Protocol
Note: Les procédures sont effectuées à la température ambiante, sauf indication contraire. incubateurs à température contrôlée sont utilisés pour maintenir les températures de mouche d'élevage et des croix, sauf indication contraire.
1. Préparatifs
- Préparer les mouches.
- Prométaphase enrichi les collections ovocyte.
- Effacer les mouches adultes de jeunes, actions ou croisées cultures saines. bouteilles d'âge pour les deux jours à 25 ° C.
NOTE: En général, deux bouteilles saines suffisent, bien que plus peut être nécessaire pour certaines cultures croisées. - Après deux jours, recueillir ~ 100 à 300 femmes (qui sont âgés de 0 à 2 jours à ce stade) des bouteilles. Les femelles ne doivent pas être vierges. Ajouter un peu de pâte de levure sur le côté d'un flacon et placer 30 femelles et 10 à 15 hommes chacun dans les flacons à la levure. flacons d'âge pour les deux jours à 25 ° C.
- Effacer les mouches adultes de jeunes, actions ou croisées cultures saines. bouteilles d'âge pour les deux jours à 25 ° C.
- Metaphase enrichi ovocytes Collections.
- Collecter ~ 100 à 300 femelles en stock ou cross cultures. Ajouter un peu de pâte de levure sur le côté d'un flacon et placer 30 femelles chacune (sans mâles ajoutés) dans les flacons à la levure. flacons d'âge pour les trois à cinq jours à 25 ° C.
- Prométaphase enrichi les collections ovocyte.
- Préparer Solutions.
Nota: Les solutions peuvent être conservés indéfiniment à la température ambiante, sauf indication contraire.- Préparer le tampon de modification de Robb (5x): 500 mM de HEPES, 500 mM de saccharose, l'acétate de sodium 275 mM, 200 mM d'acétate de potassium, du glucose 50 mM, du chlorure de magnésium à 6 mM et 5 mM de chlorure de calcium. Utiliser 10 N 11: 8 hydroxyde de sodium et d'hydroxyde de potassium pour amener le pH à 7,4. Stériliser par filtration; n'autoclave pas. Conserver à -20 ° C. Décongeler au besoin pour préparer ~ 200 ml de par ovocyte de préparation 1x Robb.
- Solutions de fixation.
- Option n ° 1: Préparer le formaldéhyde / heptane fixation. Préparer la fixation du tampon: solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS), ainsi que 150 mM de saccharose. Pour l'utiliser, faire frais avec 687,5 pi Fixation Buffer et 312,5 pi 16% de formaldéhydepar oocyte prép.
ATTENTION: Porter des gants lors de l'utilisation des solutions de formaldéhyde dans une hotte. Éliminer les déchets selon les directives institutionnelles. - Option n ° 2: Préparer le formaldéhyde / cacodylate fixation. Mélanger la préparation Fix: saccharose 250 mM, 100 mM d'acétate de potassium (pH 7,5), d'acétate de sodium 25 mM (pH 7,0) et 25 mM d'EGTA (pH 8,0). Pour l'utiliser, faire fraîche avec 400 ul Fix Mix, 100 cacodylate ul de potassium (1 M, pH 7,2), et 500 ul de 16% formaldéhyde par ovocyte prep.
ATTENTION: cacodylate de potassium contient de l'arsenic.
- Option n ° 1: Préparer le formaldéhyde / heptane fixation. Préparer la fixation du tampon: solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS), ainsi que 150 mM de saccharose. Pour l'utiliser, faire frais avec 687,5 pi Fixation Buffer et 312,5 pi 16% de formaldéhydepar oocyte prép.
- Préparer du PBS / Triton X-100: 1 x PBS + 1% ou 0,05% de Triton X-100. Conserver à 4 ° C.
- Préparer du PBS-Tween 20 sérum-albumine bovine (BSA) (TBP): 1 x PBS, BSA à 0,5% (p / v) et 0,1% de Tween-20. Peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine.
- Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) Solutions.
- Préparer le chlorure de sodium-20X citrate de sodium (SSC): 3 M de chlorure de sodium et 0,3 M de citrate de sodium.
- Préparer 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% de Tween-20. Faire frais, ~ 20 ml par ovocyte prep.
- Préparer des solutions de formamide: 2x SSC, 0,1% de Tween-20, ainsi que le formamide. Faire frais, 1 ml 20% de formamide, 0,5 ml 40% de formamide, et 2 ml 50% de formamide par ovocyte prep.
ATTENTION: Porter des gants lors de l'utilisation de solutions de formamide dans une hotte. Éliminer les déchets selon les directives institutionnelles. - Préparer une solution d'hybridation: 2 x SSC, formamide à 50% et 10% de sulfate de dextran (poids / volume). Conserver à 4 ° C.
- Sondes FISH.
- Ordre des oligonucléotides (voir le tableau 1 pour les séquences) avec une purification par HPLC et désiré 5 'modification fluorescente (par exemple, Cy3 ou Cy5). Remettre en suspension dans du Tris-EDTA (TE) à 50 ng / ul.
REMARQUE: Protéger oligos d'exposition à la lumière en tout temps.
- Ordre des oligonucléotides (voir le tableau 1 pour les séquences) avec une purification par HPLC et désiré 5 'modification fluorescente (par exemple, Cy3 ou Cy5). Remettre en suspension dans du Tris-EDTA (TE) à 50 ng / ul.
2. Collection de Late stade Drosophila Ovocytes
- Comme
- Anesthésier toutes ~ 100 à 300 mouches à la levure avec du dioxyde de carbone et d'ajouter à un mélangeur contenant ~ 100 ml de tampon 1X Robb. Pulse trois fois (~ 1 sec chacun). Gardez oocytes à Robb pour <20 min pour éviter l'activation.
NOTE: Alternativement, les ovocytes peuvent être disséqués à la main à partir de femelles. L'avantage de cette méthode est qu'elle nécessite moins de femelles. Cependant, des précautions doivent être prises pour limiter l' exposition au dioxyde de carbone à seulement quelques minutes pour éviter les artefacts associés à l' hypoxie 7.- Filtrer à travers de grandes mailles (~ 1 500 um) dans 250 ml bécher pour enlever de grandes parties du corps. Si de nombreux abdomens intacts restent sur un matériau maillé, re-grind à l'aide du tampon de Robb supplémentaires, et le filtre à nouveau. Laisser reposer ~ 2 min, puis Aspirer la couche supérieure, en supprimant autant de grandes parties du corps que possible.
- Filtre par petites mailles (~ 300 um) dans un bécher de 250 ml. Rincer les ovocytes restants sur premier bêcher en utilisant une pipette Pasteur supplémentaire Robb et enduit. Laisser déposer ~ 3 min; oocytes se déposent. Aspirer tous mais ~ 10 ml.
- Pour autant des 10 ml que possible pour enduit tube de 5 ml. Laisser reposer, éliminer le liquide, et répéter avec le reste. Rincer les ovocytes restants sur bêcher en utilisant plus pipette Pasteur Robb et enduit. Laissez installer dans 5 ml tube pour ~ 3-5 min.
- Anesthésier toutes ~ 100 à 300 mouches à la levure avec du dioxyde de carbone et d'ajouter à un mélangeur contenant ~ 100 ml de tampon 1X Robb. Pulse trois fois (~ 1 sec chacun). Gardez oocytes à Robb pour <20 min pour éviter l'activation.
3. Les traitements médicamenteux (Facultatif)
- Enduire un deuxième tube de 5 ml avec TBP pour chaque préparation de l'ovocyte. Ajouter un solvant approprié (de contrôle) ou d'un médicament à 1 ml de chacun Robb pour chaque préparation de l' ovocyte (tableau 2).
- oocytes divisé en deuxième enduit tube de 5 ml. Laisser déposer, retirer le liquide, et ajouter 1 ml Robb plus solvant dans un tube et 1 ml Robb plus de médicament dans second tube. Nutation pour suffisamment de temps pour le traitement médicamenteux (tableau 2). Let régler.
4. Fixation
- Aspirer tout liquide et ajouter immédiatement 1 ml Fix.
- Option n ° 1: Formaldéhyde / fixation heptane (Fixation Buffer plus 5% de formaldéhyde).
- Fixer pendant 2,5 minutes sur un nutator. Ajouter 1 ml heptane et vortex 1 min. Laisser déposer ~ 1 min.
- Retirer tout le liquide, puis ajouter 1 ml PBS 1x. Vortex 30 sec. Laisser déposer ~ 1 min.
- Retirer tout le liquide, puis remplir le tube avec PBS 1x.
NOTE: Les ovocytes peuvent être utilisées immédiatement ou conservées sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante.
- Option n ° 2: Formaldéhyde / cacodylate fixation (Fix Mix plus 8% formaldéhyde et cacodylate 100 mM).
- Correction de 6 min sur un nutator. Laisser reposer 2 min. Retirer le liquide, puis remplir le tube avec PBS 1x.
NOTE: Les ovocytes peuvent être utilisées immédiatement ou conservées sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante.
- Correction de 6 min sur un nutator. Laisser reposer 2 min. Retirer le liquide, puis remplir le tube avec PBS 1x.
5. Retrait Membranes ( "Rolling")
- Utiliser enduit pipette Pasteur, ajouter ~ 500 à 1000 ovocytes à la partie givré (sablé) d'une lame de verre. Retirez toutes les parties du corps et matériaux en utilisant des pinces étrangères. Ne laissez pas sécher les ovocytes; ajouter 1x PBS si nécessaire.
- Placez une lamelle sur le dessus des ovocytes et doucement ovocytes «rouler» jusqu'à ce que toutes les membranes sont enlevées (faisant glisser le bord de la lamelle à travers les ovocytes qui fonctionne le mieux.) Contrôler périodiquement les progrès sous le microscope, en ajoutant plus 1x PBS si nécessaire. Faites attention car trop de pression va détruire les ovocytes.
NOTE: Pour immunofluorescence seulement, passez à l'étape 6. Pour FISH (avec ou sans immunofluorescence), passez à l'étape 7.
6. Anticorps Coloration de Drosophila Ovocytes
- Extraction et blocage
- Rinçage oocytes roulé dans un tube conique de 15 ml contenant ~ 15 ml de PBS / 1% de Triton X-100. nutation ovocytes présents dans cette solution pendant au moins 1,5 heure et pas plus de 2 heures.Cette étape permet la pénétration des anticorps.
- Laissez oocytes régler ~ 2 min. Éliminer le liquide avec le plus grand nombre possible de membranes, puis ajouter du PBS / 0,05% de Triton X-100.
REMARQUE: Membranes régleront plus lent que les ovocytes laminés. - Laissez oocytes régler ~ 2 min, puis retirez tout mais ~ 1 ml de liquide. oocytes de transfert aux gradués 1,5 ml tube et enlever le liquide restant. Ajouter 1 ml TBP pour bloquer et nutation pendant 1 h.
- anticorps Staining
- Pré-absorption d'anticorps secondaire contre l'embryon.
REMARQUE: Cette étape élimine la coloration de fond à partir des interactions anticorps non-spécifiques avec des protéines de drosophile.- Recueillir et fixer des embryons de drosophile (~ 25 pi) par procédure typique 8. Conserver dans le méthanol à -20 ° C.
- Éliminer le méthanol à partir d'embryons, ajouter 800 ul de methanol plus 200 ul de 1 x PBS et nutation pendant 15 min. Retirer 500 pi de surnageant et le remplacer par 500 ul PBS 1x. Ensuite nutation pendant 15 min. Répéter deux fois (pour un total de ~ 1 h de lavages), puis terminer en TBP.
REMARQUE: Embryons peut être utilisé immédiatement ou conservés sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante. - Retirer du liquide, remplir de TBP à 200 ul par ovocyte prep, et ajouter des anticorps secondaires marqués par fluorescence à des dilutions appropriées (en gardant à l'esprit que le volume final sera de 300 pi;. Voir étape 7.4) nutation à 4 ° C pendant la nuit (de préférence) ou à la température ambiante pendant 3 à 4 heures.
NOTE: Les anticorps pré-absorbés seront utilisés à l'étape 6.2.4.
NOTE: Conserver les échantillons dans l'obscurité, autant que possible, une fois les anticorps fluorescents ont été ajoutés.
- Retirer le liquide à partir d'ovocytes, remplir de TBP à 300 pi, et d'ajouter des anticorps primaires à des dilutions appropriées. Nutation à 4 ° C pendant la nuit (de préférence) ou à la température ambiante pendant 3 à 4 heures.
- Laver oocytes quatre fois pendant 15 min chacun avec 1 ml TBP.
- Retirerliquide à partir d'ovocytes, ajouter 200 pi de surnageant à partir d'embryons (pré-absorption des anticorps secondaires). Remplissez ensuite avec TBP à 300 pi. Nutation à la température ambiante pendant 3 à 4 heures (de préférence) ou à 4 ° C durant la nuit.
- Laver oocytes fois pendant 15 minutes avec 1 ml TBP, enlever le liquide. Puis ajouter 0,5 ul Hoechst 33342 et 500 ul TBP et nutation pendant 7 min.
- Laver oocytes deux fois 15 min chacun avec 1 ml TBP.
REMARQUE: Les ovocytes peuvent être montés sur une lame immédiatement ou peuvent être stockés dans la TBP à 4 ° C jusqu'au moment de l'imagerie.
- Pré-absorption d'anticorps secondaire contre l'embryon.
7. FISH (Continuer à partir de l'étape 5 ci-dessus)
- Rincer oocytes roulé dans un tube conique de 15 ml contenant ~ 15 ml 2x SSCT. Laissez oocytes régler ~ 2 min. Retirez tous, mais ~ 0,5 ml de liquide avec autant de membranes que possible.
REMARQUE: Membranes régleront plus lent que les ovocytes laminés. - Transfert des ovocytes à 0,5 ml tube et enlever le liquide restant. Successivement ajouter et supprimer 500 pi20%, 40% et 50% des solutions de formamide nutation pendant 10 minutes dans chaque solution.
NOTE: Les ovocytes se déposent plus lentement avec des pourcentages plus élevés de formamide. - Éliminer le liquide, puis ajouter une solution de 500 pi de formamide à 50%, et de nutation à 37 ° C pendant 1 à 5 heures.
NOTE: Longer incubations se traduisent par une meilleure pénétration de la sonde. - Enlever le liquide, en laissant pas plus de ~ 100 ovocytes pi, et d' ajouter 36 ul de solution d'hybridation plus 2 pi de sonde (50 ng / ul) et 2 ul d'eau et 2 ul d'une sonde 2 ème (tableau 1).
- Incuber à 91 ° C pendant 3 min (poissons) ou 80 ° C pendant 20 min (FISH en plus immunofluorescence), suivie d'une incubation dans un bain d'eau à 37 ° pendant une nuit.
REMARQUE: Ces étapes peuvent être réalisées dans un thermocycleur. - Ne pas enlever le liquide. Ajouter 500 ul de solution à 50% de formamide et nutation à 37 ° C pendant 1 heure.
- Laisser déposer, retirer le liquide, ajouter la solution de formamide 500 ul de 50%, uned nutation à 37 ° C pendant 1 heure.
- Laisser déposer, retirer le liquide, ajouter la solution de formamide 500 ul de 20%, et nutation à la température ambiante pendant 10 min.
- Effectuer trois lavages rapides dans 500 ul 2x SSCT (laisser se décanter enlever puis ajouter le liquide, inverser plusieurs fois, répéter.) Laisser déposer, retirer le liquide, puis ajouter 500 ul TBP et nutation pendant 4 heures.
8. Anticorps Coloration après FISH
- Retirer le liquide à partir d'ovocytes, remplir de TBP à 300 pi, et ajouter 10 ul d'anticorps anti-α-tubuline conjugué à FITC. En variante, d'autres anticorps peuvent être utilisés, suivant le protocole ci-dessus. Nutation à la température ambiante pendant une nuit.
- Laver oocytes fois pendant 15 minutes avec 500 ul TBP, enlever le liquide, puis ajouter 0,5 ul Hoechst 33342 et 500 ul TBP et nutation pendant 7 min.
- Laver deux fois oocytes pendant 15 minutes chacun avec 500 ul TBP.
NOTE: Les ovocytes peuvent être montés sur une lame immédiatement ou peuvent être stockés dans TBP à 4 ° C jusqu'au moment deimagerie. Gardez oocytes dans l'obscurité, autant que possible, une fois les anticorps fluorescents ont été ajoutés.
| Répéter Nom | Chromosome | Oligo Sequence * |
| 359 | X | GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC |
| AACAC | 2 | AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC |
| dodéca | 3 | CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT |
| 1.686 | 2 + 3 | AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG |
| AATAT | 4 (+ Y) | AATATAATATAATATAATATAATATAATAT |
| * 359 séquence d'Eric Joyce, communication personnelle, d' autres séquences de Sullivan et al. 8 | ||
Tableau 1: sondes FISH pour Drosophila répétitions centromériques.
| Drogue | Solvant | Concentration en Stock | La concentration finale | Durée du traitement | Effet |
| colchicine | éthanol | 125 mM | 150 um | 10 min ou 30 min | déstabiliser non-kinétochore (10 min) 9 ou toutes (30 min) microtubules |
| paclitaxel | DMSO | 10 mM, | 10 pm | 10 minutes | stabiliser microrotubules |
| Binucleine 2 | DMSO | 25 mM, | 25 pm | 20 min | inhiber la kinase Aurora B 10 |
Tableau 2: Le traitement médicamenteux.
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Representative Results
Les méthodes que nous avons décrites ici se traduira par la collecte des ovocytes chez la drosophile stade avancé représentant trois étapes de la méiose (Figure 1). Oocytes dans la prophase se distinguent par la présence de l'enveloppe nucléaire, qui est visible par l'absence de signal de la tubuline dans la région entourant le caryosome (figure 1A). Prométaphase est la période après enveloppe ventilation nucléaire au cours de laquelle les assemble de la broche. Pendant prométaphase, le caryosome prend une forme distinctive, devenant allongée souvent avec les 4 e chromosomes en dehors de la principale masse caryosome (figure 1B). Prométaphase conclut avec métaphase, au cours de laquelle les ovocytes de Drosophila arrêter naturellement jusqu'à l' ovulation. Dans oocytes métaphase, l'caryosome a rétracté dans une forme ronde (figure 1C).
Nous décrivons ici méthodes de manipuler la vitesse de ponte des femelles de Drosophila pour enrichir ovocytes soit en prométaphase ou métaphase. Ovocytes de collections prométaphase enrichies montrent fréquemment la caryosome allongée (figure 2A) , tandis que les collections métaphase enrichi ou collections de femelles vierges de Drosophila, qui éliminent presque complètement la ponte, montrent principalement la caryosome ronde (figure 2B). Fait intéressant, les collections prométaphase enrichies montrent aussi généralement beaucoup plus robuste broches, ce qui suggère que les deux changements caryosome et de la broche entre prométaphase et métaphase chez la drosophile oocytes 9.
La figure 3 montre des images représentatives des deux protocoles décrits ici. Des anticorps contre α-tubuline (pour montrer la broche), CENP-C (pour montrer centromères) et INCENP (pour montrer la broche centrale) ont été utilisés sur les ovocytes fixés avec formaldehyde / heptane (figure 3A). Les sondes pour les séquences centromériques répétitives sur le 2 ème chromosome (AACAC) et 3 ème chromosome (dodéca) ont été utilisés sur les ovocytes fixées au formaldéhyde / cacodylate et co-colorées avec un anticorps anti-α-tubuline selon le protocole FISH (figure 3B). La sonde AACAC apparaît comme plusieurs foyers cluster alors que la sonde dodéca apparaît comme un foyer unique par chromosome. Oocytes traitées avec 150 uM pendant 10 min colchicine ont été fixées avec du formaldéhyde / heptane (figure 3C). Ce traitement permet d'éliminer la plupart des non-kinétochoriens-microtubules, ce qui entraîne dans tous les microtubules en contact avec l'ADN au niveau des foyers centromériques marquées. Oocytes traitées avec 10 uM paclitaxel pendant 10 minutes montrent microtubules excessives dans le cytoplasme, mais peu d' effet sur les microtubules du fuseau (Figure 3D). Oocytes traitées avec 25 uM Binucleine 2 pendant 20 min pour inhiber la perte Aurora B kinase spectacle complet demicrotubules broche (Figure 3E).
Figure 1: Trois stades d'ovocytes Drosophila matures:. Prophase, Prométaphase et Metaphase images confocale d'ovocytes chez la drosophile en prophase (A), prométaphase (B), et métaphase (C) de la méiose I. ADN est représenté en bleu et tubuline est en vert dans les images fusionnées. Insets dans (B) et (C) montrent l'ADN en blanc. Barres d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:Prometaphase- vs collections métaphase enrichi d'ovocytes chez la drosophile. Images confocale d'ovocytes chez la drosophile de prométaphase enrichi (A) ou (B) collections métaphasiques enrichi. L'ADN est en bleu et la tubuline est représenté en vert. Barres d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: coloration des anticorps, le poisson et les traitements médicamenteux d'ovocytes Drosophila des images confocale d'ovocytes de Drosophila avec de l' ADN en bleu et tubuline en vert.. Les barres d'échelle = 10 pm. (A) immunofluorescence dans Formaldehyde / heptane fixation avec INCENP (de broche centrale) en rouge et CENP-C (centromères) en blanc. (B) FISH en formaldéhyde / cacodylate fixation avec AACAC montré dans dodéca rouge et en blanc. (C) Le traitement avec 150 uM colchicine pendant 10 min avec CENP-C en rouge. Le traitement avec 10 uM paclitaxel pendant 10 min (D) ou 25 uM Binucleine 2 pendant 20 min (E). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Staging Drosophila Ovocytes
Bien qu'un caryosome allongé est souvent vu dans les ovocytes prométaphase, en utilisant caryosome forme pour distinguer prométaphase à partir d'ovocytes en métaphase peut être problématique. Pendant prométaphase, l'caryosome commence comme une forme ronde, allonge, puis se rétracte à une forme ronde comme l'ovocyte se rapproche de l'arrestation de métaphase. Cela signifie que de nombreux ovocytes prométaphase ne disposent pas d'un caryosome allongé. En outre, si les ovocytes mutants ou traités avec le médicament sont examinés, caryosome forme peut être affectée, ce qui empêche d'utiliser cette méthode pour mettre en scène des ovocytes. Parce que d' autres marqueurs pour distinguer ces étapes ne sont pas actuellement disponibles, nous utilisons la méthode décrite ci - dessus pour manipuler la vitesse de ponte des femelles de Drosophila pour enrichir ovocytes soit en prométaphase ou métaphase. La raison en est que si les ovocytes passent une quantité spécifique de temps en prométaphase, et une quantité indéterminée arr tempsresse en métaphase, qui dure jusqu'à la ponte, la ponte, puis plus rapide sera biaiser vers un pourcentage plus élevé d'ovocytes prométaphase, alors que plus lent ponte va enrichir pour métaphase. La quantité d'effort requis pour recueillir des femelles vierges ou de recueillir des femelles sur une période de temps plus court que 2 jours, comme décrit par Gilliland et al. 6, ne sont pas récompensés par une augmentation sensible des ovocytes prométaphase. Il est également impossible d'utiliser les appendices dorsaux pour mettre en scène des ovocytes préparés avec ce protocole comme des appendices dorsaux sont enlevés avec les membranes. Bien qu'il ne soit pas possible de mettre en scène des ovocytes individuels avec certitude à 100% en utilisant cette méthode, les données de prométaphase enrichis ou collections métaphasiques enrichi peuvent être pris ensemble pour tirer des conclusions sur ces différentes étapes 9.
Ovocytes fertilisés de Drosophila ne sont pas jusqu'à ce qu'ils passent à travers l'oviducte; Par conséquent, parce que les ovocytes recueillis pour eprotocoles e décrits ici examinent les ovocytes prélevés avant la ponte, ces ovocytes ont pas été fécondé. Le passage à travers l'oviducte provoque également l'ovocyte pour activer et reprendre la progression du cycle cellulaire. Méthodes pour examiner les étapes du cycle cellulaire après métaphase j'existe 11,12, mais sont en dehors du champ d'application de ce protocole.
Considérations Fixation Méthode
Nous décrivons deux méthodes distinctes pour la fixation des ovocytes chez la drosophile stade avancé. La méthode de fixation formaldéhyde / cacodylate a été décrite par Theurkauf et Hawley 3 et la méthode de fixation formaldéhyde / heptane a été décrit d' abord par Zou et al. 4. En outre, une troisième méthode (méthanol fixation) est utilisée d'environ 13, mais pas décrite ici. Enlèvement des membranes ovocyte est un peu plus difficile après formaldéhyde / heptane fixation par rapport au formaldéhyde / cacodylate. En effet, "roulant" dépendents sur le frottement entre la lamelle et l'ovocyte, et le formaldéhyde / heptane fixation rend les ovocytes plus glissante. En dépit de cette difficulté supplémentaire, notre premier choix de la méthode de fixation lors de l'essai de nouveaux anticorps est le formaldéhyde / heptane parce qu'il fonctionne le mieux pour la majorité des anticorps que nous avons essayé. D'autre part, nous préférons le formaldéhyde / cacodylate fixation pour FISH, principalement pour la facilité de retrait de la membrane, bien que le formaldéhyde / heptane fixation a également été couronnée de succès. Ces deux méthodes conservent ovocyte morphologie mieux que le méthanol fixation, et donc nous recommandons méthanol fixation uniquement dans les cas d'anticorps qui sont réfractaires aux méthodes de fixation à base de formaldéhyde.
Les protocoles décrits ici se concentrent sur l' imagerie fixe, afin de démontrer des méthodes efficaces pour le rendu des ovocytes matures de Drosophila prêtent à la pénétration d'anticorps, notamment par la suppression des membranes ovocyte. Méthodes alternatives pour remo à membraneval ( en utilisant une pince 14 ou sonication 13) sont possibles; cependant, nous trouvons "rouler" pour être la méthode la plus efficace et fiable. Les techniques d'imagerie en direct ont également été décrites ailleurs 14-16 et sont en dehors du champ d'application de ce protocole.
Recommandations FISH
FISH dans des ovocytes de drosophile a été initialement décrit par Dernburg et al. 5. Ce protocole a été conçu pour fournir des conditions optimales pour la sonde d'hybridation des chromosomes ovocyte condensés, mais le protocole d'origine n'a pas été optimale pour immunofluorescence. La méthode décrite ci-dessus comprend des adaptations que nous avons faites pour améliorer la coloration des anticorps α-tubuline, qui est avant tout ce que nous utilisons lors de l'exécution FISH. Pour les autres anticorps, en abaissant la température de l'étape de dénaturation (étape 7.5) à partir de 80 ° C peut être nécessaire.
Les sondes énumérées ici sont pour laséquences répétitives dans l'hétérochromatine près des centromères. Parce que ces séquences sont très répétitives, les sondes hybrident à de multiples endroits et les signaux collectifs sont assez forts. Nous avons eu peu de succès avec des sondes pour des séquences dans l'euchromatine, probablement en raison de la structure unique des chromosomes alors contenue dans le caryosome condensé.
Imaging
Oocytes Drosophila d' âge mûr, comme les ovocytes de la plupart des organismes, sont de grandes cellules, simples. Cela signifie qu'il y a un grand volume de cytoplasme qui contient un seul noyau. Heureusement, ce noyau, également connu sous le nom caryosome chez la drosophile, peut être facilement identifiée comme il est généralement situé juste en dessous des appendices dorsaux près du cortex. Les appendices dorsaux sont éliminés en même temps que les membranes de l'ovocyte, mais le caryosome peut encore se trouver en trouvant la petite motte de terre dans le cortex de l'ovocyte où les phanères once étaient. Les meilleures images sont obtenues à partir d'ovocytes qui ont été montés avec ce divot face à la lamelle puisque cette place le caryosome le plus proche de l'objectif. Bien qu'il soit possible d'agencer les ovocytes présents dans cette orientation, avant le montage, on préfère monter plusieurs ovocytes au hasard, puis rechercher la diapositive pour ceux dans l'orientation préférée.
Les futures applications
Dans l'avenir, il sera important d'identifier des marqueurs qui permettent de distinguer de manière fiable prométaphase broches I I et métaphase. Etre capable de mettre en scène de façon plus fiable les ovocytes permettra de réduire la dépendance à l'égard de plus forte intensité de main alternatives, telles que l'imagerie grand nombre d'ovocytes au stade enrichi ou l'imagerie en direct, qui a aussi ses problèmes de mise en scène. Cette méthode est une méthode de base qui peut être utilisé pour tirer parti des progrès de la génétique de la Drosophile que de nouveaux outils deviennent disponibles pour modifier ou éliminer des produits géniques. Cela comprend des procédéspour cibler directement l'activité des protéines avec de nouveaux médicaments ou des stratégies de dégradation ciblées. En outre, ces méthodes ne sont pas limitées à l'imagerie des broches méiose. Toute structure à l'intérieur de l'ovocyte, tels que le cytosquelette d'actine, peut être analysée à l'aide de ces méthodes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical tubes | Various | ||
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC | Sigma | F2168 | clone DM1A |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| dextran sulfate | Various | ||
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| formamide | Sigma | 47670-250ML-F | |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| graduated 1.5 ml tubes | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| Hoechst 33342 | Various | ||
| magnesium chloride | Various | ||
| methanol | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium chloride | Various | ||
| sodium citrate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
References
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