लक्षित गिरावट रणनीतियों के साथ प्रोटीन गतिविधि को निशाना बनाने। इसके अलावा, इन तरीकों meiotic स्पिंडल इमेजिंग के लिए ही सीमित नहीं हैं। oocyte के भीतर किसी भी संरचना, ऐसे actin cytoskeleton के रूप में, इन तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical tubes | Various | ||
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC | Sigma | F2168 | clone DM1A |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| dextran sulfate | Various | ||
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| formamide | Sigma | 47670-250ML-F | |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| graduated 1.5 ml tubes | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| Hoechst 33342 | Various | ||
| magnesium chloride | Various | ||
| methanol | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium chloride | Various | ||
| sodium citrate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
References
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