Summary
doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.
Introduction
Bu yöntemin genel amacı doğru değerlendirmek ve in vivo mikroglial fagositozda ölçümüdür. Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) doku ikamet makrofajlar. Onlar doku homeostazında bakım sağlamak için çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek. Bunlar bağışıklık gözetim, nörotrofik faktörlerin salgılanmasına ve pivotal önemi, fagositoz 1 içerir. Mikrogliyal fagositoz gibi alakasız sinapsların (sinaptik budama) ve apoptotik nöronların 2-4 çıkarılması fagositozu olarak beyin ve retina, geliştirilmesi sırasında birçok önemli olaylar anahtarıdır. Bundan başka, hasar görmüş veya apoptotik nöronların hücresel döküntü ve istilacı mikrop mikroglial fagositoz erişkin 5 boyunca merkezi sinir sistemi homeostazın korunması için gerekli olduğu gösterilmiştir. Son olarak, mikrogliyal fagositoz Alzheimer hastalığı ve yaşa-bağlı dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde olmuşturkusurlu veya yetersiz fagositik kapasitesi amiloid-β (Aβ) plaklar ve druseni sırasıyla 6,7 birikmesi katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür maküler dejenerasyon.
Mikroglial fonksiyon sıkı ve özellikle de tümör büyümesi faktörü p ya da hücre-hücre etkileşimleri gibi çözülebilir faktörler tarafından, bunların mikro düzenlenir. mikroglia münhasıran kendi reseptörleri CD200R ve CX3CR1 ifade ederken Nöronlar yapısal, böyle CD200 ve CX3CL1 gibi çeşitli hücre yüzey ligandları, ifade eder. Bu reseptörler, hücre içi kısmı immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifi (ITIMs) içerir. Bu reseptörler, nöro katkıda bulunabilir mikroglia aşırı stimülasyon önlemek için önemli olan inhibitör. Bu nedenle, normal fizyolojik koşullar altında, nöronlar ve mikroglia arasındaki hücre-hücre etkileşimleri hareketsiz bir durumda mikroglia tutun. Doku hasarı sırasında, ancak, nöronlar exp aşağı düzenlerBu ligandların dışarı yansıması, Mikroglia aktivitesi üzerindeki engelleyici etkisinin ortadan kaldırır. (Fagositoz dahil) mikrogliyal fonksiyonu bu yüzden sıkı bir şekilde bunların mikro 8 ile bağlantılıdır. Bununla birlikte, bugüne kadar, fizyolojik bağlamında veya tam olarak merkezi sinir sistemi mikro-kopyalayacak şekilde mikroglia fagositoz çalışma standart bir tahliller vardır.
Çeşitli deneyler birincil mikroglia veya mikroglia hücre çizgileri, hedef hücreler (örneğin, apoptotik nöronların) ya da flüoresan etiketli boncuklar ile kültürlenir in vitro, in mikroglia fagositik aktivitesini ölçmek için geliştirilmiştir. Hedef alımı daha sonra floresan görüntüleme mikroskopi kullanılarak ya da sitometri 9-12 akış değerlendirilir. Bu testler, farmakolojik veya genetik manipülasyon bilgilendirici olurken, tam in vivo ortamda karmaşık çoğaltmak için başarısız, mikroglial fagositoz etkileyebilir ve nasıl test sağlar. mikrogliyal fagositozu incelemek için dolaylı yöntemlerin vivo bildirilmiştir: Bu mikroglia ve hedefleri, fagositoz için (örneğin tehlikeye nöronlar veya sinaptik elemanların) fiziksel yakınlığı değerlendirilmesi, fagositoz (örneğin, CD68) dahil olmak üzere düşünce moleküllerin boyanması ile gerçekleştirilebilir, ya da fagositik immünohistokimyasal tespiti ile olan mikroglial hücreleri içinde hedefler (örn, Aβ) 13-17. İki çalışma in vivo mikroglia fagositoz değerlendirmek için daha doğrudan yaklaşımlar kullanmışlardır. Hughes ve arkadaşları intrakranial rota 18 ile teslim boncuk mikroglial alımını ölçmek için görüntüleme teknikleri kullandık. Sierra ve ark. Kantitatif karmaşık görüntüleme teknikleri kullanarak 4 apoptotik hücrelerin mikroglia fagositoz değerlendirmek için zarif bir yöntem geliştirdi. Bununla birlikte, bu yöntemler, doku terkibi, kesit, görüntüleme ve analiz için karmaşık bir protokol içerir. Biz daha önce dışarı fotoreseptör fagositoz değerlendirmek için akım sitometri analizi kullandıkkültür 19 retina pigment epiteli (RPE) hücreleri tarafından er segmentleri. Burada, hızla in vivo mikroglia fagositoz bir nicel ölçüsü olarak retina mikroglia tarafından floresan etiketli parçacıkları alımını değerlendirmek için bir protokol açıklar.
floresan etiketli parçacıkların (1) intravitreal teslimat, (2) hasat ve retina dokusunun hazırlanması, ve (3) akış: Biz burada açıklamak protokol güvenilir ve kantitatif üç kritik adımda hemen altında altı saat retina mikroglial fagositoz ölçümü için izin verir sitometrik analizi. Geliştirdiğimiz yöntem retinada mikroglial fagositoz değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir ve başarıyla çeşitli bileşikler veya genetik manipülasyon fizyolojik ortamlarda bu anahtar mikroglial işlevi nasıl değiştirdiğini test etmek için kullanılır. MSS özel bir alanı olarak retina mikroglia fonksiyonu 20 incelemek için kolay ulaşılabilir bir model sistem. Bu yöntem, t geliştirilmesine rağmeno göz, biz mikroglia fagositik işlevini araştıran tüm nörologlar için yararlı olabilir inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün hayvanlar Scripps Araştırma Enstitüsü tarafından kurulan etik kurallarına uygun olarak tedavi edildi.
Enjeksiyon için Materyallerin hazırlanması 1.
- 33 G iğne ve şırınga sterilize: C ο 115 ° sökmeye ve otoklav steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde artan enjeksiyon için iğneler hazırlayın.
- 10 dakika - 5, oda sıcaklığında floresan işaretli parçacıkları çözülme. Ca + 2 / Mg2 + steril PBS içinde 50 mg / ml solüsyon için sulandırılması, enjeksiyon için partikül çözeltisi hazırlayın.
Not: fagositoz deneyleri için doğrulanmıştır mantar kökenli AF488 etiketli parçacıklar bu protokol 21-23 kullanılır. Optimal alımı için, taze ve enjeksiyondan hemen önce parçacıkları hazırlamak.
Not 2: Parçacık konsantrasyonları her özel deney için optimize edilebilir.
Boncuk Çözüm 2. Intravitreal
NOT: İki people bir şekilde, enjeksiyon gerçekleştirmek için gerekli olan şekilde diğer kişinin yüklü şırınga geçer ve pistonu iter ederken, fare tuşunu basılı tutun ve göz küresi üzerindeki odağı koruyabilirsiniz enjeksiyon gerçekleştiren kişi.
- 20 ul / vücut ağırlığı 10 g bir dozda 100 mg / ml ketamin ve 10 mg / ml ksilazin intraperitonal enjeksiyonu ile kemirgen anestezi uygulayın. Enjeksiyon öncesinde, anestezi düzeyini ölçmek için ayak tutam kullanın.
Not: İzofluran miyeloid hücre fonksiyonu üzerinde bir etkisi vardır, ve böylece bu tahlil içinde kullanımı 24,25 kaçınılmalıdır. - 0.5 ul floresan etiketli parçacık çözümü ile yük iğne.
- Yanlara cerrahi mikroskop (Şekil 1A-B) altında fare yerleştirin. Fare daha iyi konumlandırılması için yumuşak bir malzeme, örneğin, bir jel paketi kullanın. Gözleri henüz açık değil hangi genç fareler için, hafifçe bir fissu oluşturarak ince 45 o açılı forseps yardımı ile göz kapaklarını açmakhangi göz kapakları olacak sonunda açık yarık boyunca yeniden.
- Göz küresi soket biraz dışına çıkması için açılı o 45 ince forseps yardımı ile dikkatlice göz kapağı çevresinde basınç uygulayın. sadece kulak üstünde iki parmak ile ve çene ile kafa tutun ve yavaşça yuvanın dışına hafifçe göz tutmak için göz kapağına paralel olarak cildi germek. Boğaz (Şekil 1B) çok yakın kavramak için dikkatli olun.
- (Kornea ve sklera bağlamak nerede) kornea limbusta şırınga en iğneyi, gözü delinme. Bu pigmentli farelerde gri daire olarak görünür. vitreus sıvısı küçük bir hacim sınırdışı ve daha sonra enjekte hafifçe iğne geri çekin. nazikçe tek elle ve diğer iğne ile fare tutmak gerekir enjeksiyon gerçekleştiren kişi; İkinci kişi pistonu yavaşça zorlamalıyız.
- Yavaş yavaş şırınga geri çekin. Uygula göz nemlendirici hidrate göz tutmak için düşer. </ Li>
- kemirgen bir ısı yastığı üzerinde bir kafes içinde kurtarmak ve hayvan izlemeye devam edelim. yavrular ile çalışan varsa, nefes ve spontan hareket edebilen kadar diğer uyarı hayvanlarla bir kafesine hayvan dönmez. yetişkinlerle çalışan Eğer sternum recumbence kavuşur kadar, diğer uyarı hayvanlarla bir kafes kemirgen dönmez.
Retina Doku 3. Hasat
Not: floresan etiketli partikülleri enjekte edilmemiş gözlerden retinal doku akış sitometrik analiz için bir kontrol olarak toplanmalıdır. Deney, tek bir retina kullanılarak gerçekleştirilebilir olsa da, en iyi performans için, iki retinalar bir araya toplanmış olmalıdır.
- floresan etiketli parçacıkların enjeksiyonundan sonra retinal doku 3 saat toplayın.
NOT: parçacık solüsyonu enjekte edildikten sonra zaman belirli her deney için optimize edilebilir olsa da, biz 3 saat enjeksiyonundan sonra, parçacık alımı o en katmanları boyunca görülebilir bulunduretina (Şekil 1C-D) f. - servikal dislokasyon ile fareler kurban.
- Nazikçe gözü proptose ince 45 o açılı forseps yardımı ile göz kapağı karşı basarak gözbebekleri toplayın. göz küresi ve çekme arkasında forseps yerleştirin.
- Diseksiyon mikroskobu altında retina parçalara ayır. Ca + 2 / Mg2 + PBS küçük bir miktar ihtiva eden bir Petri kabı gözün aktarın. Petri kabı kuru bir alanda, ince forseps ucu ile kornea limbusta gözün perfore.
- Korneal limbus çevresi kabaca yarısı kesilir kadar ince 45 o açılı forseps yardımı ile gözün tutun ve kornea limbus etrafında kesmek için yaylı makas kullanın.
- İnce 45 o açılı forseps ile göz küresinin tutun ve PBS içine gözün getirin. İnce 45 o açılı forseps ikinci bir çift ile ayrı kornea ve sklera gözyaşı. Lens ve retina çıkıp ben olacakntact.
- lens ve retina ayırın. Retina toplamak ve Ca + 2 / Mg2 + ile 2 ml PBS ihtiva eden bir 5.4 ml polistiren test tüpüne aktarılır.
4. Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması
- üreticinin talimatlarına küçük değişikliklerle nöronal doku ayrılma kiti kullanılarak tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması. Kısaca, yukarı pipetleme ve P1000 pipet ile aşağı ve sallayarak olmadan 37 o C'de enzimatik sindirimi gerçekleştirerek çiğnemek retina.
Akım sitometri analizi için 5. Boyama Tek Hücre süspansiyonlar
- lekeleme tampon maddesi 200 ul hücreleri tekrar U-tabanlı 96-çukurlu plaka ve transfer (% 0.2 inek serumu albümini (BSA) ve% 0.09 sodyum azid ile Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu su). 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
NOT: Sodyum azid insanlar ve çevre için zararlıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman a kullanınnd yerel yönetmeliklere uygun olarak atık atmak. - süpernatant atmak için bir lavabonun üzerinde plaka ters çevirin. 5 ug / anti-fare CD16 / CD32 antikorunun ml göz başına ihtiva eden boya tamponu 25 ul Fc reseptörleri, tekrar süspansiyon hücreleri engellemek için. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- anti-fare Ly6C APC-Cy7 0.5 ug / ml anti-fare Ly6G-Pe-Cy7 0.5 ug / ml ve anti-fare CD11 b-AF650 2.5 ug / ml ihtiva eden lekeleme tampon maddesi 25 ul ekle. karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. süpernatantı atmak için plaka ters çevirin. lekeleme tampon maddesi 200 ul içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla yıkayın.
- 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Propidium iyodür (PI), 0.5 ug / ml ihtiva eden boya tamponu 200 ul süspanse edin. 1.2 ml mikrotiter tüplere aktarın.
- önceki 200 ul PI ve havuz 0.5 ug / ml ihtiva eden boyama tamponu ek bir 100 ul ile kuyu yıkayın1.2 mi mikrotiter borular. boyalı hücrelerin 300 ul toplam hacim elde edilir.
6. Akım Sitometrisi Analizi
- geleneksel üç lazer (mor, mavi ve kırmızı lazer) kullanılarak, PE, PerCP-Cy5.5, BV510 ve son derece parlak floresan AF488-parçacıklar önemli yayılma nedeniyle PI boyaları kaçının. Bu (yerine PerCP Cy5.5 kanalının MCherry kanal) bir PE-etiketli antikorlar ve PI sağlar (Şekil 2) kullanılmak üzere, bu testte iyi duruma getirmek için, dördüncü (sarı) lazer kullanır.
NOT: Sarı lazer mevcut değilse, başka bir kanalda ölü hücre dışlama boya kullanın. - PI negatif hücreler (PI) üzerinde Kapısı ölü hücreleri (Şekil 2B) dışlamak için.
- Ölü hücreleri, CD11b pozitif hücrelerin (CD11 +) üzerine kapak hariç sonra, bütün miyeloid hücrelerin (Şekil 2C) içerir.
- LY6C üzerinde CD11b + nüfusu, kapının içinde - / Ly6G - dışlamak içinNötrofiller (CD11b + / Ly6G +) ve monositler (CD11 b + / Ly6C +, Şekil 2D). Mikroglia (- / Ly6G - burada CD11b + / Ly6C olarak tanımlanan basitlik için) üzerinde yolluk sonra, iki net popülasyonları görünür olmalıdır; bir negatif ve floresan etiketli parçacıklar için olumlu. Fagositik hücreler parçacıkları almış ve AF488 + (Şekil 2E) bu nedenle.
NOT: Ly6C pozitif veya Ly6G pozitif popülasyonlar da bu boyama yaklaşımı kullanarak parçacık alımını ölçmek için analiz edilebilir. Fagositik CD11b + hücrelerin yüzdesi fagositik mikroglia yüzdesi (Şekil 2F) ile iyice ilişkilidir. Bu fagositik nötrofiller ve monositler gibi mikroglia içerecektir olsa akış sitometri deneyimi olmayan araştırmacılara için tek başına CD11b boyama ile daha basit bir analiz gerçekleştirilebilir. / Ly6G - - Bu CD11b + / Ly6C içinde </ Sup> nüfus, belirteçler F4 / 80 ve CX3CR1 ile boyanarak tarafından değerlendirilecek bu hücreler>% 99 mikroglia vardır; Bu belirteçler eklendi ama bizim elimizde gerekli değildir olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, hızlı ve güvenilir bir şekilde akış sitometrik analizi (Şekil 2) ile, bir fizyolojik ortamda fagositik retina mikroglia sayısını ölçmek için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem fagositik kapasitesi bileşiklerin ve / veya genetik manipülasyon etkisini test etmek için uyarlanabilir mikroglia (Şekil 3A, 3B). (- 20 gün postnatal 10) veya yetişkin farelerde (Şekil 3C) Bu genç kullanılabilir. Lipopolisakarit değişen dozlarda (LPS) intraperitoneal olarak uygulanmıştır. 24 saat, LPS meydan okumasından sonra Burada açıklanan protokol retina mikroglia fagositik işlevi (Şekil 3A) değerlendirmek için kullanıldı. 26, beklendiği gibi, araç kontrolü (Şekil 3B) ile karşılaştırıldığında 1.42 mg'lık bir doz / LPS'nin kg fagositik mikroglia yüzdesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışı indüklemiştir.
Retina Katmanlar floresan etiketli Parçacıklar gösteren Intravitreal Kurulum ve Temsilci Retina Bölüm: Şekil 1. (A) jel paketi diseksiyon mikroskobu altında konumlandırılmış. (B) intravitreal enjeksiyon için göz konumlandırmak için gösterildiği gibi kemirgen tutulur. (C) Üç saat enjeksiyon floresan etiketli partiküller boyunca en retina katmanları görülebilir sonra. (D E) CX3CR1 GFP / GFP uygulanan farelerden ve kırmızı bir florofor ile işaretlenmiş parçacıklar mikroglia tarafından partikül alımını görselleştirmek için kullanılmıştır. Derin (D) mikroglia ve yüzeysel (E) katmanlar parçacıkları sürebilir. Ölçek çubuklar -. 20 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Yolluk Strateji fagositik mikroglia Seç (A) p10 fare retina dokusundan Tek hücreler süspansiyonlar analiz edilir (B) ölü hücreleri (PI +) ekarte edildikten sonra, (C) CD11b + hücreler seçilir (D) için... sadece mikroglia seçmek, CD11b + nötrofiller (Ly6G +) ve monositler (Ly6C +) hariçtir. (E) fagositik mikroglia kadar floresan etiketli parçacıkları almış olacaktır. (F) fagositik CD11b + hücrelerinin sayısı mikroglia benzerdir (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, üç bağımsız deneyden elde edilen; Hata çubukları ortalama ± SEM temsil etmektedir.rYer = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Mikroglia Fagositik Fonksiyon LPS Etkinlikten sonra ve Pups ve Yetişkin farelerde Değerlendirilen (A) Genç fareler (p10) 24 saat fagositoz değerlendirirken önce, değişen dozlarda intraperitoneal LPS ile tehdit edildi (B) Mücadelesi 1.42 mg /. araç kontrol (p = 0.0021) kıyasla kg fagositik retina mikroglia belirgin bir şekilde artan yüzde sonuçlandı. (C) Bu protokol, hem yavru ve yetişkin farelerde retina mikroglial fagositik fonksiyonu ölçmek için kullanılabilir. LPS ile meydan değil genç (p10) farelerde (p = 0.019) ile karşılaştırıldığında, yetişkin farelerde fagositik mikroglia bir daha küçük bir yüzdesi vardır. n = üç ya da dört ila toplanmış 9 -12,bağımsız deney; Hata çubukları ortalama ± SEM temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemde, üç önemli basamak vardır: floresan etiketli partiküllerin (1) içi enjeksiyon; (2) Ürünün alınması ve retina dokusunun hazırlanması; ve (3) flow sitometri yöntemi. Biz araştırmacıların burada mevcut yöntemin gerçekleştirmeden önce intravitreal enjeksiyonlar deneme yapmanızı öneririz. Albino farelerde (ör Balb / c) ve bir renkli çözelti (örneğin, floresan etiketli parçacıklar) iğne kolayca görselleştirme ve enjekte edilen bir çözüm kullanılabilir. Intravitreal enjeksiyonlar zorlu ve gerçekleştirilmemesi durumunda doğru önyargılı ve değişken sonuçlara yol açacaktır. zayıf enjeksiyon tekniği ile ilgili ortak sorunlar kanama ve iltihap neden olabilir retinaya lens ve / veya hasarı perforasyon vardır. göze verilen bir travmanın riskini en aza indirmek için, kemirgen az baş hareketi ile sabit pozisyonda olmalıdır. göz küresi nüfuz etmek için, şırınga yavaş ve eklenen vurma önlemek için çok itilmiş olmalıdırlens. Başka bir ortak komplikasyon göz dışına enjekte malzemenin reflü olduğunu. Bunu önlemek için, piston enjeksiyonundan sonra, gözün göz çukuru içine geri izin verilmelidir ve şırınga yavaş geri çekilmelidir yavaş depresif edilmelidir. En iyi intravitreal enjeksiyonlar düşük seviyelerde mikroglia etkinleştirmek ama işlenmemiş ve işlenmiş gruplar arasında belirgin farklılıklar ölçülebilir. Uygun kontrol (örnek olarak, meydan fareler) taban fagositik düzeylerini oluşturmak için her bir deneyde kullanılan esastır. pratik gerektirir, bu yöntemin bir başka yönü retina diseksiyon olduğunu. Örneklerin arasında karşılaştırılabilir tek hücre hazırlıklarını sağlamak için, retina dokusu hızla ve mümkün olan en kısa doku bozulma ile toplanması gerekir. toplama kolaylaştıracak - PBS diseksiyon son adımları uygulayarak (3.7 3.4 bakınız). Son olarak, sitometrisi doğru akışı için retina dokusunun hazırlanması için çok önemlidir. Aktive mikroglia Fc upreguleantikorların Fc kısmına bağlanması reseptörler ve böylece spesifik olmayan 7 oluşabilir. Bir Fc Block spesifik olmayan boyama önlenmesi için gerçekleştirilmelidir. Uygun fluorophores ve kurmak tazminat seçimi de 27 önemlidir.
Rutin Bu deneyler için 10 ila 20 gün sonrası yaşlı fareler kullanır. Bununla birlikte, bu protokol, yetişkin fareler (Şekil 3C) mikrogliyal fagositik fonksiyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir. Tüm yaklaşık% 5'i erişkinlerde (daha - (bütün CD11b + hücrelerinin% 50 yaklaşık 40) nedeniyle hialoid damarların varlığı not, bir eksojen miyeloid hücrelerin (Ly6C + veya Ly6G +) nüfusu genç farelerde daha belirgindir CD11b + hücreleri) içerir. Araştırmacılar deneyler için en uygun yaş belirlemelidir. Burada sunulan protokol retinada fagositik mikroglia düzeylerinin sağlam tespiti için izin verir. Ancak, biz üç dört biyolojik tavsiyediğerleri, her bir deney kullanılabilir çoğaltır ve bu en az üç bağımsız deney gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan parçacıklar fagositik deneyleri 21-23 için valide edilmiş olsa da ek doğrulama gerekiyorsa, belirli fagositik işaretleri ile parçacıkların immünohistokimyasal co-lokalizasyon yapılabildi.
Bu yöntemin bir potansiyel sınırlama parçacıklarına mikroglia diferansiyel erişim. Normal retina, mikroglia iki kat daha derin dış pleksiform tabakası ve vitreus 7 yakın daha yüzeysel iç pleksiform tabakasında, yaşamaktadır. stimülasyon üzerine veya yaşlanma sırasında, mikroglia tüm retina katmanları boyunca taşıyabilirsiniz. Bu yöntemde, floresan etiketli parçacıklar vitröz içine enjekte edilir. Üç saat enjeksiyondan sonra retina boyunca ve özellikle de vitreal yüzeyi boyunca parçacık birikimi ile sonuçlanır. Araştırmacılar daha konsantrasyon derecesinden optimize edebilironların deneyler için enjeksiyondan sonra parçacıkları veya zaman üzerinde. Vitreus yakın yakınlık mikroglia parçacıkların daha kolay erişime sahip olasıdır. Yine de, biz parçacıklar retina yayılmış ve muhtemelen sınırlı boncuk erişimi (Şekil 1C-E), tüm katmanları arasında değil retina pigment epiteli (RPE) hücrelerinde mikroglia tarafından alınır göstermektedir. Biz (yaşla birlikte birikebilir) subretinal mikroglia parçacıkların erişmek olup olmayacağını belirlemek için henüz. Bu araştırmacı için önemli ise, bu protokol parçacıkların dikkatli subretinal enjeksiyondan sonra yapılabildi. Bir diğer önemli husus MSS diğer bölgelerde retina mikroglia ve mikroglia arasında doğası gereği farklı davranışlar olabilir olmasıdır. İyi spesifik beyin bölgelerinde hastalığın farklı olan yatkınlığı bilinmektedir. Örneğin, Parkinson hastalığı, substantia nigra nöronların çok Alz ise, etkilenirHeimer hastalığı, hipokampal nöronlar çoğunlukla 28 etkilenir. Belirli bir hastalığın patolojisini okuyan Böylece, beyin bölgesi önemli bir faktör olması muhtemeldir. Burada anlatılan birine benzer bir protokol retina ve beyin mikroglia arasındaki fagositik yanıt potansiyel farklılıkları keşfetmek için intrakranial enjeksiyondan sonra yapılabildi. Retina kan-retina-bariyeri 20 varlığı da dahil olmak üzere beynin diğer bölgeleri ile birçok ortak özelliğe sahiptir. Retina mikroglia ve beyin mikroglia aynı yolk-sac atalarıdır kaynaklanan ve morfolojisi ve hücre-yüzey işaretleyici ifade 7,29 açısından çok benzer görünür. Ayrıca, birçok beyin hastalıkları (örneğin, Alzheimer hastalığı, inme, çoklu skleroz), retina da 20 etkilenen gösteren, oküler ifadeleri de mevcuttur. Araştırmacılar potansiyel bölgesel farklılıkların farkında olmalıdır olsa da, biz bunun için bir bilgilendirme modeli olduğuna inanıyorumTüm mikroglia araştırma ve mikroglial fagositozu okuyan tüm Nörobilimadamları bu protokolü kullanan olabileceğini düşündürmektedir.
Göz, bu işlemin tayinin gerçekleştirilmesi için ideal bir avantajı, çok sayıda teknik retinada çeşitli nörojenik gerilmeleri uyarılması için geliştirilmiş ve stres tepkileri standart protokoller 30 kullanarak in vivo izlenmesi ve sayısal edilebilmesidir. Burada anlatılan tahlil nörojenik gerilime neden ve sonra gerçekleştirerek, araştırmacılar şiddeti değişir hakaret geniş bir yelpazede mikroglia fonksiyonunu analiz edebilirsiniz. Ayırma teknikleri akış sitometrisi ile birlikte, son olarak, bu protokol bu fagositik mikroglia (ör qPCR, hücre kültürü, proteomik) derinliği analiz için izin verebilir immünohistokimya üzerinde bir avantaja sahiptir.
Parçacıkların Alım önce fagositik işlevi, hem de in vitro ve in vivo sistemlerde ölçmek için kullanılmıştır. latter parçacıkları, hasat ve beyin dokusu, cryosectioning, immün, görüntüleme ve post-görüntüleme analizi 18 donma intrakranial enjeksiyon çıkıyor. Burada sunulan protokol retina mikroglia fagositik fonksiyonu çok daha hızlı ölçümü için izin verir. Bu son derece hassas mikroglia fizyolojik bağlamda fagositik fonksiyonunun değerlendirilmesi için izin kendi mikroçevresinin kaldırılmaz in vitro sistemlere göre avantajı vardır. Özellikle, başka hücre tiplerinde bozukluklar (örneğin, nöronlarda genlerinin genetik ablasyonu) mikroglia fagositik işlevi nasıl etkilediğini test sağlamalıdır. Ayrıca bu fagositik hücre popülasyonlarının hızlı nicel ve doğru tespiti için izin akış sitometrisi kullanarak in vivo deneyler önceki üzerinde bir avantaja sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 ml Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
