Summary
fagocitosi microglia è fondamentale per il mantenimento della omeostasi tissutale e fagocitaria inadeguata è stato implicato nella patologia. Tuttavia, valutare la funzione microglia in vivo è tecnicamente impegnativo. Abbiamo sviluppato una tecnica semplice ma robusto per monitorare e quantificare il potenziale di fagocitosi microglia in un ambiente fisiologico preciso.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di valutare con precisione e quantificare in vivo fagocitosi microglia. Microglia sono i macrofagi tessuto residenti del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono una varietà di funzioni per assicurare il mantenimento dell'omeostasi tissutale. Questi includono sorveglianza immunitaria, la secrezione di fattori neurotrofici e, di fondamentale importanza, la fagocitosi 1. Fagocitosi microglia è fondamentale in molti importanti eventi durante lo sviluppo del cervello e della retina, come la fagocitosi delle sinapsi irrilevanti (potatura sinaptica) e la rimozione dei neuroni apoptotici 2-4. Inoltre, fagocitosi microglia dei neuroni danneggiati o apoptotici, detriti cellulari, e microbi ha dimostrato di essere essenziale per il mantenimento dell'omeostasi CNS attraverso adulta 5. Infine, la fagocitosi microglia è stato implicato nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer e legata all'etàdegenerazione maculare, dove è stato suggerito che la capacità dei fagociti difettoso o insufficiente può contribuire alla formazione di amiloide beta-placche (Ap) e drusen, rispettivamente 6,7.
la funzione della microglia è strettamente regolata dal loro microambiente, in particolare da fattori solubili come il fattore di crescita tumorale-β o interazioni cellula-cellula. I neuroni costitutivamente esprimono vari ligandi di superficie cellulare, come il CD200 e CX3CL1, mentre microglia esprimono esclusivamente i rispettivi recettori CD200R e CX3CR1. Questi recettori contengono immunoreceptor motivi di inibizione delle tirosin-based (ITIMs) nella loro porzione intracellulare. Questi inibitore recettori sono fondamentali per prevenire l'eccessiva stimolazione della microglia, che può contribuire alla neuroinfiammazione. Così, in condizioni fisiologiche normali, interazioni cellula-cellula tra i neuroni e microglia mantenere microglia in stato di quiescenza. Durante lesioni dei tessuti, tuttavia, i neuroni possono down-regolare expression di tali ligandi, rimuovendo il loro effetto inibitorio sull'attivazione microglia. La funzione della microglia (compresa la fagocitosi) è dunque strettamente legata alla loro microambiente 8. Tuttavia, ad oggi, non esistono test standardizzati per studiare microglia fagocitosi in un contesto fisiologico o in un modo che replica pienamente la loro microambiente CNS.
Diversi test sono stati sviluppati per misurare l'attività fagocitaria dei microglia in vitro, dove microglia primarie o linee cellulari microgliali sono messi in coltura con cellule bersaglio (ad esempio, i neuroni apoptotici) o perline fluorescente. L'assorbimento di destinazione viene poi valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza per immagini o citometria a flusso 9-12. Questi test permettono di prova di come la manipolazione farmacologica o genetica può influenzare la fagocitosi microglia e, mentre informativo, non riescono a replicare pienamente il complesso in un ambiente vivo. I metodi indiretti per l'esame fagocitosi microgliain vivo sono stati segnalati: questi sono realizzati mediante colorazione delle molecole si ritiene siano coinvolti nella fagocitosi (ad esempio, CD68), valutando la vicinanza fisica della microglia e obiettivi per la fagocitosi (ad esempio, i neuroni compromessi o elementi sinaptiche), o per la rilevazione immunoistochimica di fagociti obiettivi all'interno delle cellule microgliali (ad esempio, Ap) 13-17. Due studi hanno utilizzato metodi più diretti per valutare microglia fagocitosi in vivo. Hughes e colleghi hanno utilizzato tecniche di imaging per misurare l'assorbimento microglia di perline consegnati per via intracranica 18. Sierra et al. Ha sviluppato un metodo raffinato per valutare quantitativamente microglia fagocitosi delle cellule apoptotiche utilizzando tecniche di imaging complesse 4. Tuttavia, questi metodi comportano protocolli complicati preparazione del tessuto, sezionamento, imaging e analisi. Abbiamo usato in precedenza l'analisi di citometria di flusso per valutare la fagocitosi di fotorecettori fuorisegmenti er di cellule epitelio pigmentato retinico (RPE) nella cultura 19. Qui, descriviamo un protocollo per valutare rapidamente l'assorbimento di particelle fluorescente di microglia retina come una misura quantitativa della microglia in vivo fagocitosi.
Il protocollo che descriviamo qui consente la misurazione affidabile e quantitativa del retinale fagocitosi microgliali in meno di sei ore in tre fasi fondamentali: (1) fornitura intravitreale di fluorescenza etichettati particelle, (2) raccolta e preparazione del tessuto retinico, e (3) Flusso analisi di citometria. Il metodo abbiamo sviluppato un metodo robusto per valutare fagocitosi microglia nella retina, e può essere utilizzato con successo per verificare come vari composti o manipolazione genetica alterano questo tasto funzione microgliali in contesti fisiologici. Come una zona specializzata del SNC, la retina è un sistema modello facilmente accessibile per studiare la funzione microglia 20. Mentre questo metodo è stato sviluppato in tegli occhio, riteniamo possa essere utile per tutti i neuroscienziati che studiano la funzione microglia fagocitaria.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida etiche stabilite dalla Scripps Research Institute.
1. Preparazione dei Materiali per iniezione
- Sterilizzare un ago 33 G e la siringa: smontare e autoclave a 115 ο C. Preparare aghi per l'iniezione da aumento in sterile tampone fosfato (PBS).
- Scongelare particelle fluorescente a temperatura ambiente per 5 - 10 minuti. Preparare la soluzione di particelle per l'iniezione mediante ricostituzione di 50 mg / ml soluzione in PBS sterile con Ca2 + / Mg 2+.
NOTA: le particelle AF488-etichettate di origine fungina che sono stati convalidati per saggi fagocitosi sono utilizzati in questo protocollo 21-23. Per assorbimento ottimale, preparare particelle fresco ed immediatamente prima dell'iniezione.
Nota 2: particelle concentrazioni possono essere ottimizzati per ogni esperimento specifico.
2. intravitreale iniezione di soluzione Bead
NOTA: Due people sono necessari per effettuare l'iniezione, in modo tale che la persona che effettua l'iniezione può tenere il mouse e mantenere l'attenzione sul bulbo oculare, mentre l'altra persona passa la siringa caricata e spinge il pistone.
- Anestetizzare il roditore mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / ml ketamina e 10 mg / ml xilazina alla dose di 20 ml / 10 g di peso corporeo. Prima dell'iniezione, usare punta pizzico per valutare il livello di anestesia.
NOTA: Isoflurano ha un profondo effetto sulla funzione delle cellule mieloidi, in tal modo, il suo utilizzo nel corso di questo test deve essere evitato 24,25. - Ago di carico con 0,5 soluzione delle particelle ml di fluorescente.
- Disporre il mouse lateralmente sotto un microscopio chirurgico (Figura 1A-B). Utilizzare un materiale morbido, ad esempio, una confezione di gel, per un migliore posizionamento del mouse. Per i giovani topi in cui gli occhi non sono ancora aperte, aprire delicatamente le palpebre con l'aiuto di sottili 45 o pinze ad angolo con la creazione di un fissuri lungo la fessura da cui le palpebre finiranno aperta.
- Con l'aiuto di sottili 45 o angolata pinza applicare accuratamente la pressione intorno alla palpebra, in modo che il bulbo oculare si apre un po 'dalla presa di corrente. Tenere la testa con due dita appena sopra l'orecchio e la mascella e delicatamente allungare la pelle in parallelo alle palpebre per mantenere leggermente l'occhio dalla presa. Fare attenzione a non capire troppo vicino alla gola (Figura 1B).
- Per forare il bulbo oculare, inserire l'ago della siringa in limbus corneale (dove la cornea e nella sclera Connect). Questo è visibile come un cerchio grigio in topi pigmentati. Ritrarre l'ago leggermente per espellere un piccolo volume di liquido vitreale e poi iniettare. La persona che esegue l'iniezione deve tenere delicatamente il mouse con una mano e l'ago con l'altra; la seconda persona dovrebbe spingere lentamente lo stantuffo.
- Ritrarre la siringa lentamente. idratante Applicare collirio per mantenere l'occhio idratato. </ Li>
- Lasciate che il roditore recuperare in una gabbia su un tappetino di calore e continuare a monitorare l'animale. Se si lavora con i cuccioli, non rispedire l'animale in una gabbia con altri animali allarme fino a quando non è la respirazione e capaci di movimento spontaneo. Se si lavora con gli adulti, non restituiscono il roditore in una gabbia con altri animali allarme fino a quando riacquista prona sternale.
3. La raccolta di tessuto retinico
NOTA: tessuto retinico da occhi non iniettati con fluorescenza etichettati particelle devono essere raccolti come controllo per l'analisi di citometria di flusso. Anche se il test può essere eseguito utilizzando un unico retina, per le migliori prestazioni, due retine devono essere raggruppate.
- Raccogliere retinico tessuto 3 ore dopo l'iniezione intravitreale di particelle fluorescente.
NOTA: Mentre il tempo dopo l'iniezione della soluzione di particelle può essere ottimizzato per ogni esperimento specifico, abbiamo riscontrato che 3 ore dopo l'iniezione, l'assorbimento delle particelle potrebbe essere visto in tutta la maggior parte degli strati of retina (Figura 1C-D). - Sacrificio topi da dislocazione cervicale.
- Raccogliere i bulbi oculari premendo delicatamente contro la palpebra con l'aiuto di sottili 45 o pinze ad angolo per proptose il bulbo oculare. Posizionare la pinza dietro il bulbo oculare e tirare.
- Sezionare la retina sotto un microscopio da dissezione. Trasferire il bulbo oculare per una piastra di Petri contenente una piccola quantità di PBS con Ca 2+ / Mg 2+. In una zona asciutta della scatola di Petri, forare il bulbo oculare nel limbus corneale con la punta di una pinza superfine.
- Tenere il bulbo oculare con l'aiuto di sottili 45 o pinza angolata e usare le forbici per tagliare molla intorno al limbus corneale, fino viene tagliato circa la metà della circonferenza limbus corneale.
- Tenere il bulbo oculare con le belle 45 o pinze ad angolo e portare il bulbo oculare in PBS. Con una seconda coppia di sottili 45 o pinza angolata strappare la cornea e sclera parte. La lente e la retina usciranno intact.
- Separare la lente e la retina. Raccogliere la retina e trasferire in una provetta 5,4 ml di polistirolo contenente 2 ml di PBS con Ca 2+ / Mg 2+.
4. Preparare una sospensione cellulare singolo
- Preparare sospensioni singola cella utilizzando un kit di tessuti di dissociazione neuronale con piccole modifiche alle istruzioni del produttore. In breve, retine Triturare pipettando su e giù con una pipetta P1000 ed eseguendo una digestione enzimatica a 37 ° C senza agitazione.
5. colorazione sospensioni singola cella per analisi di flusso citometrica
- Risospendere le cellule in 200 ml di buffer di colorazione (PBS Dulbecco con albumina 0,2% di siero bovino (BSA) e 0,09% di sodio azide) e trasferimento in un piatto di U-bottom 96 pozzetti. Centrifugare per 5 min a 130 x g.
NOTA: sodiazide è dannosa per l'uomo e per l'ambiente. Utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale di unND smaltire rifiuti in conformità alla normativa vigente. - Capovolgere la piastra su un lavandino di scartare il surnatante. Per bloccare i recettori Fc, risospendere le cellule in 25 ml di tampone macchia contenente 5 mg / ml di anticorpi anti-topo CD16 / CD32 per pozzetto. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 25 ml di tampone colorazione contenente 0,5 mg / ml di anti-topo Ly6C-APC-Cy7, 0,5 mg / ml di anti-topo Ly6G-Pe-Cy7 e 2,5 mg / ml di anti-topo CD11b-AF650. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Centrifugare per 5 min a 130 x g. Capovolgere la piastra di scartare il surnatante. Lavare risospensione delle cellule in 200 ml di buffer di colorazione.
- Centrifugare per 5 min a 130 x g. Risospendere in 200 ml di tampone macchia contenente 0,5 mg / ml di ioduro di propidio (PI). Trasferimento a tubi microtitolazione 1.2 ml.
- Lavare i pozzetti con altri 100 ml di buffer di colorazione contenente 0,5 mg / ml di PI e la piscina con le precedenti 200 microlitri nel1,2 ml tubi microtitolazione. Un volume totale di 300 microlitri di cellule colorate si ottiene.
6. analisi di citometria di flusso
- Utilizzando un convenzionale a tre laser (viola, blu, e laser rosso), evitare di PE, PerCP-Cy5.5, BV510 e coloranti PI a causa della ricaduta significativa dai estremamente luminose fluorescenti AF488-particelle. Utilizzare una quarta laser (giallo) per ottimizzare questo saggio, in quanto consente per anticorpi PE-marcato e PI (nel canale mCherry posto del canale PerCP-Cy5.5) da utilizzare (figura 2).
NOTA: se un laser di colore giallo non è disponibile, utilizzare un colorante esclusione cellula morta in un altro canale. - Porta il PI cellule negative (PI-) di escludere le cellule morte (Figura 2b).
- Dopo aver escluso le cellule morte, porta sulle cellule positive CD11b (CD11b +), questo includerà tutte le cellule mieloidi (Figura 2C).
- All'interno della popolazione CD11b +, cancello sulla Ly6C - / Ly6G - di escludereneutrofili (CD11b + / Ly6G +) e monociti (CD11b + / + Ly6C; Figura 2D). Dopo gating su microglia (qui definito come CD11b + / Ly6C - / Ly6G - per semplicità), due popolazioni chiare dovrebbero essere visibili; uno negativo e positivo per le particelle fluorescente. Fagociti avranno ripreso particelle e sono pertanto AF488 + (Figura 2E).
NOTA: Ly6C positivo o Ly6G popolazioni positivi può anche essere analizzato per misurare l'assorbimento di particelle utilizzando questo approccio colorazione. La percentuale di fagociti CD11b + correla bene con la percentuale di microglia fagociti (Figura 2F). Per i ricercatori senza esperienza citometria di flusso, un'analisi semplice con solo CD11b colorazione può essere eseguita, anche se questo includerà neutrofili e monociti fagocitosi, così come microglia. All'interno di questo CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> popolazione, queste cellule sono> 99% microglia come giudicato dalla colorazione con marcatori F4 / 80 e CX3CR1; questi marcatori possono essere aggiunti, ma non sono necessari nelle nostre mani.
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Representative Results
Qui si descrive un metodo per rapido e affidabile quantificare il numero di microglia retiniche fagocitiche in un ambiente fisiologico mediante analisi citofluorimetrica (Figura 2). Questo metodo può essere adattato per testare l'effetto di composti e / o manipolazione genetica sulla capacità fagocitica di microglia (figure 3A, 3B). Può essere utilizzato anche in giovane (10 - 20 giorno dopo la nascita) o topi adulti (Figura 3C). Dosi variabili di lipopolisaccaride (LPS) sono stati somministrati per via intraperitoneale. 24 ore dopo la sfida LPS, il protocollo qui descritto è stato utilizzato per valutare la funzione della retina microglia fagocitica (Figura 3A). Una dose di 1,42 mg / kg di LPS induce un aumento statisticamente significativo nella percentuale di microglia fagocitaria rispetto al controllo del veicolo (figura 3B), come ci si aspetterebbe 26.
Figura 1: Impostazione iniezione intravitreale e Rappresentante sezione della retina che mostra particelle fluorescente in strati retinici. (A) Un pacchetto gel viene posizionato sotto il microscopio di dissezione. (B) un roditore è tenuto come mostrato per posizionare l'occhio per iniezione intravitreale. (C) Tre ore dopo iniezione di particelle fluorescente può essere visto strati durante la maggior parte della retina. (D , i topi e) CX3CR1 GFP / GFP e particelle etichettate con un fluoroforo rosso sono stati usati per visualizzare l'assorbimento di particelle da microglia. Microglia nel profondo (D) e gli strati superficiali (E) occupano particelle. Scala bar -. 20 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: strategia di gating per selezionare fagocitaria microglia (A) le singole cellule sospensioni dal tessuto retinico da un topo p10 vengono analizzati (B) Dopo aver escluso le cellule morte (PI +), cellule (C) CD11b + sono selezionati (D) Per... selezionare solo per microglia, CD11b + neutrofili (Ly6G +) e monociti (Ly6C +) sono esclusi. (e) microglia fagocitaria avrà preso le particelle fluorescente. (F) Il numero dei fagociti CD11b + è simile a quella della microglia (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, in pool da tre esperimenti indipendenti; le barre di errore rappresentano media ± SEM.rget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Microglia fagocitaria funzione può essere valutata dopo LPS Challenge e nei cuccioli e topi adulti (A) giovane topi (P10) si sono sfidati con LPS intraperitoneali a dosi diverse, 24 ore prima di valutare la fagocitosi (B) Sfida con 1,42 mg /. kg ha determinato un significativo aumento della percentuale di fagocitosi microglia retina rispetto ai comandi del veicolo (p = 0,0021). (C) Questo protocollo può essere utilizzato per misurare retina funzione fagocitica microglia in cuccioli e adulti topi simili. C'è una percentuale significativamente più piccola di microglia fagocitosi nei topi adulti rispetto ai giovani (p10) i topi (p = 0,019) non impugnato con LPS. n = 9 -12, in pool da tre a quattroesperimento indipendente; le barre di errore rappresentano media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono tre passaggi critici in questo metodo: (1) l'iniezione intravitreale di fluorescenza etichettati particelle; (2) la raccolta e preparazione del tessuto retinico; e (3) il flusso citometria. Si raccomanda che i ricercatori praticano iniezioni intravitreali prima di eseguire il metodo che presentiamo qui. Topi albini (ad esempio, BALB / c), e una soluzione colorata (ad esempio, particelle fluorescente) possono essere utilizzati per facilitare la visualizzazione dell'ago e soluzione iniettata. iniezioni intravitreali sono impegnative e se non eseguite correttamente porterà a risultati distorti e variabili. Problemi comuni associati con la tecnica dell'iniezione sono perforazione della lente e / o danni alla retina, che può provocare sanguinamento e infiammazione. Per minimizzare il rischio di traumi all'occhio, il roditore dovrebbe essere in una posizione stabile con minimo movimento della testa. Per penetrare il bulbo oculare, la siringa deve essere inserito lentamente e non spinto troppo per evitare di colpirela lente. Un'altra complicazione comune è riflusso del materiale iniettato fuori dall'occhio. Per evitare questo, il pistone deve essere premuto lentamente e, dopo l'iniezione, il bulbo oculare dovrebbe essere lasciata riavvolgere nella presa occhio e la siringa deve essere retratto lentamente. Le migliori iniezioni intravitreali attivano la microglia a livelli bassi, ma chiare differenze tra i gruppi non trattati e trattati possono essere misurati. E 'essenziale che i controlli appropriati (per esempio, topi non contestata) sono utilizzati in ogni esperimento per stabilire i livelli basali di fagocitosi. Un altro aspetto di questo metodo che richiede pratica è la dissezione retina. Per garantire preparati singola cella comparabili in tutta esemplari, tessuto retinico devono essere raccolti rapidamente e con il minimo disturbo possibile il tessuto. L'esecuzione delle ultime fasi della dissezione in PBS (vedi 3,4-3,7) faciliterà la raccolta. Infine, è importante preparare citometria correttamente il tessuto retinico per il flusso. microglia attivata upregulate Fcrecettori e pertanto il legame non specifico alla porzione Fc degli anticorpi possono verificarsi 7. Un blocco Fc deve essere eseguita per evitare colorazione aspecifica. Selezione dei fluorofori e la compensazione istituire adeguate è importante anche 27.
Noi abitualmente uso topi di età compresa tra 10 a 20 giorni dopo la nascita per questi esperimenti. Tuttavia, questo protocollo può anche essere utilizzato per valutare microglia fagocitaria in topi adulti (Figura 3C). Da segnalare, a causa della presenza del sistema vascolare hyaloid, popolazioni di cellule mieloidi esogene (Ly6C + o Ly6G +) sono più prominenti in topi giovani (circa il 40 - 50% di tutte le cellule CD11b +) che negli adulti (circa il 5% di tutte le CD11b + cellule). I ricercatori dovrebbero determinare l'età più appropriata per i loro esperimenti. Il protocollo presentato qui permette per il rilevamento affidabile dei livelli di microglia fagociti nella retina. Tuttavia, si consiglia di 3-4 biologicaAl replica i essere usato in ogni esperimento e vengono effettuate che almeno tre esperimenti indipendenti. Mentre le particelle utilizzate in questo protocollo sono stati convalidati per le analisi fagocitiche 21-23, se è necessaria un'ulteriore convalida, immunoistochimica co-localizzazione delle particelle con specifici marcatori fagociti potrebbe essere eseguita.
Una potenziale limitazione di questo metodo è l'accesso differenziale della microglia alle particelle. Nella retina normale, microglia risiedono in due strati, lo strato esterno plessiforme più profondo, e lo strato interno plessiforme più superficiale, che è più vicino al vitreo 7. Al momento la stimolazione, o durante l'invecchiamento, la microglia possono migrare in tutti gli strati della retina. In questo metodo, le particelle fluorescente sono iniettati nel vitreo. Tre ore dopo l'iniezione questo si traduce in accumulo di particelle durante la retina e in particolare lungo la superficie vitreale. I ricercatori possono ulteriormente ottimizzare i Concentratisu di particelle o tempo dopo l'iniezione per i loro esperimenti. E 'probabile che la microglia in stretta vicinanza con il vitreo avranno un più facile accesso alle particelle. Tuttavia, abbiamo dimostrato che le particelle diffuse in tutta la retina e sono presi da microglia attraverso tutti i livelli, ma non nelle cellule epitelio pigmentato retinico (RPE), probabilmente a causa di un accesso limitato tallone (Figura 1C-E). Dobbiamo ancora determinare se microglia sottoretinico (che può accumulare con l'età) potrebbe accedere alle particelle. Se questo è importante per il ricercatore, questo protocollo può essere eseguita dopo un'attenta iniezione sottoretinico delle particelle. Un'altra considerazione importante è che ci possono essere intrinsecamente diversi comportamenti tra microglia retina e microglia in altre regioni del CNS. E 'ben noto che le regioni specifiche del cervello hanno diverse suscettibilità alla malattia. Ad esempio, nel morbo di Parkinson, i neuroni nella substantia nigra sono più colpite, mentre in AlzLa malattia di Heimer, i neuroni dell'ippocampo sono per lo più interessati 28. Così, quando si studia la patologia di una malattia, una regione del cervello è probabile che sia un fattore importante. Un protocollo simile a quello qui descritto potrebbe essere eseguita dopo l'iniezione intracranica esplorare potenziali differenze nella risposta fagocitarie tra microglia retina e cervello. La retina ha molte caratteristiche in comune con le altre regioni del cervello, tra cui la presenza di un sangue-retina-barriera 20. Microglia Retina e microglia cervello provengono dagli stessi progenitori sacco vitellino e appaiono molto simili per quanto riguarda la morfologia e superficie cellulare marcatore espressione 7,29. Inoltre, molte malattie del cervello (per esempio, il morbo di Alzheimer, ictus e la sclerosi multipla) hanno manifestazioni oculari, che indica che la retina è influenzato anche 20. Mentre i ricercatori devono essere consapevoli dei potenziali differenze regionali, crediamo che questo è un modello informativo pertutte le ricerche microglia, e suggeriscono che tutti i neuroscienziati che studiano la fagocitosi microglia potrebbero utilizzare questo protocollo.
Un netto vantaggio per l'esecuzione di questo test nell'occhio è che le tecniche più sono state sviluppate per indurre diverse sollecitazioni neurogene nella retina, e le risposte allo stress possono essere monitorati in vivo e quantificato utilizzando protocolli standardizzati 30. Inducendo lo stress neurogena e poi esegue il test qui descritto, i ricercatori possono analizzare la funzione microglia in un ampio spettro di insulti che variano in gravità. Infine, quando combinato con citometria a flusso tecniche di ordinamento, questo protocollo ha il vantaggio rispetto immunoistochimica che possa consentire un'analisi approfondita della microglia fagociti (ad esempio, qPCR, coltura cellulare, proteomica).
La diffusione delle particelle è stato precedentemente utilizzato per misurare la funzione fagocitica, sia in vitro e in sistemi in vivo. il lAtter coinvolto iniezione intracranica delle particelle, la raccolta e il congelamento del tessuto cerebrale, criosezionamento, immunostaining, imaging e analisi post-immagini 18. Il protocollo presentato qui permette molto più veloce la quantificazione della funzione microglia fagocitaria della retina. Ha il vantaggio rispetto ai sistemi in vitro che le microglia altamente sensibili non vengono rimossi dal loro microambiente, permettendo per la valutazione della funzione fagocitaria in un contesto fisiologico. In particolare, si dovrebbe consentire la verifica di come i difetti di altri tipi di cellule (ad esempio, l'ablazione genetica di geni nei neuroni) influenzano la funzione fagocitaria microglia. Essa ha anche il vantaggio rispetto alle precedenti in vivo che utilizza citofluorimetria, consente il rilevamento rapido, quantitativo, e accurata di popolazioni di cellule fagocitiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 ml Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
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