Summary
Mikroglial fagocytose er kritisk for opretholdelse af vævshomeostase og utilstrækkelig fagocyterende funktion er blevet impliceret i patologien. Men vurderer mikroglia funktion in vivo er teknisk udfordrende. Vi har udviklet en enkel men robust teknik til præcis overvågning og kvantificering af fagocytiske potentiale mikroglia i et fysiologisk miljø.
Introduction
Det overordnede mål med denne metode er at præcist at vurdere og kvantificere in vivo mikroglial fagocytose. Mikroglia er de væv stationære makrofager i centralnervesystemet (CNS). De udfører en række funktioner til at sikre opretholdelse af vævshomeostase. Disse omfatter immun overvågning, sekretion af neurotrofiske faktorer og af afgørende betydning, fagocytose 1. Mikroglial fagocytose er nøglen i flere vigtige begivenheder under udviklingen af hjernen og nethinden, såsom fagocytose af irrelevante synapser (synaptisk beskæring) og fjernelse af apoptotiske neuroner 2-4. Endvidere mikroglial fagocytose af beskadigede eller apoptotiske neuroner, cellerester og invaderende mikrober er blevet vist, at være afgørende for at opretholde CNS homeostase gennem voksenalderen 5. Endelig har mikroglial fagocytose blevet impliceret i patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom og aldersrelateretmakuladegeneration, hvor det er blevet foreslået, at defekt eller utilstrækkelig fagocytisk kapacitet kan bidrage til opbygning af amyloid-p (Ap) plaques og drusen henholdsvis 6,7.
Mikroglial funktion er stramt reguleret af deres mikromiljø, navnlig ved opløselige faktorer, såsom tumor-vækstfaktor β eller celle-celle-interaktioner. Neuroner konstitutivt udtrykker flere celleoverfladeligander, såsom CD200 og CX3CL1, mens mikroglia udelukkende udtryk de respektive receptorer CD200R og CX3CR1. Disse receptorer indeholder immunoreceptorfusionsmolekyler tyrosin-baserede hæmning motiver (ITIM'er) i deres intracellulære del. Disse inhibitor receptorer er kritisk for at forhindre over-stimulation af mikroglia, som kan bidrage til neuroinflammation. Således under normale fysiologiske betingelser, celle-celle interaktioner mellem neuroner og mikroglia holde mikroglia i en hvilende tilstand. Under vævsskade imidlertid neuroner kan nedregulere expression af disse ligander, fjerne deres inhiberende virkning på mikroglia aktivering. Microgliale funktion (herunder fagocytose) er således tæt knyttet til deres mikromiljø 8. Alligevel til dato, er der ingen standardiserede assays til at studere mikroglia fagocytose i en fysiologisk kontekst eller på en måde, der fuldt ud replikerer deres CNS mikromiljø.
Adskillige assays er blevet udviklet til at måle fagocytisk aktivitet af mikroglia in vitro, hvor primære mikroglia eller microglia cellelinier dyrkes med målceller (f.eks apoptotiske neuroner) eller fluorescensmærkede perler. Target optagelse derefter vurderes ved hjælp af fluorescerende billeddannelse mikroskopi eller flowcytometri 9-12. Disse assays tillader afprøvning af hvordan farmakologisk eller genetisk manipulation kan påvirke mikroglial fagocytose og mens informative, ikke fuldt ud replikere komplekset in vivo miljø. Indirekte metoder til at undersøge mikroglial fagocytosein vivo er blevet rapporteret: disse er opnået ved farvning af molekyler menes at være involveret i fagocytose (fx CD68), vurdere fysisk nærhed af mikroglia og mål for fagocytose (f.eks kompromitteret neuroner eller synaptiske elementer), eller ved immunhistokemisk påvisning af fagocyterende mål inden mikrogliaceller (f.eks Ap) 13-17. To studier har brugt mere direkte metoder til at vurdere mikroglia fagocytose in vivo. Hughes og kolleger har brugt billeddannelsesteknikker til at måle mikroglial optagelse af perler leveret via det intrakranielle rute 18. Sierra et al. Udviklet en raffineret metode til kvantitative vurderinger mikroglia fagocytose af apoptotiske celler under anvendelse af komplekse billeddannelsesteknikker 4. Men disse metoder involverer komplicerede protokoller for vævspræparat, sektionering, billedbehandling og analyse. Vi har tidligere anvendt flowcytometrisk analyse for at vurdere fagocytose af fotoreceptor udER segmenter af retinale pigmenterede epithelium (RPE) celler i kultur 19. Her beskriver vi en protokol til hurtigt at vurdere optagelsen af fluorescens-mærkede partikler ved retinale mikroglia som et kvantitativt mål for in vivo microglia fagocytose.
Protokollen vi beskriver her tillader pålidelig og kvantitativ måling af retinal mikroglial fagocytose i knap seks timer i tre kritiske trin: (1) intravitrealt levering af fluorescensmærkede partikler, (2) høst og klargøring af retinavæv, og (3) flow cytometrisk analyse. Den metode, vi har udviklet er en robust metode til vurdering mikroglial fagocytose i nethinden, og det med held kan anvendes til at teste, hvor forskellige forbindelser eller genetisk manipulation ændre denne nøgle mikroglial funktion i fysiologiske indstillinger. Som et specialiseret område i CNS, nethinden er en let tilgængelig modelsystem til at studere mikroglia funktion 20. Selv om denne fremgangsmåde blev udviklet i than øje, mener vi, det kan være nyttigt for alle neuroforskere efterforsker microglia fagocytotisk funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med de etiske retningslinjer fastsat af Scripps Research Institute.
1. Forberedelse af materialer til injektion
- Sterilisere en 33 G kanyle og sprøjte: demontere og autoklave ved 115 ο C. Forbered nåle til injektion af stigende i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS).
- Tø fluorescensmærkede partikler ved stuetemperatur i 5 - 10 min. Forbered partikel opløsning til injektion ved rekonstitution til en 50 mg / ml opløsning i sterilt PBS med Ca2 + / Mg2 +.
BEMÆRK: AF488-mærkede partikler af svampe oprindelse, der er blevet valideret for fagocytose analyser anvendes i denne protokol 21-23. For optimal optagelse, forbereder partikler frisk og umiddelbart før injektion.
Note 2: Partikelfiltre koncentrationer kan optimeres for hver enkelt eksperiment.
2. Intravitrealt Injektion af Bead Solution
BEMÆRK: To people skal udføre injektionen, på en sådan måde, at den person, der udfører injektionen kan holde musen og fastholde fokus på øjeæblet, mens den anden person passerer loaded sprøjte og skubber stemplet.
- Bedøve gnaver ved intraperitoneal injektion af 100 mg / ml ketamin og 10 mg / ml xylazin i en dosis på 20 gl / 10 g legemsvægt. Før injektion, bruge tå knivspids til at vurdere niveauet af anæstesi.
BEMÆRK: Isofluran har en dybtgående indvirkning på myeloid celle funktion, derfor bør undgås anvendt i hele denne analyse 24,25. - Load nål med 0,5 pi fluorescensmærket partikel opløsning.
- Lægge musen sidelæns under et kirurgisk mikroskop (Figur 1A-B). Brug et blødt materiale, fx en gel pack, for bedre positionering af musen. For unge mus, hvor øjnene er endnu ikke åben, forsigtigt åbne øjenlåg med hjælp af fine 45 o vinklet pincet ved at oprette en fissure langs slidsen, hvorfra øjenlågene i sidste ende vil åbne.
- Med hjælp af fine 45 o vinklet pincet anvendes omhyggeligt tryk omkring øjenlåget, således at øjeæblet popper lidt ud af stikkontakten. Hold hovedet med to fingre lige over øret og ved sin kæbe og forsigtigt strække huden parallelt med øjenlågene til at holde øje lidt ud af stikkontakten. Pas på ikke at fatte for tæt på halsen (figur 1B).
- At punktere øjeæblet, indsætte sprøjtens nål i hornhindelimbus (hvor hornhinden og sclera forbinde). Dette ses som en grå cirkel i pigmenterede mus. Træk nålen lidt for at udvise en lille mængde glasagtige væske og derefter injicere. Den person, der udfører injektionen bør hold forsigtigt mus med den ene hånd og nålen med den anden; den anden person bør langsomt skubbe stemplet.
- Trække sprøjten langsomt. Påfør øjet fugtgivende dråber til at holde øje hydreret. </ Li>
- Lad gnaver komme sig i et bur over et varmepude og fortsat overvåge dyret. Hvis du arbejder med hvalpe, behøver dyret ikke vende tilbage til et bur med andre alarm dyr, indtil det er vejrtrækning og i stand til spontan bevægelse. Hvis du arbejder med voksne, ikke returnere gnaver til et bur med andre alarm dyr, indtil det genvinder brystbenslymfeknuderne recumbence.
3. Høst af retinal Tissue
BEMÆRK: Retinal væv fra øjne ikke injiceret med fluorescensmærkede partikler skal indsamles som en kontrol for flowcytometrisk analyse. Selvom analysen kan udføres ved hjælp af en enkelt nethinden, for den bedste ydeevne, to nethinder skal lægges sammen.
- Saml retinavæv 3 timer efter intravitreal injektion af fluorescensmærkede partikler.
BEMÆRK: Mens tid efter injektion af partiklen opløsning kan optimeres for hver specifik eksperiment, fandt vi, at 3 timer efter injektion, kan partikel optagelse ses på hele fleste lag of nethinden (figur 1C-D). - Sacrifice mus ved cervikal dislokation.
- Saml de øjne ved at trykke forsigtigt mod øjenlåget med hjælp af fine 45 o vinklede pincet til proptose øjeæblet. Placer pincet bag øjeæblet og pull.
- Dissekere nethinden under et dissektionsmikroskop. Overfør øjeæblet til en petriskål indeholdende en lille mængde PBS med Ca2 + / Mg2 +. I et tørt område af petriskålen, perforere øjeæblet i hornhindelimbus med spidsen af superfine pincet.
- Hold øjeæblet ved hjælp af fine 45 o vinklet pincet og bruge kilde saks til at klippe omkring hornhindelimbus, indtil omtrent halvdelen af den hornhindelimbus omkredsen skæres.
- Hold øjeæblet med de fine 45 o vinklet pincet og bringe øjeæblet ind PBS. Med et andet par fine 45 o vinklet pincet rive hornhinden og sclera hinanden. Objektivet og nethinden vil komme ud intact.
- Adskil linse og retina. Saml nethinden og overføres til en 5,4 ml polystyren reagensglas indeholdende 2 ml PBS med Ca2 + / Mg2 +.
4. Forberedelse af en enkelt celle Suspension
- Forbered enkeltcellesuspensioner bruger neuronalt væv dissociation kit med mindre ændringer af producentens anvisninger. Kort fortalt, Mal nethinder ved pipettering op og ned med en P1000 pipette og udføre en enzymatisk fordøjelse ved 37 ° C uden omrystning.
5. Farvning enkeltcellesuspensioner til flowcytometrisk analyse
- Resuspender celler i 200 pi farvning buffer (Dulbeccos phosphatbufret saltvand med 0,2% bovint serumalbumin (BSA) og 0,09% natriumazid) og overføres til en U-bund 96 brønd plade. Centrifuger i 5 minutter ved 130 x g.
BEMÆRK: Natriumazid er skadeligt for mennesker og miljø. Brug egnede personlige værnemidler etnd kassere affald i overensstemmelse med lokale regler. - Vend pladen over en vask for at kassere supernatanten. At blokere Fc-receptorer, resuspender cellerne i 25 pi pletten puffer indeholdende 5 ug / ml anti-mus CD16 / CD32-antistof per brønd. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 25 pi farvning puffer indeholdende 0,5 ug / ml af anti-muse Ly6C-APC-Cy7, 0,5 ug / ml af anti-muse Ly6G-Pe-Cy7 og 2,5 ug / ml af anti-muse CD11-AF650. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Centrifuger i 5 minutter ved 130 x g. Vend pladen til at skille supernatant. Vask ved at resuspendere celler i 200 pi farvning puffer.
- Centrifuger i 5 minutter ved 130 x g. Resuspender i 200 pi pletten puffer indeholdende 0,5 ug / ml propidiumiodid (PI). Overførsel til 1,2 ml mikrotiterrør.
- Vask brøndene med yderligere 100 pi farvning puffer indeholdende 0,5 ug / ml PI og pool med de tidligere 200 pi i1,2 ml mikrotiterrør. En samlet volumen på 300 pi farvede celler er opnået.
6. flowcytometrisk analyse
- Ved hjælp af en konventionel tre laser (violet, blå og rød laser), undgå PE, PerCP-Cy5.5, BV510, og PI-farvestoffer grundet betydelig afsmitning fra de ekstremt lyse fluorescerende AF488-partikler. Brug en fjerde (gul) laser til at optimere dette assay, da det giver mulighed for et PE-mærkede antistoffer og PI (i mCherry kanal i stedet for PerCP-Cy5.5 kanal), der skal anvendes (figur 2).
BEMÆRK: Hvis en gul laser ikke er tilgængelig, kan du bruge en død celle udelukkelse farvestof i en anden kanal. - Gate på PI negative celler (PI-) at udelukke døde celler (figur 2B).
- Efter at have udelukket døde celler, gate på CD11b positive celler (CD11 +), vil dette omfatte alle myeloide celler (Figur 2C).
- Inden for CD11b + populationen, gate på Ly6C - / Ly6G - at udelukkeneutrofiler (CD11b + / Ly6G +) og monocytter (CD11b + / Ly6C +; figur 2D). Efter gating på mikroglia (her defineret som CD11b + / Ly6C - / Ly6G - for enkelhed), bør to klare befolkninger være synlige; én negativ og én positiv for de fluorescerende mærkede partikler. Fagocytiske celler vil have taget op partikler og er derfor AF488 + (Figur 2E).
BEMÆRK: Ly6C positiv eller Ly6G positive populationer kan også analyseres for at måle partikel optagelse ved hjælp af denne farvning tilgang. Procentdelen af fagocytiske CD11b + -celler korrelerer godt med den procentdel fagocytisk mikroglia (figur 2F). Forskere uden flowcytometri erfaring, kan udføres en enklere analyse med CD11-farvning alene, omend dette vil omfatte fagocytiske neutrofiler og monocytter samt mikroglia. Inden for denne CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> population er disse celler> 99% mikroglia som bedømt ved farvning med markørerne F4 / 80 og CX3CR1; disse markører kan tilføjes, men er ikke nødvendige i vores hænder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en metode til hurtigt og pålideligt kvantificere antallet af fagocytiske retinale mikroglia i en fysiologisk indstilling ved hjælp af flow cytometrisk analyse (figur 2). Denne metode kan tilpasses til at teste virkningen af forbindelser og / eller genetisk manipulation på den fagocytiske kapacitet af mikroglia (figur 3A, 3B). Den kan også anvendes i unge (10 - 20 dage postnatal) eller voksne mus (figur 3C). Varierende doser af lipopolysaccharid (LPS) blev indgivet intraperitonealt. 24 timer efter LPS-provokationen blev protokollen beskrevet her anvendes til at vurdere retinal mikroglia fagocyterende funktion (figur 3A). En dosis på 1,42 mg / kg LPS inducerede en statistisk signifikant stigning i procentdelen af fagocytiske mikroglia sammenlignet med vehikelkontrol (figur 3B), som ville forventes 26.
Figur 1: intravitreal injektion Setup og repræsentant Retinal Afsnit viser fluorescens-mærkede Partikler i retinale Lag. (A) En gel pack placeres under dissektion mikroskop. (B) en gnaver holdes som vist for at positionere øjet til intravitreal injektion. (C) Tre timer efter injektion fluorescensmærkede partikler kan ses i det meste retinale lag. (D , E) CX3CR1 GFP / GFP mus og partikler mærket med en rød fluorofor blev anvendt til at visualisere partikel optagelse af mikroglia. Mikroglia i dybere (D) og overfladiske (E) lag optager partikler. Scale barer -. 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: gating-strategi til Vælg fagocytisk Mikroglia (A) enkeltceller suspensioner fra retinal væv fra en p10 mus analyseres (B) Efter at udelukke døde celler (PI +), (C) CD11b + celler er valgt (D) Til... vælge kun for mikroglia, CD11b + neutrofiler (Ly6G +) og monocytter (Ly6C +) er udelukket. (E) Fagocytisk mikroglia vil have taget op fluorescerende mærkede partikler. (F) antallet af fagocytiske CD11b + -celler ligner den af mikroglia (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, samlet fra tre uafhængige forsøg; fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SEM.rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Mikroglia fagocytotisk funktion kan vurderes efter LPS Challenge og i Hvalpe og voksne mus (A) Unge mus (p10) blev udfordret med intraperitoneale LPS i varierende doser, 24 hr før vurdere fagocytose (B) Challenge med 1,42 mg /. kg resulterede i en signifikant større procentdel af fagocytisk retinal mikroglia når sammenlignet med vehikel kontroller (p = 0,0021). (C) Denne protokol kan anvendes til at måle retinal mikroglial fagocyterende funktion i pup og voksne mus ens. Der er en betydelig mindre procentdel af fagocytisk mikroglia i voksne mus sammenlignet med unge (p10) mus (p = 0,019) ikke udfordret med LPS. n = 9 -12, puljet fra tre til fireuafhængigt forsøg; fejl søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er tre kritiske trin i denne fremgangsmåde: (1) intravitreal injektion af fluorescensmærkede partikler; (2) høst og klargøring af retinavæv; og (3) flowcytometrisk analyse. Vi anbefaler, at forskere praktiserer intravitreale injektioner før udøvelse af fremgangsmåden vi præsenterer her. Albinomus (fx BALB / c) og en farvet opløsning (f.eks fluorescensmærkede partikler) kan anvendes til nem visualisering af nålen og injiceret opløsning. Intravitreale injektioner er udfordrende, og hvis ikke udføres korrekt vil føre til partiske og variable resultater. Almindelige problemer forbundet med dårlig injektionsteknik er perforering af linsen og / eller beskadigelse af nethinden, hvilket kan resultere i blødning og inflammation. For at minimere risikoen for trauma for øjet, bør gnaveren være i en stabil position med minimal hoved bevægelse. At trænge ind i øjeæblet, bør sprøjten indsættes langsomt og ikke skubbes for langt til at undgå at rammelinsen. En anden almindelig komplikation er tilbagesvaling af det injicerede materiale ud af øjet. For at undgå dette, skal stemplet nedtrykkes langsomt og, efter injektion, bør øjeæblet have lov til at trække sig tilbage ind øjenhulen og sprøjten bør tilbagetrukket langsomt. De bedste intravitreale injektioner aktivere mikroglia ved lave niveauer, men klare forskelle mellem ubehandlede og behandlede grupper kan måles. Det er vigtigt, at passende kontroller (f.eks, ikke-udfordrede mus) anvendes i hvert forsøg for at etablere baseline fagocytiske niveauer. Et andet aspekt af denne metode, der kræver praksis er det retinale dissektion. For at sikre sammenlignelige enkelt cellepræparater tværs prøver, skal retinal væv indsamles hurtigt og med minimal mulighed væv forstyrrelser. Udførelse af de sidste trin i dissektion i PBS (se 3.4 - 3.7) vil lette indsamlingen. Endelig er det vigtigt at forberede den retinale væv til flowcytometri korrekt. Aktiverede mikroglia opregulere Fcreceptorer og dermed ikke-specifik binding til Fc-delen af antistoffer kan forekomme 7. En Fc blok skal udføres for at forhindre uspecifik farvning. Udvælgelse af egnede fluoroforer og kompensation oprettet er også vigtigt 27.
Vi bruger rutinemæssigt mus i alderen 10 til 20 postnatal dag til disse eksperimenter. Dog kan denne protokol også anvendes til at vurdere mikroglial fagocyterende funktion i voksne mus (figur 3C). Af note, grundet tilstedeværelsen af den hyaloide vaskulatur, populationer af exogene myeloide celler (Ly6C + eller Ly6G +) er mere fremtrædende i unge mus (ca. 40 - 50% af alle CD11b + celler) end hos voksne (ca. 5% af alle CD11b + celler). Forskerne skal bestemme den mest hensigtsmæssige for deres eksperimenter alder. Protokollen præsenteres her muliggør robust detektering af niveauerne af fagocytiske mikroglia i nethinden. Vi anbefaler dog, at 03:57 biologiskeal replikater anvendes i hvert forsøg og udføres, at mindst tre uafhængige forsøg. Mens de partikler, der anvendes i denne protokol er blevet valideret for fagocytiske analyser 21-23, hvis yderligere validering er påkrævet, immunhistokemisk co-lokalisering af partiklerne med specifikke fagocytiske markører kunne udføres.
En potentiel begrænsning ved denne metode er forskellig adgang af mikroglia til partiklerne. I den normale retina, mikroglia opholde sig i to lag, det dybere ydre netformige lag, og den mere overfladiske indre netformige lag, som er tættere på glaslegemet 7. Ved stimulering eller under aldring, mikroglia kan migrere gennem alle retinale lag. Ved denne fremgangsmåde er fluorescensmærkede partikler injiceret i glaslegemet. Tre timer efter injektion resulterer dette i partikel akkumulering heraf i nethinden og især langs vitreal overflade. Forskere kan yderligere optimere Concentratipå af partikler eller tid efter injektion for deres eksperimenter. Det er sandsynligt, at mikroglia i tættere på glaslegemet vil have lettere adgang til partiklerne. Alligevel viser vi, at partiklerne spredt over nethinden og optages af mikroglia i alle lag, men ikke i retinale pigmenterede epithelium (RPE) celler, sandsynligvis på grund af begrænset bead adgang (Figur 1C-E). Vi har endnu ikke afgøre, om subretinal mikroglia (som kan ophobes med alderen) ville få adgang til partiklerne. Hvis dette er vigtigt for forskeren, kunne denne protokol udføres efter omhyggelig subretinal injektion af partiklerne. En anden vigtig overvejelse er, at der kan være iboende forskellige adfærd mellem retinal mikroglia og mikroglia i andre dele af CNS. Det er velkendt, at specifikke hjerneregioner har forskellig modtagelighed for sygdom. For eksempel i Parkinsons sygdom, neuroner i substantia nigra er mest påvirket, mens i AlzHeimer sygdom, bliver de hippocampusneuroner mest påvirket 28. , Når man studerer patologien af en specifik sygdom, hjerne region er således sandsynligvis være en vigtig faktor. En lignende protokol til den her beskrevne kan udføres efter intrakranial injektion for at udforske potentielle forskelle i den fagocytiske reaktion mellem retinale og hjerne mikroglia. Nethinden har mange fælles træk med andre regioner af hjernen, herunder tilstedeværelsen af en blod-retina-barrieren 20. Retina mikroglia og hjerne mikroglia stammer fra de samme blommesækken stamfædre og synes meget ens med hensyn til morfologi og celle-overflade markør udtryk 7,29. Endvidere flere hjernesygdomme (fx Alzheimers sygdom, slagtilfælde og dissemineret sklerose) har okulære manifestationer, hvilket indikerer, at nethinden er også påvirket 20. Mens forskere bør være opmærksomme på eventuelle regionale forskelle, mener vi, det er en informativ model foral microglia forskning, og foreslår, at alle neuroforskere studerer mikroglial fagocytose kunne bruge denne protokol.
En klar fordel at udføre dette assay i øjet er at multiple teknikker er blevet udviklet til at inducere forskellige neurogene spændinger i nethinden, og de stressresponser kan overvåges in vivo og kvantificeres ved hjælp af standardiserede protokoller 30. Ved at inducere neurogen stress og derefter udførelse af assayet beskrevet her, kan forskerne analysere mikroglia funktion over et bredt spektrum af fornærmelser, der varierer i sværhedsgrad. Endelig, når kombineret med flowcytometri sortering teknikker, denne protokol har den fordel i forhold immunhistokemi, at det kan give mulighed for dybdegående analyse af fagocytisk mikroglia (f.eks qPCR, celle-kultur, proteomics).
Optagelse af partikler er tidligere blevet anvendt til at måle fagocyterende funktion, både i in vitro og in vivo systemer. Den latter involveret intrakraniel injektion af partikler, høst og indefrysning af hjernevæv, cryosectioning, immunfarvning, billedbehandling og post-imaging-analyse 18. Protokollen præsenteres her giver mulighed for langt hurtigere kvantificering af retinal mikroglia fagocyterende funktion. Det har den fordel i forhold til in vitro-systemer, som de meget følsomme mikroglia ikke fjernes fra deres mikromiljø, hvilket muliggør vurdering af fagocyterende funktion i en fysiologisk kontekst. Specifikt skal det muliggøre afprøvning af, hvordan defekter i andre celletyper (fx genetiske ablation af gener i neuroner) påvirker mikroglia fagocyterende funktion. Det har også den fordel i forhold til tidligere in vivo-assays, at det bruger flowcytometri, der giver mulighed for hurtig, kvantitativ og nøjagtig detektion af fagocytiske cellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 ml Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
