Protocol
הערה: ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. חממות שבשליטת טמפרטורה משמשים כדי לשמור על טמפרטורות עבור גידול זבוב וחוצה אלא אם צוין אחרת.
1. הכנות
- הכן זבובים.
- Prometaphase מועשר אוספי ביצית.
- מבוגר מנקה זבובים מתרבויות מניות או צלב בריאות, צעירות. בקבוקי גיל ליומיים של 25 מעלות צלזיוס.
הערה: באופן כללי שני בקבוקים בריאים יספיקו, אם כי יותר עשוי להיות נחוץ עבור בתרבויות מסוימות צלב. - לאחר יומיים, לאסוף ~ 100 עד 300 נקבות (שהינם 0 עד 2 בימים ההם בשלב זה) מהבקבוקים. הנקבות לא צריכות להיות בתולות. להוסיף טיפה של רסק שמרים לצד בקבוקון ולמקם 30 נקבות ו -10 עד 15 גברים כל לתוך צלוחיות yeasted. בקבוקוני גיל לימים של 25 מעלות צלזיוס.
- מבוגר מנקה זבובים מתרבויות מניות או צלב בריאות, צעירות. בקבוקי גיל ליומיים של 25 מעלות צלזיוס.
- Metaphase מועשר אוספי ביצית.
- אסוף ~ 100 עד 300 נקבות מן cultur מניות או צלבes. להוסיף טיפה של רסק שמרים לצד בקבוקון ולמקם 30 נקבות כל (ללא זכרים הוסיפו) לתוך צלוחיות yeasted. בקבוקוני גיל במשך שלושה עד חמישה ימים ב- C ° 25.
- Prometaphase מועשר אוספי ביצית.
- הכינו פתרונות.
הערה: הפתרונות עשויים להיות מאוחסנים ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.- הכן שונה מאגר של רוב (5x): 500 מ"מ HEPES, 500 סוכרוז מ"מ, 275 מ"מ נתרן אצטט, 200 אצטט אשלגן מ"מ, 50 מ"מ גלוקוז, 6 מגנזיום כלוריד מ"מ, סידן כלורי 5 מ"מ. השתמש 10 N 11: סודיום הידרוקסיד 8: הידרוקסיד אשלגן להביא pH ל -7.4. לעקר על ידי סינון; לא חיטוי. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. להפשיר לפי הצורך להכין ~ 200 מ"ל של הכנה לכל הביצית של 1x Robb.
- פתרונות קיבוע.
- אפשרות מס '1: כן קיבעון פורמלדהיד / heptane. כן הצפת קיבוע: 1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) בתוספת 150 סוכרוז מ"מ. כדי להשתמש, לעשות טרי עם 687.5 μl הצפת קיבוע 312.5 μl 16% פורמלדהידלכל הכנת ביצית.
זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת שימוש פתרונות פורמלדהיד במנדף. מפנה את הפסולת בהתאם להנחיות מוסדיות. - # 2 אפשרות: כן קיבעון פורמלדהיד / cacodylate. הכינו תערובת תקן: 250 סוכרוז מ"מ, 100 אצטט אשלגן מ"מ (pH 7.5), אצטט נתרן 25 מ"מ (pH 7.0), ו -25 מ"מ EGTA (pH 8.0). כדי להשתמש, לעשות טרי עם 400 μl תקן מיקס, 100 cacodylate אשלגן μl (1 M, pH 7.2), ו -500 μl 16% פורמלדהיד לכל הכנה הביצית.
זהירות: אשלגן cacodylate מכיל ארסן.
- אפשרות מס '1: כן קיבעון פורמלדהיד / heptane. כן הצפת קיבוע: 1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) בתוספת 150 סוכרוז מ"מ. כדי להשתמש, לעשות טרי עם 687.5 μl הצפת קיבוע 312.5 μl 16% פורמלדהידלכל הכנת ביצית.
- כן PBS / טריטון X-100: 1x PBS בתוספת 1% או 0.05% Triton X-100. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הכן PBS-Tween 20-שור סרום אלבומין (BSA) (PTB): PBS 1x, 0.5% BSA (w / v), ו -0.1% Tween-20. עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד.
- קרינת הכלאה באתרו (FISH) פתרונות.
- כן כלוריד-נתרן 20X ציטראט (SSC): 3 M נתרן כלורי 0.3 M נתרן ציטרט.
- הכן 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC פלוס 0.1% Tween-20. הפוך טרי, ~ 20 מ"ל לכל הכנת ביצית.
- הכינו פתרונות לפוראמיד: 2x SSC, 0.1% Tween-20, פלוס לפוראמיד. הפוך טרי, 1 מ"ל 20% לפוראמיד, 0.5 מ"ל 40% לפוראמיד, ו -2 מ"ל 50% לפוראמיד לכל הכנה הביצית.
זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת שימוש פתרונות לפוראמיד במנדף. מפנה את הפסולת בהתאם להנחיות מוסדיות. - כן פתרון הכלאה: 2x SSC, 50% לפוראמיד, ו -10% סולפט dextran (w / v). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בדיקות FISH.
- Oligonucleotides להזמין (ראה לוח 1 עבור רצפים) עם טיהור HPLC ורצוי 5 'שינוי ניאון (למשל, Cy3 או Cy5). Resuspend ב טריס-EDTA (TE) ב 50 ng / μl.
הערה: גן oligos מחשיפה לאור בכל העת.
- Oligonucleotides להזמין (ראה לוח 1 עבור רצפים) עם טיהור HPLC ורצוי 5 'שינוי ניאון (למשל, Cy3 או Cy5). Resuspend ב טריס-EDTA (TE) ב 50 ng / μl.
2. אוסף של ביציות תסיסנית בשלבים מתקדמים
- כפי ש
- להרדים כל ~ 100 עד 300 זבובי yeasted עם פחמן דו חמצני ומוסיף בבלנדר המכיל ~ 100 מיליליטר 1x ההצפה של רוב. פעמים דופקות שלוש (~ 1 שניות כל אחד). שמור ביציות ב Robb של עבור <20 דק 'כדי להימנע מהפעלת.
הערה: לחלופין, ביציות ניתן יד גזורה מן הנקבות. היתרון של שיטה זו הוא בכך שהיא דורשת נקבות פחות. עם זאת, יש להקפיד על מנת להגביל את החשיפה לפחמן דו-חמצני כדי רק כמה דקות, כדי למנוע חפצים הקשורים היפוקסיה 7.- סינון דרך רשת גדולה (~ 1,500 מיקרומטר) לתוך כוס 250 מ"ל להסיר חלקי גוף גדול. אם בטן שלמה רבה נותרה על חומר רשת, מחדש לטחון באמצעות ההצפה של רוב נוספת, ולסנן שוב. בואו להתיישב ~ 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב את השכבה העליונה, הסרת כמה שיותר חלקי גוף גדול ככל האפשר.
- אלחוטיLTER דרך רשת קטנה (~ 300 מיקרומטר) לתוך מבחנה 250 מ"ל. לשטוף ביציות הנותרות מתוך המבחנה הראשונה באמצעות ומצופה pipet פסטר של רוב נוספים. בואו להתיישב ~ 3 דקות; ביציות יישבו בחוץ. לשאוב את כל אבל ~ 10 מ"ל.
- יוצקים כמה שיותר 10 מ"ל כמו ייכנס לתוך הצינור 5 מ"ל מצופה. בואו להתיישב, להסיר את הנוזל, וחזרו עם שארית. לשטוף ביציות הנותרות מתוך מבחנה באמצעות ו של רוב נוסף pipet פסטר מצופה. בואו להתיישב צינור 5 מ"ל ~ 3-5 דקות.
- להרדים כל ~ 100 עד 300 זבובי yeasted עם פחמן דו חמצני ומוסיף בבלנדר המכיל ~ 100 מיליליטר 1x ההצפה של רוב. פעמים דופקות שלוש (~ 1 שניות כל אחד). שמור ביציות ב Robb של עבור <20 דק 'כדי להימנע מהפעלת.
3. טיפולים תרופתיים (אופציונלי)
- מעיל צינור 5 מ"ל השני עם PTB לכל הכנה הביצית. להוסיף ממס מתאים (שליטה) או תרופה עד 1 מיליליטר רוב של כל עבור כל הכנת ביצית (טבלה 2).
- ביציות פיצול לתוך הצינור השני מצופה 5 מ"ל. בואו להתיישב, להסיר את נוזל, ולהוסיף 1 מ"ל Robb של פלוס ממס לתוך צינור אחד ו 1 מ"ל Robb של פלוס התרופה לתוך הצינור השני. Nutate עבור משך הזמן המתאים עבור טיפול תרופתי (טבלה 2). Let להתיישב.
קיבוע 4.
- לשאוב את כל הנוזל ומיד להוסיף 1 מ"ל תקן.
- אפשרות # 1: פורמלדהיד / heptane קיבעון (קיבוע הצפה בתוספת 5% פורמלדהיד).
- תקן עבור 2.5 דקות על nutator. להוסיף heptane 1 מ"ל ו מערבולת 1 דקות. בואו להתיישב ~ 1 דק '.
- הסר את כל נוזל, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל 1x PBS. וורטקס 30 שניות. בואו להתיישב ~ 1 דק '.
- הסר את כל הנוזל, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
הערה: ביציות ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.
- # 2 אפשרות: קיבעון פורמלדהיד / cacodylate (תקן Mix Plus 8% פורמאלדהיד 100 מ"מ cacodylate).
- תקן עבור 6 דקות על nutator. בואו להתיישב 2 דקות. הסר נוזלי, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
הערה: ביציות ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.
- תקן עבור 6 דקות על nutator. בואו להתיישב 2 דקות. הסר נוזלי, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
5. הסרת ממברנות ( "רולינג")
- שימוש pipet פסטר מצופה, להוסיף ~ 500 1,000 ביציות לחלק (חול-מותז) החלבי של שקופית זכוכית. הסר את כל חלקי הגוף באמצעות מלקחי חומר זרים. אל תתנו ביציות להתייבש; להוסיף 1x PBS במידת הצורך.
- מניחים coverslip על גבי ביציות בעדינות ביציות "גליל" עד שכל ממברנות מוסרים (גרירת בקצה coverslip ברחבי ביציות עובד הכי טוב.) מדי פעם לבדוק את ההתקדמות מתחת למיקרוסקופ, הוספת עוד PBS 1x לפי הצורך. תשמור על עצמך כמו יותר מדי לחץ יהרוס את הביציות.
הערה: לקבלת immunofluorescence בלבד, להמשיך עם שלב 6. לדגים (עם או בלי immunofluorescence), להמשיך עם שלב 7.
6. מכתים נוגדן של תסיסנית ביציות
- כריית חסימה
- לשטוף ביציות התגלגל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל ~ 15 מ"ל PBS / 1% Triton X-100. ביציות Nutate בפתרון זה עבור לא פחות מ -1.5 שעות ולא יותר מ -2 שעות.שלב זה מאפשר חדירת נוגדן.
- בואו ביציות להתיישב ~ 2 דק '. סר נוזל יחד עם ממברנות רבות ככל האפשר, ולאחר מכן להוסיף PBS / 0.05% Triton X-100.
הערה: ממברנות יישב איטיים יותר ביציות התגלגלו. - תנו ביציות להתיישב ~ 2 דקות, ולאחר מכן להסיר את כל אבל ~ 1 מ"ל נוזל. העברת ביציות כדי סיימו צינור 1.5 מיליליטר ולהסיר נוזל נותר. הוסף 1 מ"ל PTB עבור חסימת nutate עבור שעה 1.
- מכתים נוגדן
- בולמי Pre של נוגדנים משני נגד עוברים.
הערה: צעד זה מבטל מכתים רקע מאינטראקציות נוגדן הלא ספציפית עם חלבונים תסיסנית.- אסוף ולתקן עוברים תסיסנית (~ 25 μl) לכל הליך טיפוסי 8. אחסן מתנול ב -20 ° C.
- הסר מתנול מעוברים, להוסיף 800 מתנול μl בתוספת 200 μl 1x PBS, nutate במשך 15 דקות. הסר 500 μl של supernatant ולהחליף עם 500 μl 1x PBS. ואז nutate במשך 15 דקות. חזור פעמיים (עבור סכום כולל של ~ 1 hr שוטף), ולאחר מכן לסיים ב PTB.
הערה: עוברים ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר. - סר נוזלי, מתמלא PTB 200 μl לכל הכנת ביצית, ולהוסיף נוגדנים משני שכותרתו fluorescently ב דילולים מתאימים (יש לזכור כי ההיקף הסופי יהיה 300 μl;. ראה שלב 7.4) Nutate ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (עדיף) או בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות.
הערה: נוגדנים מראש נספג ישמש בשלב 6.2.4.
הערה: שמור דגימות בחושך ככל האפשר פעם נוגדנים ניאון נוספו.
- הסר נוזל ביציות, מתמלא PTB 300 μl, ולהוסיף נוגדנים עיקריים ב דילולים מתאימים. Nutate ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (עדיף) או בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות.
- לשטוף ביציות ארבע פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם 1 מ"ל PTB.
- לְהַסִירנוזל ביציות, להוסיף 200 μl של supernatant מעובר (נוגדנים משני שקוע מראש). ואז למלא עם PTB 300 μl. Nutate בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות (עדיף) או על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף ביציות פעם במשך 15 דקות עם 1 מ"ל PTB, להסיר את נוזל. לאחר מכן מוסיפים 0.5 μl Hoechst 33342 ו 500 μl PTB ו nutate עבור 7 דקות.
- לשטוף ביציות פעמיים במשך 15 דקות כל אחד עם 1 מ"ל PTB.
הערה: ביציות יכולות להיות מותקנות בשקופית מייד או ניתן לאחסן PTB על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן הדמיה.
- בולמי Pre של נוגדנים משני נגד עוברים.
7. FISH (והמשך משלב 5 לעיל)
- לשטוף ביציות התגלגל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל ~ 15 מ"ל 2x SSCT. בואו ביציות להתיישב ~ 2 דק '. הסר את כל אבל ~ 0.5 מ"ל נוזל יחד עם ממברנות רבים ככל האפשר.
הערה: ממברנות יישב איטיים יותר ביציות התגלגלו. - העברת ביציות כדי צינור 0.5 מ"ל ולהסיר הנוזל הנותר. ברציפות להוסיף ולהסיר 500 μl20%, 40%, ופתרונות לפוראמיד 50%, nutating במשך 10 דקות בכל פתרון.
הערה: ביציות יישב איטיות עם אחוזים גבוהים של לפוראמיד. - הסר נוזלי, ולאחר מכן להוסיף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד, ו nutate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 עד 5 שעות.
הערה: incubations יותר לגרום חדירת בדיקה טובה יותר. - הסר נוזלי, והותיר אחריו לא יותר מ ~ 100 ביציות μl, ולהוסיף 36 μl הכלאה פתרון בתוספת 2 μl של החללית (50 ng / μl) ו -2 μl של מים או 2 μl של החללית 2 nd (טבלה 1).
- לדגור על 91 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות (FISH בלבד) או 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (FISH בתוספת immunofluorescence), ואחריו הדגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: פעולות אלה עשויות להתבצע ב thermocycler. - אל תסיר נוזלי. הוסף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד ואת nutate ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
- בואו להתיישב, להסיר את נוזל, להוסיף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד, גידולד nutate ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
- בואו להתיישב, להסיר את נוזל, להוסיף 500 μl 20% פתרון לפוראמיד, ו nutate בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- בצע שלושה שוטף מהיר 500 μl 2x SSCT (בוא להתיישב, להסיר ולאחר מכן להוסיף נוזל, להפוך מספר פעמים, חזור.) בוא להתיישב, להסיר את הנוזל, ולאחר מכן להוסיף 500 μl PTB ו nutate עבור 4 שעות.
8. נוגדן מכתים לאחר FISH
- הסר נוזל ביציות, מתמלאות PTB 300 μl, ולהוסיף 10 μl נוגדן אנטי α-טובולין מצומדות כדי FITC. לחלופין, נוגדנים אחרים יכולים לשמש, בעקבות בפרוטוקול לעיל. Nutate בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- לשטוף ביציות פעם במשך 15 דקות עם 500 PTB μl, להסיר את נוזל, ולאחר מכן להוסיף 0.5 μl Hoechst 33342 ו 500 μl PTB ו nutate עבור 7 דקות.
- לשטוף ביציות פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם 500 μl PTB.
הערה: ביציות יכולות להיות מותקנות בשקופית מייד או ניתן לאחסן PTB על 4 מעלות צלזיוס עד מוכןהַדמָיָה. שמור ביציות בחושך ככל האפשר פעם נוגדנים ניאון נוספו.
| שם חזור | כרומוזום | רצף אוליגו * |
| 359 | איקס | GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC |
| AACAC | 2 | AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC |
| dodeca | 3 | CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT |
| 1.686 | 2 + 3 | AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG |
| AATAT | 4 (+ Y) | AATATAATATAATATAATATAATATAATAT |
| * 359 רצף מאריק ג'ויס, תקשורת אישית, רצפים אחרים מהעמוד סאליבן et al. 8 | ||
טבלה 1: בדיקות FISH עבור חזרות centromeric תסיסנית.
| תְרוּפָה | מֵמֵס | ריכוז מניות | ריכוז סופי | זמן טיפול | השפעה |
| קולכיצין | אתנול | 125 מ"מ | 150 מיקרומטר | 10 דקות או 30 דקות | לערער-קינטוכור הלא (10 דק ') 9 או כל (30 דקות) microtubules |
| פקליטקסל | DMSO | 10 מ"מ | 10 מיקרומטר | 10 דק ' | לייצב מיקרופוןrotubules |
| Binucleine 2 | DMSO | 25 מ"מ | 25 מיקרומטר | 20 דק ' | לעכב קינאז אורורה B 10 |
טבלה 2: טיפול תרופתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטות שתיארנו כאן תוביל גביית ביציות תסיסנית בשלב מאוחר המייצגים שלושה שלבי המיוזה (איור 1). ביציות ב prophase מאופיינים בנוכחות מעטפת הגרעין, אשר גלוי על ידי חוסר האות טובולין באזור המקיף את karyosome (איור 1 א). Prometaphase היא התקופה לאחר התמוטטות מעטפת גרעין שבמהלכו מרכיב הכישור. במהלך prometaphase, את karyosome לובשת צורה ייחודית, נעשה ארוך מדי לעתים קרובות עם 4 הכרומוזומים ה מלבד המסה karyosome הראשי (איור 1B). Prometaphase מסכם עם metaphase, שבו ביציות תסיסנית לעצור באופן טבעי עד הביוץ. ב ביציות metaphase, את karyosome חזר בו לתוך צורה עגולה (איור 1 ג).
אנו מתארים כאן מ 'ethods לתפעל את המהירות והטלת ביצים של נקבות תסיסנית להעשיר עבור ביציות בין אם prometaphase או metaphase. ביציות מאוספים prometaphase מועשרים לעתים קרובות להציג את karyosome מאורך (איור 2 א) תוך אוספי metaphase מועשר או אוספים מן הנקבות תסיסנית בתולה, אשר כמעט לחלוטין לחסל-הטלה, בעיקר להראות את karyosome העגול (איור 2 ב). מעניין, אוספים prometaphase מועשרים גם בדרך כלל להראות צירים הרבה יותר חזק, דבר המצביעים על כך הוא שינוי karyosome ואת הציר בין prometaphase ו metaphase תסיסנית ביציות 9.
איור 3 מציג תמונות מייצגות משני הפרוטוקולים המתוארים כאן. נוגדנים נגד טובולין α (כדי להראות את הציר), CENP-C (להראות צנטרומר), ו INCENP (כדי להראות את הציר המרכזי) שמשו על ביציות קבועות עם FOrmaldehyde / heptane (איור 3 א). בדיקות עבור רצפים centromeric חוזרות על 2 כרומוזום nd (AACAC) ו -3 rd כרומוזום (dodeca) שימשו על ביציות קבוע עם פורמלדהיד / cacodylate ושיתוף מוכתם נוגדן α-טובולין לפי הפרוטוקול FISH (איור 3B). חללית AACAC מופיעה מספר מוקדים התקבצו בעוד חללית dodeca מופיעה כמוקד יחיד לכל כרומוזום. ביציות שטופלו 150 קולכיצין מיקרומטר במשך 10 דקות תוקנו עם פורמלדהיד / heptane (איור 3 ג). טיפול זה הוא מחסל את קינטוכור-microtubules שאינו ביותר, שתוצאתה כל microtubules פניית DNA ב מוקדי שכותרתו centromere. ביציות שטופלו 10 paclitaxel מיקרומטר במשך 10 microtubules מוגזם דקות המופע בציטופלסמה, אך השפעה מועטה על microtubules ציר (איור 3D). ביציות שטופלו 25 מיקרומטר Binucleine 2 במשך 20 דקות כדי לעכב הצג kinase B אורורה לאובדן מוחלט שלmicrotubules ציר (איור 3E).
איור 1: שלושה שלבים של ביציות תסיסנית בוגרת:. Prophase, prometaphase, ו Metaphase תמונות Confocal של ביציות לתסיסנית prophase (א), prometaphase (B), ואת metaphase (C) של ה- DNA I. המיוזה מוצג בכחול טובולין הוא מוצג בירוק בתמונות ממוזגות. ריבועים (ב) ו- (ג) להראות DNA בלבן. ברי סולם = 10 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:Prometaphase- לעומת קולקציות metaphase מועשר של ביציות תסיסנית. תמונות Confocal של ביציות תסיסנית מ- (A) prometaphase מועשר או מועשר metaphase (B) אוספים. DNA מוצג בכחול טובולין מוצג בירוק. ברי סולם = 10 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מכתים נוגדן, דגים, טיפולים תרופתיים של ביציות תסיסנית תמונות Confocal של ביציות תסיסנית עם DNA בכחול טובולין בירוק.. ברי סולם = 10 מיקרומטר. (א) Immunofluorescence ב פורמליןקיבעון דואר / heptane עם INCENP (ציר מרכזי) באדום CENP-C (צנטרומר) בלבן. (ב) דגים קיבעון פורמלדהיד / cacodylate עם AACAC באדום ו dodeca המוצגים לבן. (ג) הטיפול עם 150 קולכיצין מיקרומטר במשך 10 דקות עם CENP-C באדום. טיפול עם 10 מיקרומטר paclitaxel במשך 10 דקות (D) או 25 מיקרומטר Binucleine 2 במשך 20 דקות (E). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Staging תסיסנית ביציות
אם כי karyosome מוארך נראה בדרך כלל ב ביציות prometaphase, באמצעות karyosome צורה להבחין prometaphase מ ביציות metaphase יכול להיות בעייתי. במהלך prometaphase, את karyosome מתחיל כמו צורה עגולה, מתארך, ולאחר מכן חזר בו כדי צורה עגולה כמו הביצית מתקרבת מעצר metaphase. משמעות הדבר היא כי רבים ביציות prometaphase אין לי karyosome מוארך. בנוסף, אם ביציות מוטציה או מטופלים בתרופה נבחנות, karyosome צורה עלולה להיפגע, לא ניתן בשיטה זו כדי לביים ביציות. מכיוון סמנים אחרים להבחין בשלבים אלה אינם זמינים כרגע, אנו משתמשים בשיטה המתוארת לעיל כדי לתפעל את המהירות-ההטלה של נקבות תסיסנית להעשיר עבור ביציות בין אם prometaphase או metaphase. הרציונל הוא שאם ביציות להשקיע סכום מסוים של זמן prometaphase, וכן ללא הגבלת זמן עיבודested ב metaphase, שנמשך עד הטלה, אז יותר-הטלה מהירה יהיה להטות כלפי אחוז גבוה יותר של ביציות prometaphase, תוך-הטלה איטית תעשיר עבור metaphase. כמות המאמץ הנדרשת כדי לאסוף נקבות בתולה או לאסוף נקבות על מסגרת זמן קצרה יותר מ -2 ימים, כפי שתוארה על ידי Gilliland et al. 6, הוא לא מתוגמל על ידי גידול ניכר ביציות prometaphase. זה גם בלתי אפשרי להשתמש נספחים הגבו לביים ביציות מוכנות עם פרוטוקול זה כנספחים הגבו יוסרו יחד עם ממברנות. למרות זאת הוא לא ניתן לביים ביציות בודדות עם 100 ודאויות% בשיטה זו, הנתונים מן המועשר prometaphase או אוספים מועשרים metaphase ניתן לקחת יחד כדי להסיק מסקנות לגבי השלבים השונים הללו 9.
ביציות תסיסנית אינן מופרות עד שהם עוברים דרך oviduct; ולכן, בגלל הביציות שנאספו עבור הפרוטוקולי דואר המתואר כאן לבחון ביציות שנלקחו לפני הטלת ביציות אלו לא הופרו. המעבר דרך oviduct גם גורם הביצית כדי להפעיל ולחדש התקדמות מחזור התא. שיטות לבחון בשלבי מחזור התא לאחר metaphase אני קיים 11,12, אך הן מחוץ להיקף של פרוטוקול זה.
שיקולי קיבוע שיטה
אנו מתארים שתי שיטות נפרדות עבור הקיבעון של ביציות תסיסנית בשלב מאוחר. שיטת קיבוע פורמלדהיד / cacodylate תוארה לראשונה על ידי Theurkauf ואת האולי 3 ואת שיטת קיבוע פורמלדהיד / heptane תוארה לראשונה על ידי Zou et al. 4. בנוסף, שיטה שלישית (קיבעון מתנול) משמשת ב -13 מסוימים, אבל לא המתוארת כאן. הסרת ממברנות הביצית היא קצת יותר קשה לאחר קיבוע פורמלדהיד / heptane לעומת פורמלדהיד / cacodylate. הסיבה לכך היא "מתגלגל" תלויההים על חיכוך בין coverslip ואת הביצית, קיבעון פורמלדהיד / heptane עושה הביציות חלקלקות יותר. למרות הקושי המוסף הזה, הבחירה הראשונה שלנו של שיטת קיבוע כאשר בודקים נוגדנים חדשים הוא פורמלדהיד / heptane מכיוון שהיא מתאימה ביותר עבור רוב הנוגדנים שניסינו. מצד השני, אנו מעדיפים קיבוע פורמלדהיד / cacodylate לדגים, בעיקר ההקלות של הסרת קרום, למרות קיבעון פורמלדהיד / heptane גם הצליח. שתי שיטות אלה לשמר מורפולוגיה ביצית טובה יותר קיבעון מתנול, ולכן אנו ממליצים קיבעון מתנול רק במקרים של נוגדנים הם עקשנים לשיטות קיבעון משחררי פורמלדהיד.
הפרוטוקולים המתוארים כאן להתמקד הדמיה קבועה, על מנת להדגים שיטות יעילות עבור עיבוד ביציות תסיסנית בוגרת מקובל חדירת נוגדן, כלומר באמצעות הסרת ממברנות הביצית. שיטות חלופיות עבור קרום רםval (באמצעות מלקחיים 14 או sonication 13) אפשריים; עם זאת, אנו מוצאים "מתגלגלים" להיות השיטה היעילה והאמינה ביותר. טכניקות הדמיה לחיות גם תוארו במקומות אחרים 14-16 ו הן מחוץ להיקף של פרוטוקול זה.
המלצות FISH
דגי ביציות תסיסנית תוארו לראשונה על ידי Dernburg et al. 5. פרוטוקול זה תוכנן כדי לספק תנאים אופטימליים הכלאת בדיקה כדי הכרומוזומים הביצית המרוכזים, אבל הפרוטוקול המקורי לא היה אופטימלי עבור immunofluorescence. השיטה המתוארת לעיל כולל עיבודים עשינו כדי לשפר מכתים נוגדן של α-טובולין, וזה בעיקר מה אנו משתמשים בעת ביצוע FISH. עבור נוגדנים אחרים, הורדת הטמפרטורה של צעד denaturation (שלב 7.5) מ 80 ° C עשוי להיות נחוץ.
הבדיקות המפורטות כאן הן עבוררצפים חוזרים של heterochromatin ליד צנטרומר. בגלל הרצפים אלה הם מאוד החוזרות על עצמן, החלליות לחשל למקומות מרובים ואת האותות הקולקטיביים די חזקים. יש לנו הצלחה קטנה עם בדיקות עבור רצפים ב euchromatin, ואולי בגלל המבנה הייחודי של הכרומוזומים בעוד כלול karyosome המתומצתת.
הַדמָיָה
ביציות תסיסנית בוגרות, כמו הביציות של רוב האורגניזמים, הם גדולים, תאים בודדים. כלומר יש נפח גדול של הציטופלסמה המכיל גרעין יחיד. למרבה המזל, גרעין זה, הידוע גם בתור karyosome תסיסנית, ניתן לזהות בקלות כפי שהוא בדרך כלל ממוקם בדיוק מתחת הנספחים הגבו הקרובים לקליפה. הנספחים הגבו יוסרו יחד עם ממברנות הביצית, אך karyosome יכול עדיין להיות ממוקם על ידי מציאת divot הקטן בקליפת הביצית שבו הנספחים oNCE היה. התמונות הטובות ביותר מושגות מתוך ביציות כי כבר רכוב עם השקע הזה מול coverslip מאז זה מציב את karyosome הקרוב המטרה. למרות שזה עשוי להיות אפשרי לארגן הביציות בכיוון הזה לפני ההרכבה, אנחנו מעדיפים לעלות ביציות רבות באופן אקראי ולאחר מכן לחפש את השקופית עבור אלה בכיוון המועדף.
יישומים עתידיים
בעתיד זה יהיה חשוב לזהות סמנים כי באופן מהימן להבחין prometaphase אני metaphase לי צירים. יכולת בצורה מהימנה יותר לביים הביציות תפחית את ההסתמכות על חלופות עבודה אינטנסיבית יותר, כגון הדמית מספר גדול של ביציות מועשר במה או הדמיה לחיות, שיש לה גם בעיות הבימוי שלו. שיטה זו היא השיטה הבסיסית אשר ניתן להשתמש בהם כדי לנצל את ההתקדמות בגנטיקה תסיסנית ככלים חדשים מתפרסמים לשנות או לדפוק מוצרי גן. זה כולל שיטותלמקד חלבון פעילות ישירות עם תרופות חדשות או אסטרטגיות השפלה ממוקדות. בנוסף, שיטות אלה אינם מוגבלים הדמיה הצירים meiotic. כל מבנה בתוך הביצית, כגון שלד תא יקטין, יכול להיות מנותח באמצעות שיטות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical tubes | Various | ||
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC | Sigma | F2168 | clone DM1A |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| dextran sulfate | Various | ||
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| formamide | Sigma | 47670-250ML-F | |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| graduated 1.5 ml tubes | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| Hoechst 33342 | Various | ||
| magnesium chloride | Various | ||
| methanol | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium chloride | Various | ||
| sodium citrate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
References
- Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
- Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544 (2009).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605 (2015).
- Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
- Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
- Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).
- Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).
