Summary
Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.
Introduction
Het algemene doel van deze methode is om nauwkeurig te beoordelen en te kwantificeren in vivo microgliale fagocytose. Microglia de resident macrofagen weefsel van het centrale zenuwstelsel (CNS). Zij voeren verschillende functies onderhoud weefsel homeostase waarborgen. Deze omvatten immuun surveillance, secretie van neurotrofe factoren, en van cruciaal belang, fagocytose 1. Microgliale fagocytose is de sleutel bij diverse belangrijke gebeurtenissen tijdens de ontwikkeling van de hersenen en het netvlies, zoals fagocytose van irrelevante synapsen (pruning) en verwijdering van apoptotische neuronen 2-4. Bovendien heeft microgliale fagocytose van beschadigde of apoptotische neuronen, celafval en microben gebleken essentieel voor het behoud CNS homeostase bij volwassenen, 5 zijn. Tenslotte is microgliale fagocytose geïmpliceerd bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer en leeftijdsgebondenmaculaire degeneratie, waar het is gesuggereerd dat defecte of onvoldoende fagocytische capaciteit kan bijdragen aan de opbouw van amyloïd-β (Aß) plaques en drusen respectievelijk 6,7.
Microgliale functie wordt strak gereguleerd door hun micro-omgeving, met name door oplosbare factoren zoals tumor-groeifactor β of cel-cel interacties. Neuronen constitutief uiten verschillende celoppervlak liganden, zoals CD200 en CX3CL1, terwijl microglia uitsluitend de respectievelijke receptoren CD200R en CX3CR1 uiten. Deze receptoren bevatten immunoreceptor op basis van tyrosine motieven (ITIMs) in hun intracellulaire gedeelte. Deze remmer receptoren zijn essentieel voor het voorkomen van de overstimulatie van microglia, die kunnen bijdragen aan inflammatoire processen. Dus onder normale fysiologische omstandigheden, cel-cel interacties tussen neuronen en microglia microglia houden in een rusttoestand. Tijdens weefselbeschadiging echter neuronen downreguleren expression van deze liganden, verwijderen van hun remmend effect op microglia activatie. Microgliale functie (inclusief fagocytose) is dus nauw verbonden met hun micromilieu 8. Evenwel nog, er geen gestandaardiseerde assays microglia fagocytose studeren in een fysiologische omgeving of op een wijze die volledig repliceert het CNS micromilieu.
Verschillende assays zijn ontwikkeld om fagocytische activiteit van microglia in vitro, waarbij primaire of microglia microglia cellijnen gekweekt met doelcellen (bijvoorbeeld apoptotische neuronen) of fluorescerend gemerkte korrels meten. Target opname wordt vervolgens beoordeeld met fluorescerende beeldvorming microscopie of flowcytometrie 9-12. Deze testen laten testen hoe farmacologische of genetische manipulatie microgliale fagocytose van invloed kunnen zijn en, terwijl informatief, niet volledig te repliceren het complex in vivo omgeving. Indirecte methoden voor de behandeling van microgliale fagocytosein vivo gemeld: deze worden uitgevoerd door kleuring van moleculen verondersteld betrokken te zijn bij fagocytose (bijvoorbeeld CD68), meten fysieke nabijheid van microglia en doelen voor fagocytose (bijvoorbeeld gecompromitteerd neuronen of synaptische elementen), of door immunohistochemische detectie van fagocytische doelstellingen binnen microgliacellen (bijvoorbeeld Ap) 13-17. Twee studies hebben meer directe benadering gebruikt om microglia fagocytose te beoordelen in vivo. Hughes en collega's hebben gebruikt beeldvormende technieken om microglia opname van geleverd via de intracraniale route 18 kralen te meten. Sierra et al. Ontwikkelden een verfijnde methode voor een kwantitatieve beoordeling microglia fagocytose van apoptotische cellen met behulp complex beeldvormingstechnieken 4. Echter, deze methoden betrekken ingewikkelde protocollen voor het prepareren van weefsels, snijden, beeldvorming en analyse. We hebben eerder gebruikte flowcytometrische analyse om fagocytose van fotoreceptor uit te beoordelener segmenten door retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) cellen in de cultuur 19. We beschrijven hier een protocol opname van fluorescerend gemerkte deeltjes door retinale microglia als kwantitatieve maat van in vivo microglia fagocytose snelle beoordeling.
Het protocol hier beschreven maakt betrouwbare en kwantitatieve meting van retinale microgliale fagocytose in bijna zes uur in drie belangrijke stappen: (1) intravitreale afgifte van fluorescerend gemerkte deeltjes, (2) oogsten en bereiding van retinale weefsel, en (3) stroming cytometrische analyse. De werkwijze die we hebben ontwikkeld is een robuuste methode om microgliale fagocytose beoordelen in de retina, en het kan met succes worden gebruikt om te testen hoe verschillende verbindingen of genetische manipulatie wijzigt deze sleutel microgliale functie fysiologische instellingen. Als gespecialiseerde gebied van het CNS, de retina is een gemakkelijk toegankelijk modelsysteem microglia functie 20 bestuderen. Hoewel deze methode werd ontwikkeld in thij oog, wij geloven dat het kan nuttig zijn voor alle neurowetenschappers onderzoeken van microglia fagocytosefunctietesten zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werden in overeenstemming met de door het Scripps Research Institute ethische richtlijnen behandeld.
1. Voorbereiding van materialen voor Injectie
- Steriliseren een 33 G naald en spuit: demonteren en autoclaaf bij 115 ο C. Bereid naalden voor injectie door de stijgende in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Ontdooi fluorescent gelabelde deeltjes bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten. Bereid particle oplossing voor injectie door reconstitutie van een 50 mg / ml oplossing in steriel PBS met Ca2 + / Mg2 +.
OPMERKING: AF488-gemerkte deeltjes van schimmel oorsprong die zijn gevalideerd voor fagocytose assays worden in deze protocol 21-23. Voor een optimale opname, voor te bereiden deeltjes fris en onmiddellijk vóór injectie.
Noot 2: Particle concentraties kunnen worden geoptimaliseerd voor elke specifieke experiment.
2. intravitreale injectie van Bead Solution
LET OP: Twee people moeten de injectie uit te voeren, op een wijze zodanig dat de persoon die de injectie kan de muiswijzer en de focus op de oogbol te handhaven, terwijl de andere passeren van het geladen injectiespuit en duwt de zuiger.
- Verdoven het knaagdier door intraperitoneale injectie van 100 mg / ml ketamine en 10 mg / ml xylazine in een dosis van 20 gl / 10 g lichaamsgewicht. Vóór injectie gebruiken teen knijpen om het niveau van de anesthesie te beoordelen.
OPMERKING: Isofluraan heeft een diepgaand effect op myeloïde celfunctie dus het gebruik in deze bepaling worden vermeden 24,25. - Load naald met 0,5 ul van fluorescent gelabelde deeltje oplossing.
- Leg de muis zijdelings onder een chirurgische microscoop (Figuur 1A-B). Gebruik van een zacht materiaal, bijvoorbeeld een gel-pak, een betere positionering van de muis. Voor jonge muizen die de ogen nog niet open, open voorzichtig de oogleden met behulp van fijn 45 o schuin forceps door een fissuopnieuw langs de gleuf waar de oogleden zal uiteindelijk geopend.
- Met de hulp van de fijne 45 o hoek tang zorgvuldig toepassen druk rond het ooglid, zodat de oogbol iets knalt uit het stopcontact. Houd het hoofd met twee vingers boven het oor en de kaak en voorzichtig rekken de huid parallel aan de oogleden voor het oog iets uit de socket houden. Wees niet te dicht bij de hals (figuur 1B) te grijpen.
- Om de oogbol doorboren, steek de naald van de spuit in de cornea limbus (waar de cornea en sclera te sluiten). Dit is zichtbaar als een grijze cirkel bij gepigmenteerde muizen. Trek de naald iets naar een klein volume van glasvocht vloeistof te verdrijven en vervolgens te injecteren. De persoon die de injectie moet voorzichtig houd de muis met de ene hand en de naald met de andere; de tweede persoon moet langzaam duw de zuiger.
- Trek de spuit langzaam. Solliciteer oog hydraterende daalt voor het oog gehydrateerd te houden. </ Li>
- Laat het knaagdier herstellen in een kooi op een warmte pad en blijft het dier volgen. Als het werken met pups, hoeft het dier niet terug naar een kooi met andere alarm dieren totdat het ademt en in staat van spontane beweging. Als het werken met volwassenen, zijn de knaagdieren niet terugkeren naar een kooi met andere alarm dieren totdat het herwint borstbeen recumbence.
3. Het oogsten van retinale Tissue
LET OP: retinale weefsel van de ogen niet geïnjecteerd met fluorescent gelabelde deeltjes worden verzameld als een controle voor flowcytometrische analyse. Hoewel de test kan worden uitgevoerd met behulp van een enkele netvlies, voor de beste prestaties, twee netvliezen moeten worden samengevoegd.
- Verzamel retinale weefsel 3 uur na intravitreale injectie van fluorescent gelabelde deeltjes.
OPMERKING: Terwijl de tijd na injectie van het deeltje oplossing kan worden geoptimaliseerd voor elke specifieke experiment bleek dat 3 uur na injectie kon deeltje opname gezien worden in het grootste lagen of de retina (Figuur 1C-D). - Offer muizen door cervicale dislocatie.
- Verzamel de oogbollen door zachtjes te drukken tegen het ooglid met de hulp van de fijne 45 o schuine tang om de oogbol proptose. Plaats de tang achter de oogbal en pull.
- Ontleden de retina onder een stereomicroscoop. Breng de oogbol een petrischaal met een kleine hoeveelheid PBS met Ca2 + / Mg2 +. In een droge plaats van de petrischaal, perforeren de oogbol in het hoornvlies limbus met de punt van superfijne tang.
- Houd de oogbol met behulp van fijn 45 o hoek pincet en gebruik veer schaar rond het corneale limbus te snijden, tot ongeveer de helft van het corneale limbus omtrek wordt gesneden.
- Houd de oogbol met de fijne 45 o hoek pincet en breng de oogbol in PBS. Met een tweede paar fijne 45 o hoek tang te scheuren het hoornvlies en sclera uit elkaar. De lens en het netvlies zal komen intact.
- Scheid de lens en netvlies. Verzamel de retina en overbrengen in een 5,4 ml polystyreen reageerbuis met 2 ml PBS met Ca2 + / Mg2 +.
4. Het voorbereiden van een enkele celsuspensie
- Bereid enkelvoudige celsuspensies met een neuronaal weefsel dissociatie kit met kleine wijzigingen van instructies van de fabrikant. Kort samengevat, fijnstampen netvlies door op en neer pipetteren met een pipet P1000 en uitvoeren van een enzymatische digestie op 37 ° C zonder schudden.
5. kleuring Single Cell Charms voor Flow cytometrische analyse
- Resuspendeer cellen in 200 gl vlekken buffer (Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,2% runderserumalbumine (BSA) en 0,09% natriumazide) en overbrengen in een U-bodem 96-well plaat. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 130 x g.
LET OP: Natriumazide is schadelijk voor mens en milieu. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen eennd gooi afval in overeenstemming met de plaatselijke regelgeving. - Keer de plaat over een wastafel om supernatant te verwijderen. Fc receptoren, resuspendeer cellen blokkeren 25 pl vlek buffer die 5 ug / ml anti-muis CD16 / CD32 antilichaam per putje. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 25 pl vlekken buffer die 0,5 ug / ml anti-muis Ly6C-APC-Cy7, 0,5 ug / ml anti-muis Ly6G-Pe-Cy7 en 2,5 ug / ml anti-muis CD11b-AF650. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 130 x g. Keer de plaat om bovenstaande ontdoen. Wassen cellen te resuspenderen in 200 pl buffer kleuring.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 130 x g. Hersuspenderen in 200 pl vlek buffer die 0,5 ug / ml propidiumjodide (PI). Transfer naar 1,2 ml microtiter buizen.
- Was putjes met een additionele 100 pl vlekken buffer die 0,5 ug / ml PI en zwembad met de vorige 200 ul in de1,2 ml microtiter buizen. Een totaal volume van 300 gl gekleurde cellen wordt verkregen.
6. Flow cytometrische analyse
- Gebruik van een conventionele drie laser (violet, blauw en rode laser), vermijd PE, PerCP-Cy5.5, BV510 en PI kleurstoffen door aanzienlijke overloop van de zeer heldere fluorescerende AF488-deeltjes. Gebruik een vierde (geel) laser om deze test te optimaliseren, omdat het zorgt voor een PE-gemerkte antilichamen en PI (in de mCherry kanaal in plaats van de PerCP-Cy5.5 channel) te gebruiken (figuur 2).
LET OP: Als een gele laser niet beschikbaar is, gebruik dan een dode cel uitsluiting kleurstof in een ander kanaal. - Gate aan PI negatieve cellen (PI) om dode cellen (Figuur 2B) uit te sluiten.
- Na uitsluiting van dode cellen, poort aan CD11b positieve cellen (CD11b +), omvat deze term alle myeloïde cellen (figuur 2C).
- Binnen het CD11b + bevolking, hek aan Ly6C - / Ly6G - uit te sluitenneutrofielen (CD11b + / Ly6G +) en monocyten (CD11b + / + Ly6C Figuur 2D). Na gating op microglia (hier gedefinieerd als CD11b + / Ly6C - / Ly6G - voor de eenvoud), twee duidelijke bevolking moet zichtbaar zijn; een negatief en een positief voor de fluorescerend gemerkte deeltjes. Fagocytische cellen deeltjes hebben opgenomen en daarom AF488 + (Figuur 2E).
LET OP: Ly6C positief of Ly6G positieve populaties kan ook worden geanalyseerd om deeltjes opname te meten met behulp van deze vlekken aanpak. Het percentage fagocytische CD11b + cellen correleert goed met het percentage van de fagocytische microglia (figuur 2F). Onderzoekers zonder flowcytometrie verbeteren, kan een eenvoudigere analyse CD11b kleuring alleen worden uitgevoerd, hoewel dit zal fagocytische neutrofielen en monocyten, en microglia. Binnen deze CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> populatie, deze cellen zijn> 99% microglia zoals beoordeeld door kleuring met de markers F4 / 80 en CX3CR1; Deze markers kunnen worden toegevoegd, maar niet noodzakelijk in onze handen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier een werkwijze beschrijven we het aantal fagocyterende retinale microglia snel en betrouwbaar te kwantificeren in een fysiologische instelling met flowcytometrische analyse (figuur 2). Deze methode wordt aangepast om het effect van verbindingen en / of genetische manipulatie te testen op de fagocytische capaciteit van microglia (figuren 3A, 3B). Het kan ook worden gebruikt bij jonge (10-20 dagen postnatale) en volwassen muizen (Figuur 3C). Verschillende doses van lipopolysaccharide (LPS) intraperitoneaal toegediend. 24 uur na LPS challenge, werd de hier beschreven protocol dat wordt gebruikt om het netvlies microglia fagocytosefunctietesten (figuur 3A) te beoordelen. Een dosis van 1,42 mg / kg LPS induceerde een statistisch significante toename van het percentage fagocytische microglia vergelijking met dragercontrole (figuur 3B), zoals te verwachten 26.
Figuur 1: intravitreale injectie Setup en vertegenwoordiger retinale Sectie toont fluorescent gelabelde Deeltjes in het netvlies Lagen. (A) Een gel pack is gepositioneerd onder de dissectie microscoop. (B) een knaagdier wordt gedrukt, zoals afgebeeld aan het oog te positioneren voor intravitreale injectie. (C) Drie uur na injectie fluorescent gelabelde deeltjes te zien gedurende het grootste retinale lagen. (D , E) CX3CR1 GFP / GFP muizen en deeltjes gemerkt met een rode fluorofoor gebruikt om deeltjes opname visualiseren microglia. Microglia in de diepere (D) en oppervlakkige (E) lagen nemen deeltjes. Schaal bars -. 20 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gating strategie te selecteren Fagocytische microglia (A) Single cellen suspensies van retinaal weefsel van een p10 muizen geanalyseerd (B) Na uitsluiting van dode cellen (PI +), (C) CD11b + cellen worden geselecteerd (D) To... selecteert alleen voor microglia, CD11b + neutrofielen (Ly6G +) en monocyten (Ly6C +) worden uitgesloten. (E) fagocytische microglia zal fluorescerend gemerkte deeltjes hebben. (F) Het aantal fagocyterende CD11b + cellen is vergelijkbaar met die van microglia (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, samengevoegd uit drie onafhankelijke experimenten; foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM.rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Microglia fagocytosefunctietesten kan worden bepaald na LPS Challenge en in Pups en volwassen muizen (A) De jonge muizen (p10) werden uitgedaagd met intraperitoneale LPS in verschillende doses, 24 uur voor het beoordelen van fagocytose (B) Challenge met 1,42 mg /. kg resulteerde in een significant verhoogd percentage fagocytische retinale microglia vergelijking met besturingsorganen (p = 0,0021). (C) Dit protocol kan worden gebruikt om retinale microglia fagocytosefunctietesten puppygewicht en volwassen muizen zowel meten. Er is een aanzienlijk kleiner percentage fagocytische microglia bij volwassen muizen in vergelijking met jonge (p10) muizen (p = 0,019) niet blootgesteld aan LPS. n = 9 -12, samengevoegd van drie naar vieronafhankelijk experiment; foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn drie cruciale stappen in deze werkwijze: (1) intravitreale injectie van fluorescent gelabelde deeltjes; (2) het oogsten en de voorbereiding van het netvlies weefsel; en (3) stroom cytometrische analyse. We raden de onderzoekers oefenen intravitreale injecties voorafgaand aan het uitvoeren van de methode die we hier presenteren. Albino muizen (bijvoorbeeld BALB / c) en een gekleurde oplossing (bijvoorbeeld fluorescerend gemerkte deeltjes) kan worden gebruikt voor eenvoudige visualisatie van de naald en geïnjecteerde oplossing. Intravitreale injecties zijn uitdagend en wanneer niet correct zal leiden tot vertekende en variabele resultaten. Algemene problemen van slechte injectietechniek zijn perforatie van de lens en / of schade aan het netvlies, wat kan leiden tot bloeden en ontsteking. Om het risico van trauma aan het oog te minimaliseren, dient het knaagdier in een stabiele positie met minimale beweging van het hoofd. Om de oogbol te dringen, moet de spuit langzaam en niet worden geplaatst te ver geduwd om hitting te voorkomende lens. Een andere veel voorkomende complicatie is reflux van het geïnjecteerde materiaal uit het oog. Om dit te voorkomen, moet de zuiger langzaam depressief en, na de injectie, moet de oogbol worden toegestaan om terug te trekken in de oogkas en de spuit moet langzaam worden teruggetrokken. De beste intravitreale injecties activeren microglia op een laag niveau, maar duidelijke verschillen tussen de onbehandelde en behandelde groepen kan worden gemeten. Het is essentieel dat passende controles (bijvoorbeeld niet-betwiste muizen) worden in elk experiment uitgangswaarde fagocytische te zijn vastgesteld. Een ander aspect van deze methode praktijk vereist het netvlies dissectie. Om te zorgen voor vergelijkbare single cell voorbereidingen over exemplaren, moet retinale weefsel snel en met minimale mogelijke verstoring weefsel worden verzameld. Het uitvoeren van de laatste stappen van de dissectie in PBS (zie 3,4-3,7) zal collectie te vergemakkelijken. Tenslotte is het belangrijk om het retinale weefsel voor flowcytometrie correct te bereiden. Geactiveerde microglia upregulate Fcreceptoren en derhalve niet-specifieke binding aan het Fc-gedeelte van antilichamen optreden 7. Een Fc blok moet worden uitgevoerd om niet-specifieke kleuring te voorkomen. Selectie van geschikte fluoroforen en compensatie set-up is ook belangrijk 27.
Wij gebruiken routinematig muizen 10-20 dagen postnatale voor deze experimenten jaar. Dit kan echter ook protocol gebruikt om microgliale fagocytosefunctietesten in volwassen muizen (figuur 3C) te beoordelen. We merken door de aanwezigheid van de hyaloid vasculatuur populaties van exogene myeloïde cellen (Ly6C + of Ly6G +) zijn meer prominent in jonge muizen (ongeveer 40 - 50% van CD11b + cellen) dan bij volwassenen (ongeveer 5% van alle CD11b + cellen). Onderzoekers moeten de leeftijd het meest geschikt is voor hun experimenten te bepalen. Het protocol hier gepresenteerde maakt robuuste detectie van de niveaus van fagocytische microglia in het netvlies. Toch raden wij 3-4 biologischeal gerepliceerd worden gebruikt in elk experiment en dat ten minste drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Terwijl de in dit protocol deeltjes zijn gevalideerd voor fagocytose assays 21-23, als extra controle nodig immunohistochemische co-lokalisatie van de deeltjes met specifieke fagocytische merkers kan worden uitgevoerd.
Een mogelijke beperking van deze methode is differentiële toegang van microglia aan de deeltjes. In de normale retina, microglia bevinden in twee lagen, de diepere buitenste plexiform laag, en de meer oppervlakkige binnenste plexiform laag, die dichter bij het glaslichaam 7. Bij stimulatie, of tijdens het verouderen, microglia kunnen migreren in alle lagen van het netvlies. In deze werkwijze worden fluorescerend gemerkte deeltjes geïnjecteerd in het glasachtige lichaam. Drie uur na injectie resulteert in partikels gehele retina en in het bijzonder langs het glasachtige oppervlak. Onderzoekers kunnen de concentrati verder te optimaliserenop deeltjes of na injectie voor hun experimenten. Het is waarschijnlijk dat microglia in dichter bij de glasachtige gemakkelijker toegang tot de deeltjes hebben. Toch laten we zien dat de deeltjes verspreid over het netvlies en worden door microglia genomen over alle lagen, maar niet in retinale pigmentepitheel (RPE) cellen, waarschijnlijk als gevolg van beperkte toegang bead (figuur 1C-E). We moeten nog bepalen of subretinale microglia (die kan accumuleren met leeftijd) toegang tot de deeltjes zal verkrijgen. Als dit belangrijk voor de onderzoeker kan dit protocol worden uitgevoerd na zorgvuldige subretinale injectie van de deeltjes. Een andere belangrijke overweging is dat er wellicht inherent verschillende gedragingen tussen retinale microglia microglia en in andere gebieden van het CNS. Het is bekend dat specifieke hersengebieden verschillende gevoeligheden voor ziekten. Bijvoorbeeld, de ziekte van Parkinson, neuronen in de substantia nigra vooral worden getroffen, terwijl in Alzziekte Heimer's, worden de hippocampus neuronen vooral worden getroffen 28. Wanneer derhalve het bestuderen van de pathologie van een specifieke ziekte, hersengebied is waarschijnlijk een belangrijke factor. Een soortgelijk protocol bij de hier beschreven kan worden uitgevoerd na intracraniale injectie om mogelijke verschillen in de fagocytische respons tussen netvlies en hersenen microglia verkennen. De retina heeft veel gemeen met andere regio's van de hersenen, waaronder de aanwezigheid van een bloed-retina barrière 20. Retina microglia en hersenen microglia uit dezelfde dooierzak voorlopers en lijken zeer sterk op elkaar lijken en morfologie celoppervlak marker-expressie 7,29. Bovendien hebben verschillende hersenziekten (zoals de ziekte van Alzheimer, beroerte en multipele sclerose) oculaire manifestaties, wat aangeeft dat het netvlies is ook beïnvloed 20. Terwijl de onderzoekers moeten zich bewust zijn van mogelijke regionale verschillen, we geloven dat dit is een informatief model voorAlle microglia onderzoek, en suggereren dat alle neurowetenschappers bestuderen microgliale fagocytose dit protocol zou kunnen gebruiken.
Een duidelijk voordeel van het uitvoeren van deze test in het oog is dat meerdere technieken ontwikkeld om diverse neurogene spanningen induceren in de retina en de stress responsen kunnen in vivo worden gevolgd en gekwantificeerd met behulp van gestandaardiseerde protocollen 30. Door het induceren neurogene stress en vervolgens uitvoeren van de hier beschreven test kunnen onderzoekers microglia functie analyseren over een breed spectrum van beledigingen die variëren in ernst. Tot slot, in combinatie met flowcytometrie sorteertechnieken, dit protocol heeft het voordeel ten opzichte van immunohistochemie dat het kan zorgen voor diepgaande analyse van fagocytische microglia (bv, qPCR, celcultuur, proteomics).
Opname van deeltjes is eerder gebruikt om fagocytosefunctietesten, zowel in vitro en in vivo systemen meten. de latter betrokken intracraniële injectie van deeltjes, het oogsten en de bevriezing van hersenweefsel, cryosectioning, immunokleuring, beeldvorming en post-imaging analyse 18. Het protocol hier gepresenteerde zorgt voor veel snellere kwantificering van retinale microglia fagocytosefunctietesten. Het heeft het voordeel boven in vitro systemen die de gevoelige microglia niet uit hun micromilieu verwijderd, waardoor beoordeling van fagocytosefunctietesten in een fysiologische omgeving. Specifiek moet het testen hoe defecten in andere celtypes (bijvoorbeeld genetische ablatie van genen in neuronen) beïnvloeden microglia fagocytosefunctietesten schakelen. Het heeft ook het voordeel ten opzichte van voorgaande in vivo testen die gebruikt flowcytometrie, waardoor snelle, kwantitatieve en nauwkeurige detectie van fagocytische cel populaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 ml Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
