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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

आकलन रेटिना microglial phagocytic समारोह Published: October 18, 2016 doi: 10.3791/54677
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,3, 1
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

Summary

Microglial phagocytosis महत्वपूर्ण के लिए ऊतक homeostasis और अपर्याप्त phagocytic समारोह के रखरखाव विकृति में फंसा दिया गया है। हालांकि, विवो में microglia समारोह का आकलन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। हम ठीक निगरानी और एक शारीरिक सेटिंग में microglia की phagocytic संभावित बढ़ाता के लिए एक सरल लेकिन मजबूत तकनीक विकसित की है।

Introduction

इस विधि के समग्र लक्ष्य सही आकलन और इन विवो microglial phagocytosis में यों की है। Microglia केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के ऊतक निवासी मैक्रोफेज हैं। वे ऊतक homeostasis के रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए कार्यों की एक किस्म प्रदर्शन करते हैं। ये प्रतिरक्षा निगरानी, neurotrophic कारकों का स्राव और, के निर्णायक महत्व, phagocytosis 1 शामिल हैं। Microglial phagocytosis इस तरह अप्रासंगिक synapses (synaptic छंटाई) और apoptotic न्यूरॉन्स 2-4 से हटाने के phagocytosis के रूप में मस्तिष्क और रेटिना के विकास के दौरान कई महत्वपूर्ण घटनाओं में महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, क्षतिग्रस्त या apoptotic न्यूरॉन्स, सेलुलर मलबे, और हमलावर रोगाणुओं की microglial phagocytosis वयस्कता के माध्यम से 5 सीएनएस homeostasis को बनाए रखने के लिए आवश्यक होना दिखाया गया है। अंत में, microglial phagocytosis अल्जाइमर रोग और उम्र से संबंधित सहित कई neurodegenerative रोगों के रोगजनन में फंसा दिया गया हैधब्बेदार अध: पतन, जहां यह सुझाव दिया गया है कि दोषपूर्ण या अपर्याप्त phagocytic क्षमता amyloid-β (Aβ) सजीले टुकड़े हैं और drusen क्रमश: 6.7 का निर्माण हुआ योगदान कर सकते हैं।

Microglial समारोह कसकर, उनके microenvironment द्वारा नियंत्रित किया जाता है, विशेष रूप से इस तरह के ट्यूमर वृद्धि कारक β या सेल सेल बातचीत के रूप में घुलनशील कारकों से। न्यूरॉन्स अनिवार्यता से ऐसे CD200 और CX3CL1 के रूप में कई कोशिका की सतह ligands, एक्सप्रेस, microglia विशेष रूप से संबंधित रिसेप्टर्स CD200R और CX3CR1 का इजहार करते हुए। इन रिसेप्टर्स उनके intracellular हिस्से में immunoreceptor tyrosine आधारित निषेध रूपांकनों (ITIMs) होते हैं। ये अवरोध करनेवाला रिसेप्टर्स microglia की अधिक उत्तेजना, जो neuroinflammation करने के लिए योगदान कर सकते हैं रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, न्यूरॉन्स और microglia के बीच सेल सेल बातचीत microglia एक मौन राज्य में रहते हैं। ऊतक चोट के दौरान, तथापि, न्यूरॉन्स नीचे विनियमित कर सकते हैं ऍक्स्पइन ligands के ression, microglia सक्रियण पर अपने निरोधात्मक प्रभाव को दूर। (Phagocytosis सहित) microglial समारोह इस प्रकार कसकर उनके microenvironment 8 से जुड़ा हुआ है। फिर भी, आज तक, वहाँ एक शारीरिक संदर्भ में या एक ही रास्ता है कि पूरी तरह से उनके सीएनएस microenvironment प्रतिकृति में microglia phagocytosis अध्ययन करने के लिए कोई मानकीकृत assays हैं।

कई assays इन विट्रो, जहां प्राथमिक microglia या microglia सेल लाइनों लक्ष्य कोशिकाओं (जैसे, apoptotic न्यूरॉन्स) या fluorescently लेबल मोतियों के साथ सुसंस्कृत हैं microglia की phagocytic गतिविधि को मापने के लिए विकसित किया गया है। लक्ष्य तेज तो फ्लोरोसेंट इमेजिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग या प्रवाह cytometry 9-12 मूल्यांकन किया है। ये assays कैसे औषधीय या आनुवंशिक हेरफेर microglial phagocytosis जबकि जानकारीपूर्ण, पूरी तरह से विवो वातावरण में जटिल दोहराने के लिए असफल प्रभावित कर सकता है और, के परीक्षण की अनुमति। microglial phagocytosis की जांच के लिए अप्रत्यक्ष तरीकोंविवो में सूचित किया गया है: ये, phagocytic की प्रतिरक्षाऊतकरसायन पता लगाने के द्वारा phagocytosis (जैसे, CD68) में शामिल होने का सोचा अणुओं के धुंधला द्वारा पूरा कर रहे हैं microglia और लक्ष्य phagocytosis के लिए (जैसे, समझौता न्यूरॉन्स या synaptic तत्व) की शारीरिक निकटता का आकलन करने के लिए, या microglial कोशिकाओं के भीतर लक्ष्य (जैसे, Aβ) 13-17। दो अध्ययनों विवो में microglia phagocytosis आकलन करने के लिए और अधिक प्रत्यक्ष दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है। ह्यूजेस और उनके सहयोगियों ने इमेजिंग तकनीक का इस्तेमाल किया है intracranial मार्ग 18 के माध्यम से वितरित मोतियों की microglial तेज मापने के लिए। सिएरा एट अल। एक परिष्कृत विधि मात्रात्मक जटिल इमेजिंग तकनीक का उपयोग करते हुए 4 apoptotic कोशिकाओं की microglia phagocytosis आकलन करने के लिए विकसित की है। हालांकि, इन तरीकों ऊतक तैयारी, सेक्शनिंग, इमेजिंग, और विश्लेषण के लिए जटिल प्रोटोकॉल शामिल है। हम पहले प्रवाह cytometric विश्लेषण का इस्तेमाल किया है बाहर फोटोरिसेप्टर के phagocytosis आकलन करने के लिएएर खंडों संस्कृति 19 में रेटिना pigmented उपकला (RPE) कोशिकाओं द्वारा। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल तेजी से तेज की इन विवो microglia phagocytosis की एक मात्रात्मक उपाय के रूप में रेटिना microglia द्वारा fluorescently लेबल कणों का आकलन करने का वर्णन है।

(1) fluorescently लेबल कणों की intravitreal वितरण, (2) फसल और रेटिना ऊतक की तैयारी, और (3) प्रवाह: प्रोटोकॉल हम यहाँ वर्णन तीन महत्वपूर्ण चरणों में छह बस के नीचे घंटों में रेटिना microglial phagocytosis की विश्वसनीय और मात्रात्मक मापन के लिए अनुमति देता है cytometric विश्लेषण। विधि हम विकसित किया है रेटिना में microglial phagocytosis आकलन करने के लिए एक मजबूत विधि है, और इसे सफलतापूर्वक कैसे विभिन्न यौगिकों या आनुवंशिक हेरफेर शारीरिक सेटिंग्स में इस कुंजी microglial समारोह में परिवर्तन का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सीएनएस की एक विशेष क्षेत्र के रूप में, रेटिना microglia समारोह 20 अध्ययन करने के लिए एक आसानी से सुलभ मॉडल प्रणाली है। इस विधि टी में विकसित किया गया था जबकिवह आंख, हमें विश्वास है कि यह microglia phagocytic समारोह की जांच सब neuroscientists के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Protocol

सभी जानवरों को नैतिक स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार इलाज किया गया।

इंजेक्शन के लिए सामग्री की 1. तैयारी

  1. एक 33 जी सुई और सिरिंज जीवाणुरहित: सी ο 115 पर जुदा और आटोक्लेव बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में बढ़ती द्वारा इंजेक्शन के लिए सुई तैयार करें।
  2. 10 मिनट - 5 के लिए कमरे के तापमान पर fluorescently लेबल कणों गला लें। सीए 2/2 मिलीग्राम + साथ बाँझ पीबीएस में एक 50 मिलीग्राम / एमएल समाधान के लिए पुनर्गठन द्वारा इंजेक्शन के लिए कण समाधान तैयार है।
    नोट: फंगल मूल के AF488 लेबल कणों कि phagocytosis assays के लिए मान्य किया गया है इस प्रोटोकॉल 21-23 में किया जाता है। इष्टतम तेज के लिए, कण ताजा और तुरंत इंजेक्शन से पहले तैयार करते हैं।
    नोट 2: कण सांद्रता प्रत्येक विशिष्ट प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

2. मनका समाधान के Intravitreal इंजेक्शन

नोट: दो पीeople, इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं, एक तरह से इस तरह है कि व्यक्ति को इंजेक्शन प्रदर्शन माउस पकड़ और नेत्रगोलक पर फोकस बनाए रख सकते हैं, जबकि दूसरे व्यक्ति से भरी हुई सिरिंज से गुजरता है और सवार को धक्का।

  1. 20 μl / शरीर के वजन के 10 ग्राम की एक खुराक पर 100 मिलीग्राम / एमएल ketamine और 10 मिलीग्राम / एमएल xylazine की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा कृंतक बेहोश करना। इंजेक्शन से पहले, संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग करें।
    नोट: Isoflurane माइलॉयड सेल समारोह पर गहरा प्रभाव पड़ता है, इस प्रकार, इस परख भर में इसके उपयोग 24,25 से बचा जाना चाहिए।
  2. 0.5 μl के fluorescently लेबल कण समाधान के साथ लोड सुई।
  3. बग़ल में एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 ए-बी) के तहत माउस निर्धारित करना। माउस की बेहतर स्थिति के लिए एक नरम सामग्री, जैसे, एक जेल पैक, का प्रयोग करें। युवा चूहों जिसमें आँखें अभी तक नहीं खोल रहे हैं के लिए, धीरे से एक fissu बनाने के द्वारा ठीक 45 ओ angled संदंश की मदद से पलकें खुलीभट्ठा के साथ फिर से जो पलकों से अंत में खुल जाएगा।
    1. ठीक 45 ओ angled संदंश की मदद से ध्यान से, पलक के आसपास दबाव लागू इतना है कि नेत्रगोलक सॉकेट से बाहर थोड़ा चबूतरे। सिर्फ कान के ऊपर दो उंगलियों के साथ और उसके जबड़े से सिर पकड़ और धीरे पलकों के समानांतर में त्वचा में खिंचाव आंख से थोड़ा सॉकेट से बाहर रखने के लिए। भी गले (चित्रा 1 बी) के करीब काबू करने के लिए सावधान रहें।
  4. नेत्रगोलक पंचर करने के लिए, कॉर्निया किनारी में सिरिंज की सुई डालने (जहां कॉर्निया और श्वेतपटल कनेक्ट)। इस pigmented चूहों में एक ग्रे चक्र के रूप में दिख रहा है। सुई से थोड़ा वापस लेना कांच का तरल पदार्थ की एक छोटी मात्रा निष्कासित करने के लिए और फिर इंजेक्षन। व्यक्ति इंजेक्शन प्रदर्शन धीरे एक हाथ और दूसरे के साथ सुई के साथ माउस धारण करना चाहिए; दूसरा व्यक्ति धीरे-धीरे सवार धक्का चाहिए।
  5. सिरिंज धीरे-धीरे वापस लेना। लागू आंख मॉइस्चराइजिंग आंख हाइड्रेटेड रखने के लिए चला जाता है। </ Li>
  6. कृंतक एक गर्मी पैड पर एक पिंजरे में वसूली और जानवर की निगरानी के लिए जारी है। पिल्ले के साथ काम करते हैं, तो दूसरे चेतावनी जानवरों जब तक यह श्वास और सहज आंदोलन करने में सक्षम है के साथ एक पिंजरे में पशु वापस नहीं है। वयस्कों के साथ काम कर रहे हैं, जब तक यह स्टर्नल लेटना आएगा अन्य चेतावनी जानवरों के साथ एक पिंजरे में कृंतक वापस नहीं है।

3. रेटिना ऊतक की कटाई

नोट: fluorescently लेबल कणों के साथ इंजेक्शन नहीं आँखों से रेटिना ऊतक प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक नियंत्रण के रूप में एकत्र किया जाना चाहिए। हालांकि परख एक भी रेटिना का उपयोग किया जा सकता है, सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, दो रेटिना एक साथ जमा किया जाना चाहिए।

  1. fluorescently लेबल कणों की intravitreal इंजेक्शन के बाद रेटिना ऊतक 3 घंटा लीजिए।
    नोट: कण समाधान के इंजेक्शन के बाद समय प्रत्येक विशिष्ट प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हमने पाया है कि इंजेक्शन के बाद 3 घंटा, कण तेज सबसे परतों ओ भर में देखा जा सकता हैरेटिना (चित्रा 1 सी-डी) च।
  2. ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों बलिदान।
  3. धीरे नेत्रगोलक proptose को ठीक 45 ओ कोणीय संदंश की मदद से पलक के खिलाफ दबाकर आंखों लीजिए। नेत्रगोलक और पुल के पीछे संदंश स्थिति।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत रेटिना काटना। सीए 2/2 मिलीग्राम + साथ पीबीएस की एक छोटी राशि युक्त एक पेट्री डिश के लिए नेत्रगोलक स्थानांतरण। पेट्री डिश के एक शुष्क क्षेत्र में, अति सूक्ष्म संदंश की नोक से कॉर्निया किनारी में नेत्रगोलक छेदना।
  5. ठीक 45 ओ angled संदंश की मदद से नेत्रगोलक पकड़ो और वसंत कैंची का उपयोग कॉर्निया किनारी के आसपास कटौती करने के लिए, जब तक कार्निया किनारी परिधि के लगभग आधा काट रहा है।
  6. ठीक 45 ओ angled संदंश के साथ नेत्रगोलक पकड़ो और पीबीएस में नेत्रगोलक लाने के लिए। ठीक 45 ओ angled संदंश की एक दूसरी जोड़ी के साथ कॉर्निया और श्वेतपटल फाड़। लेंस और रेटिना बाहर आ जाएगा मैंntact।
  7. लेंस और रेटिना अलग करें। रेटिना लीजिए और एक 5.4 मिलीलीटर polystyrene परीक्षण सीए 2/2 मिलीग्राम + साथ पीबीएस के 2 मिलीलीटर युक्त ट्यूब को हस्तांतरण।

4. एक एकल कक्ष निलंबन तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों के मामूली संशोधनों के साथ एक न्यूरोनल ऊतक हदबंदी किट का उपयोग कर एकल कक्ष निलंबन तैयार करें। संक्षेप में, ऊपर pipetting और एक P1000 विंदुक के साथ नीचे और मिलाते हुए बिना 37 ओ सी में एक enzymatic पाचन प्रदर्शन से Triturate रेटिना।

प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए 5. धुंधला एकल कक्ष निलंबन

  1. धुंधला बफर के 200 μl में Resuspend कोशिकाओं और हस्तांतरण एक यू के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली (Dulbecco फॉस्फेट बफर 0.2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.09% सोडियम azide के साथ खारा)। 130 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    नोट: सोडियम azide मानव और पर्यावरण के लिए हानिकारक है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण एक का प्रयोग करेंएन डी स्थानीय नियमों के अनुसार अपशिष्ट त्यागें।
  2. एक सिंक पर प्लेट पलटना सतह पर तैरनेवाला त्यागें। दाग प्रति अच्छी तरह से विरोधी माउस CD16 / CD32 एंटीबॉडी के 5 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त बफर के 25 μl में एफसी रिसेप्टर्स, resuspend कोशिकाओं को ब्लॉक करने के लिए। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. धुंधला विरोधी माउस Ly6C एपीसी-Cy7 के 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल, विरोधी माउस Ly6G पीई Cy7 के 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल और विरोधी माउस CD11b-AF650 के 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त बफर के 25 μl जोड़ें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. 130 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। प्लेट पलटना सतह पर तैरनेवाला त्यागें। धुंधला बफर के 200 μl में कोशिकाओं resuspending द्वारा धो लें।
  5. 130 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। दाग propidium आयोडाइड (पीआई) के 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त बफर के 200 μl में Resuspend। 1.2 मिलीलीटर microtiter ट्यूबों के लिए स्थानांतरण।
  6. में पिछले 200 μl के साथ पीआई और पूल के 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त धुंधला बफर के एक अतिरिक्त 100 μl के साथ कुओं धो1.2 मिलीलीटर microtiter ट्यूबों। दाग कोशिकाओं के 300 μl की कुल मात्रा प्राप्त की है।

6. प्रवाह cytometric विश्लेषण

  1. एक पारंपरिक तीन लेजर (बैंगनी, नीले, लाल और लेजर) का उपयोग करना, पीई, PerCP-Cy5.5, BV510, और पीआई अत्यंत उज्ज्वल फ्लोरोसेंट AF488-कणों से महत्वपूर्ण spillover के कारण रंगों से बचें। इस परख अनुकूलन करने के लिए, के रूप में यह (PerCP-Cy5.5 चैनल के बजाय mCherry चैनल में) एक पीई लेबल एंटीबॉडी और पीआई के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2) के प्रयोग की जाने वाली एक चौथाई (पीला) लेजर का प्रयोग करें।
    नोट: एक पीले रंग की लेजर उपलब्ध नहीं है, तो एक और चैनल में एक मृत सेल बहिष्कार डाई का उपयोग करें।
  2. गेट पीआई नकारात्मक कोशिकाओं (PI-) पर मृत कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) को बाहर करने के लिए।
  3. मृत कोशिकाओं, CD11b सकारात्मक कोशिकाओं (CD11b +) पर गेट को छोड़कर जाने के बाद, यह सब माइलॉयड कोशिकाओं (चित्रा -2) शामिल होंगे।
  4. CD11b + आबादी, Ly6C पर फाटक के भीतर - / Ly6G - बाहर करने के लिएन्यूट्रोफिल (CD11b + / Ly6G +) और monocytes (CD11b + / Ly6C +, चित्रा 2 डी)। Microglia (- / Ly6G - यहाँ CD11b + / Ly6C के रूप में परिभाषित सादगी के लिए) पर gating के बाद, दो स्पष्ट आबादी दिखाई जानी चाहिए; एक नकारात्मक और एक fluorescently लेबल कणों के लिए सकारात्मक। Phagocytic कोशिकाओं कणों को लिया जाएगा और इसलिए कर रहे हैं AF488 + (चित्रा 2 ई)।
    नोट: Ly6C सकारात्मक या Ly6G सकारात्मक आबादी भी इस धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग कण तेज मापने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। Phagocytic CD11b + कोशिकाओं का प्रतिशत phagocytic microglia का प्रतिशत (चित्रा 2 एफ) के साथ अच्छी तरह से संबद्ध। फ्लो का अनुभव बिना शोधकर्ताओं के लिए, अकेले CD11b धुंधला के साथ एक सरल विश्लेषण, किया जा सकता है, हालांकि इस phagocytic न्यूट्रोफिल और monocytes, साथ ही microglia शामिल होंगे। / Ly6G - - इस CD11b + / Ly6C भीतर </ Sup> जनसंख्या, इन कोशिकाओं> 99% microglia के रूप में मार्कर F4 / 80 और CX3CR1 साथ धुंधला द्वारा न्याय कर रहे हैं; इन मार्करों जोड़ा जा सकता है, लेकिन हमारे हाथ में आवश्यक नहीं हैं।

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Representative Results

यहाँ हम एक विधि का वर्णन तेजी से और मज़बूती का उपयोग कर प्रवाह cytometric विश्लेषण (चित्रा 2) एक शारीरिक सेटिंग में phagocytic रेटिना microglia की संख्या यों। इस विधि की phagocytic क्षमता पर यौगिकों और / या आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता microglia (आंकड़े 3 ए, 3 बी)। (- 20 दिन प्रसव के बाद 10) या वयस्क चूहों (चित्रा -3 सी) यह भी युवा में इस्तेमाल किया जा सकता है। lipopolysaccharide के अलग खुराक (एलपीएस) intraperitoneally दिलाई गई। एलपीएस चुनौती के बाद 24 घंटे, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रेटिना microglia phagocytic समारोह (चित्रा 3) का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। 1.42 मिलीग्राम की एक खुराक / LPS के किलो phagocytic microglia के प्रतिशत में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि प्रेरित जब, वाहन नियंत्रण (चित्रा 3 बी) की तुलना में उम्मीद की होगी 26।


चित्रा 1: Intravitreal इंजेक्शन सेटअप और प्रतिनिधि रेटिना धारा रेटिना परतों में fluorescently लेबल कण दिखा। (ए) एक जेल पैक डी विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे तैनात है। (बी) के रूप में intravitreal इंजेक्शन के लिए आंख की स्थिति के लिए दिखाया गया है एक कृंतक आयोजित किया जाता है। (सी) तीन घंटे के बाद इंजेक्शन fluorescently लेबल कणों भर में सबसे रेटिना परतों देखा जा सकता है। ( , ई) CX3CR1 GFP / GFP चूहों और एक लाल fluorophore के साथ लेबल कणों microglia द्वारा कण तेज कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। गहरी (डी) में Microglia और सतही (ई) परतों कणों ले। स्केल बार -। 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: gating रणनीति, phagocytic Microglia का चयन करने के लिए (ए) एक P10 माउस से रेटिना के ऊतकों से एकल कक्षों निलंबन विश्लेषण कर रहे हैं (बी) मृत कोशिकाओं को छोड़कर (पीआई +) के बाद (सी) CD11b + कोशिकाओं चुने गए हैं (घ) के।।। केवल microglia के लिए चयन करें, CD11b + न्यूट्रोफिल (Ly6G +) और monocytes (Ly6C +) (ई) के बाहर रखा गया है। phagocytic microglia अप fluorescently लेबल कणों लिया जाएगा। (एफ) phagocytic CD11b + कोशिकाओं की संख्या microglia के समान है (CD11b + Ly6G - Ly6C -)। एन = 9, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से जमा; त्रुटि सलाखों मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं।rget = "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Microglia phagocytic समारोह LPS चैलेंज के बाद और पिल्ले और वयस्क चूहों में मूल्यांकन किया जा सकता है (ए) युवा चूहों (P10), अलग-अलग मात्रा में intraperitoneal LPS के साथ चुनौती दी थी phagocytosis का आकलन करने से पहले 24 घंटे के लिए (बी) 1.42 मिलीग्राम के साथ चुनौती /। जब वाहन नियंत्रण (पी = 0.0021) की तुलना किलो phagocytic रेटिना microglia की एक काफी बढ़ प्रतिशत में हुई। (सी) इस प्रोटोकॉल पिल्ला और वयस्क चूहों को समान रूप में रेटिना microglial phagocytic समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वहाँ वयस्क चूहों में phagocytic microglia की एक काफी छोटे प्रतिशत है जब युवा (P10) चूहों (पी = 0.019) LPS के साथ चुनौती नहीं की तुलना में। एन = 9 -12, तीन से चार से जमास्वतंत्र प्रयोग; त्रुटि सलाखों मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस विधि में तीन महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: (1) fluorescently लेबल कणों की intravitreal इंजेक्शन; (2) कटाई और रेटिना ऊतक की तैयारी; और (3) प्रवाह cytometric विश्लेषण। हम अनुशंसा करते हैं कि शोधकर्ताओं ने विधि हम यहाँ मौजूद प्रदर्शन करने से पहले intravitreal इंजेक्शन अभ्यास। सूरजमुखी मनुष्य चूहों (जैसे, BALB / सी) और एक रंग का समाधान (जैसे, fluorescently लेबल कण) सुई के आसान दृश्य और इंजेक्शन समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Intravitreal इंजेक्शन चुनौती दे रहे हैं और अगर सही ढंग से प्रदर्शन नहीं पक्षपाती और चर परिणामों को बढ़ावा मिलेगा। गरीब इंजेक्शन तकनीक के साथ जुड़े आम समस्याओं लेंस और / या रेटिना को नुकसान, जो खून बह रहा है और सूजन में परिणाम हो सकता है के छिद्र हैं। आंखों के लिए आघात के जोखिम को कम करने के लिए, कृंतक न्यूनतम सिर आंदोलन के साथ एक स्थिर स्थिति में होना चाहिए। नेत्रगोलक घुसना करने के लिए, सिरिंज धीरे धीरे और नहीं डाला जाना चाहिए मार से बचने के लिए बहुत दूर धकेल दियालेंस। एक अन्य आम समस्या आंख से बाहर इंजेक्शन सामग्री के भाटा है। इससे बचने के लिए, धीरे-धीरे सवार उदास किया जाना चाहिए और, इंजेक्शन के बाद, नेत्रगोलक थैली में वापस लेना करने की अनुमति दी जानी चाहिए और सिरिंज धीरे से मुकर जाना चाहिए। सबसे अच्छा intravitreal इंजेक्शन निम्न स्तर पर microglia सक्रिय है, लेकिन इलाज और इलाज समूहों के बीच स्पष्ट मतभेद मापा जा सकता है। यह जरूरी है कि उचित नियंत्रण (जैसे, गैर चुनौती दी चूहों) आधारभूत phagocytic स्तरों की स्थापना के लिए एक प्रयोग किया जाता है। अभ्यास की आवश्यकता है कि इस पद्धति का एक और पहलू रेटिना विच्छेदन है। नमूनों भर में तुलनीय एकल कक्ष की तैयारियों को सुनिश्चित करने के लिए, रेटिना ऊतक तेजी से और कम से कम संभव ऊतक विघटन के साथ एकत्र किया जाना चाहिए। पीबीएस में विच्छेदन के अंतिम चरणों का प्रदर्शन (3.4 देख - 3.7) संग्रह की सुविधा होगी। अंत में, यह cytometry सही ढंग से प्रवाह के लिए रेटिना ऊतक तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। सक्रिय microglia upregulate एफसीरिसेप्टर्स और इस तरह अविशिष्ट एंटीबॉडी के एफसी भाग के लिए बाध्य 7 हो सकता है। एक एफसी ब्लॉक अविशिष्ट धुंधला को रोकने के लिए किया जाना चाहिए। उचित fluorophores और मुआवजे की स्थापना का चयन भी महत्वपूर्ण 27 है।

हम नियमित रूप से इन प्रयोगों के लिए 10 से 20 आयु वर्ग के प्रसव के बाद दिन चूहों का उपयोग करें। हालांकि, इस प्रोटोकॉल भी वयस्क चूहों (चित्रा -3 सी) में microglial phagocytic समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। (- सभी CD11b + कोशिकाओं का 50% लगभग 40) वयस्कों (सभी का लगभग 5% की तुलना में ध्यान दें, काँचाभ वाहिका की उपस्थिति के कारण की, बहिर्जात माइलॉयड कोशिकाओं (Ly6C + या Ly6G +) की आबादी युवा चूहों में अधिक प्रमुख हैं CD11b + कोशिकाओं)। शोधकर्ताओं ने उम्र उनके प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त का निर्धारण करना चाहिए। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल रेटिना में phagocytic microglia के स्तर के मजबूत पता लगाने के लिए अनुमति देता है। हालांकि, हम यह है कि तीन से चार जीवविज्ञान करने की सिफारिशअल प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा replicates और कहा कि कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कणों phagocytic assays 21-23 के लिए मान्य किया गया है, यदि अतिरिक्त सत्यापन की आवश्यकता है, विशिष्ट phagocytic मार्कर के साथ कणों की प्रतिरक्षाऊतकरसायन सह स्थानीयकरण प्रदर्शन किया जा सकता है।

इस विधि से एक संभावित सीमा कणों को microglia के अंतर का उपयोग है। सामान्य रेटिना में, microglia दो परतों, गहरी बाहरी उलझन परत, और अधिक सतही भीतरी उलझन परत है, जो कांच का 7 के करीब है में रहते हैं। उत्तेजना पर, या उम्र बढ़ने के दौरान, microglia सभी रेटिना परतों भर में पलायन कर सकते हैं। इस विधि में, fluorescently लेबल कणों शीशे में इंजेक्ट कर रहे हैं। इंजेक्शन के बाद तीन घंटे के इस रेटिना भर में और विशेष रूप से vitreal सतह के साथ कण संचय में परिणाम है। शोधकर्ताओं ने आगे concentrati का अनुकूलन कर सकते हैंउनके प्रयोगों के लिए इंजेक्शन के बाद कणों या समय की है। ऐसा नहीं है कि शीशे के करीब निकटता में microglia कणों के लिए आसान उपयोग होगा संभावना है। फिर भी, हम बताते हैं कि कणों रेटिना भर में फैल गया है और शायद सीमित मनका एक्सेस (चित्रा 1C-ई) की वजह से सभी परतों के पार लेकिन रेटिनल pigmented उपकला (RPE) कोशिकाओं में नहीं microglia द्वारा लिया जाता है। हम अभी तक निर्धारित किया जाए subretinal microglia (जो उम्र के साथ जमा कर सकते हैं) के कणों के लिए पहुँच प्राप्त होता है। यदि यह शोधकर्ता के लिए महत्वपूर्ण है, इस प्रोटोकॉल के कणों से सावधान subretinal इंजेक्शन के बाद किया जा सकता है। एक अन्य महत्वपूर्ण विचार वहाँ रेटिना microglia और सीएनएस के अन्य क्षेत्रों में microglia के बीच स्वाभाविक अलग व्यवहार हो सकता है। यह सर्वविदित है कि विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों रोग के लिए अलग भावनाएँ है। उदाहरण के लिए, पार्किंसंस रोग में, द्रव्य नाइग्रा में न्यूरॉन्स ज्यादातर प्रभावित कर रहे हैं, जबकि Alz मेंHEIMER रोग, hippocampal न्यूरॉन्स ज्यादातर 28 प्रभावित कर रहे हैं। इस प्रकार, जब एक विशेष बीमारी की विकृति का अध्ययन, मस्तिष्क क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण कारक होने की संभावना है। यहाँ वर्णित एक करने के लिए इसी तरह की एक प्रोटोकॉल रेटिना और मस्तिष्क के बीच microglia phagocytic जवाब में संभावित मतभेद का पता लगाने के intracranial इंजेक्शन के बाद किया जा सकता है। रेटिना एक रक्त रेटिना के लिए बाधा की उपस्थिति 20 सहित मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों के साथ कई आम सुविधाओं की है। रेटिना microglia और मस्तिष्क microglia ही जर्दी थैली पूर्वज से ही शुरू और आकृति विज्ञान और सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति 7,29 के संबंध में बहुत समान दिखाई देते हैं। इसके अलावा, कई मस्तिष्क रोगों (जैसे, अल्जाइमर रोग, स्ट्रोक, और एकाधिक काठिन्य), नेत्र अभिव्यक्तियों है यह दर्शाता है कि रेटिना भी है 20 प्रभावित किया। शोधकर्ताओं ने संभावित क्षेत्रीय मतभेद के बारे में पता होना चाहिए, हमें विश्वास है कि इस के लिए एक जानकारीपूर्ण मॉडल हैसभी microglia अनुसंधान, और सुझाव है कि सभी neuroscientists microglial phagocytosis अध्ययन कर इस प्रोटोकॉल इस्तेमाल कर सकते हैं।

आंखों में इस परख प्रदर्शन के विशिष्ट लाभ यह है कि कई तकनीकों रेटिना में विविध तंत्रिकाजन्य तनाव प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया है, और तनाव प्रतिक्रियाओं विवो में नजर रखी जा सकती है और मात्रा निर्धारित मानकीकृत प्रोटोकॉल 30 का उपयोग कर रहा है। तंत्रिकाजन्य तनाव उत्प्रेरण और फिर प्रदर्शन परख यहाँ वर्णित, शोधकर्ताओं अपमान है कि गंभीरता में भिन्नता की एक व्यापक स्पेक्ट्रम भर microglia समारोह का विश्लेषण कर सकते हैं। अंत में, जब छँटाई तकनीक प्रवाह cytometry के साथ संयुक्त, इस प्रोटोकॉल लाभ immunohistochemistry कि यह phagocytic microglia (जैसे, qPCR, सेल संस्कृति, प्रोटिओमिक्स) की गहराई में विश्लेषण के लिए अनुमति हो सकती है खत्म हो गया है।

कणों के तेज पहले phagocytic समारोह, दोनों में इन विट्रो और इन विवो प्रणालियों में मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Latter कणों, संचयन और मस्तिष्क के ऊतकों, cryosectioning, immunostaining, इमेजिंग और बाद इमेजिंग विश्लेषण 18 की ठंड के intracranial इंजेक्शन शामिल किया गया। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल रेटिना microglia phagocytic समारोह का बहुत तेजी से मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। यह इन विट्रो प्रणाली है कि अत्यधिक संवेदनशील microglia उनकी microenvironment से नहीं हटा रहे हैं, एक शारीरिक संदर्भ में phagocytic समारोह के आकलन के लिए अनुमति देने के लिए अधिक लाभ है। विशेष रूप से, यह कैसे अन्य प्रकार की कोशिकाओं में दोष (जैसे, न्यूरॉन्स में जीन की आनुवंशिक पृथक) microglia phagocytic समारोह को प्रभावित के परीक्षण के लिए सक्षम होना चाहिए। यह भी विवो assays में पिछले से अधिक लाभ यह प्रवाह cytometry का उपयोग करता है, phagocytic सेल आबादी की, तेजी से मात्रात्मक, और सटीक पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon Discontinued
Hamilton syringe, 600 series Sigma 26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o Hamilton 7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific Z-23373 Prepare immediately before injection
DPBS Corning 21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Need two
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-10 Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube Falcon 352054
96 well U-bottom plate Falcon 353077
Stain Buffer (BSA) BD Biosciences 554657
CD11b-BV650 Antibody BioLegend 101259
Ly6C-APC-Cy7 BioLegend 128025
Ly6G-PE-Cy7 BioLegend 127617
Propidium Iodide BD Biosciences 556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody BioLegend 101301

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 116 phagocytosis microglia मैक्रोफेज रेटिना, प्रवाह cytometry माइलॉयड कोशिकाओं
आकलन रेटिना microglial phagocytic समारोह<em&gt; Vivo</em&gt; एक से फ्लो आधारित परख का उपयोग
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Murinello, S., Moreno, S. K.,… More

Murinello, S., Moreno, S. K., Macauley, M. S., Sakimoto, S., Westenskow, P. D., Friedlander, M. Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay. J. Vis. Exp. (116), e54677, doi:10.3791/54677 (2016).

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