The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.
발견 결핵 (TB)의 치료 기간을 단축 항 감염 제를 진행 시급하다. 결핵균, TB의 병인 에이전트 인한 표현형 약제 내성을 나타내는 균의 존재를 신속하고 지속적인 요법으로 난치성이다. 는 C harcoal 갈치가 ssay (CARA)를 esazurin r에하는 복제 및 M. 결핵 비 복제에 대한 높은 처리량 검사 캠페인에 의해 발견 활성 분자를 특성화하는 도구로 개발되었다. 세균 한천 배지에서 활성탄 포함될 화합물 이월의 영향을 완화하는 것을 돕고, CARA에 마이크로 스폿 팅 전에 세포를 미리 희석 할 필요가 없다. 37 ° C에서 7~10일 잠복기 후에, 카라 마이크로 웰의 표면 상에 성장하는 마이코 박테리아 microcolonies하여 레사 주린의 감소는 반 정량적 ASSE 허용형광 측정을 통해 세균 수의 ssment. 카라는 약 박테리아의 숫자에서 2-3 로그 (10)의 차이를 감지하고 ≥99 % 세균 명 (MBC ≥99)에 이르는 최소 살균 농도를 예측한다. 카라는 분자가 복제 간균, 비 복제, 또는 두 가지 모두에 활성 상태인지 여부를 결정하는 데 도움이됩니다. 카라를 사용하여 파일럿 실험은 테스트 에이전트와 화합물 노출 시간의 농도가 집락 형성 단위 (CFU) 분석에 의해 추가로 평가해야하는의 식별을 용이하게한다. 복제 활성제는 살균 또는 정균 경우 또한, 카라 예측할 수있다.
결핵균, 결핵의 병인 에이전트, 항생제 박멸에 반응하는 잠재 상태의 호스트에서 살아남을 수 있습니다. 감염시 결핵균의 표현형 (비 유전자) 저항 비 복제 바실러스 1,2- 집단에 부분적으로 기인 할 것으로 여겨진다. 표현형 약물 내성을 표시하는 클래스 I 영속 약물에 민감한 세포 3,4의 큰 집단 사이에 드문 확률 적 메커니즘을 통해 발생한다. 클래스 II 영속 감염 중 발생하는 미세 환경에서 외부 응력을 포함하여 호스트 면역 요인에 의해 비 복제를 렌더링됩니다. 우리는 최근에 클래스 II의 시험 관내 모델을 개발 비 복제 활성화 된 대 식세포와 육아종에서 결핵균에 직면 조건을 모방 지속성을. 클래스 II 지속성 멀티 응력 모델은이 조건을 포함하는 이러한 지방산 탄소원 완전히 HAL 느린 성장이러한 약산성 (PH 5.0), 저산소증 (1 % O 2) 산화 질소 및 기타 반응성 질소 중간체 5-9 같은 t 성장. 비 복제의이 멀티 스트레스 모델을 사용하는 대규모 스크리닝 및 기타 클래스 II 비 복제 모델은 그 활동이 아닌 복제 상태 5-7,9-18에 관한 것이다 다양한 분자를 산출했다. 같은 비 복제 스크린은 또한, 복제 모두 비 복제 균에 대해 활성을 갖는 분자의 범주를 밝혀 "이중 활성"7,10,12,19,20 불린다.
히트 – 투 – 리드 단계에서 항균 약물의 발견은 히트 확장, 예비 약리학 적 특성, 대상 식별 및 예비 생체 효능 연구를위한 리드를 선택하는 후보 분자의 광범위한 특성을 수반한다. 초기 단계로, 항 감염 제는 승, 경우 살균을 행동의 자신의 정균 또는 살균 메커니즘에 의해 분류된다hether 세균 명씩은 시간 및 / 또는 농도 의존적이다. 식민지 형성 단위 (CFU) 분석은 이러한 문제를 해결하기 위해 고전, 금 표준 방법입니다. CFU 분석에서, 박테리아 분취가 제거 직렬로 희석 한 후, 시험 제에 노출되며, 희석 분취 고체 세균 배지에 도포하고 생존 한 세포의 성장을 허용하기 위해 배양된다. 마지막으로, 세균 콜로니를 열거한다. CFU 분석은 생존 식민지를 열거 세포와 한천 페트리 접시를 희석 마이크로 타이 터 플레이트의 많은 수를 필요로한다. 느린 성장 마이코 박테리아의 CFU 분석은 식민지 판에 표시를 위해 약 3 주 필요 그들의 느린 생성 시간 (18 ~ 24 시간),에 의해 방해된다. 또한, 인큐베이터 공간은 종종 전문 바이오 안전성 수준-3 시설에서 제한된다.
복잡하지만, CFU 분석은 mycobacter에 비 – 복제 및 이중 활성 분자의 영향을 특성화 금 표준아이오와. 비 복제 분석은 세포 생존 6-8을 평가하기 위해 분석을 복제 결합되어 많은 높은 위양성의 요금이 적용됩니다. 예를 들어, 결핵균 복제에 대한 강력한 활성을 가진 화합물 (a "활성 복제") 비 복제 분석하는 동안 죽 실패 할 수 있습니다, 그러나 아직도의 비 복제 단계에서 이월 덕분에 죽일 수 복제 ( "조건을 복제하는")를 지원하는 조건 하에서 수행되는 분석의 복구 단계로 분석. 화합물은 더 이상 수행 활동이 아닌 복제, 또는 듀얼를 복제 여부 어려운 구별 할 수있게, 이중 활성 분자의 분석을 복잡하게한다.
상술 한 문제를 해결하기 위해, 우리는 M.의 tubercul으로 마이코 박테리아 종의 급속한, 세미 양적 열거에 대한 ssay (CARA)를 esazurin을 c harcoal 가르 연구 개발OSIS, M. 보비스 BCG, 그리고 M.는 smegmatis 7 (그림 1, 2). 시험관 내에서 완충 용액에 활성탄 급속 7 결핵을 치료하기 위해 사용되는 표준 약물 대부분 담즙산이. 활성화 분석법 마이크로부터 다시 수행 할 수있다 화합물을 결합 마이크로 CARA 숯, 그리고 CARA의이 기능은 직렬 7,21,22을 열거 형 사전 분석도 내용을 희석 할 필요가 없습니다. 마이크로 CARA의 한천 표면 microcolonies 마이코 박테리아의 수는 레사 주린의 첨가에 의해 추정되며, 그 환원 형, 레조 루핀 (resorufin) 청색 염료, 그 형광 광도법 (23)에 의해 측정된다 핑크 분자이다. M.가 smegmatis 1-2 일 같은 M. 결핵 및 M.의 보비스의 BCG 느린 성장 마이코 박테리아 7-10 일 동안 배양 마이크로 CARA. 카라는 ~ 2-3 로그 (10) diffe의 좁은 다이나믹 레인지를 가지고CFU에서 알수 있습니다. 대신 CFU 분석에 사용될 때, 단일 카라 마이크로 약 도금에 사용되는 희석액 120 트라이 스타일 아가 플레이트에 사용되는 다섯 96- 웰 판을 대체한다. CARA 데이터의 해석은 더 힘든 CFU 기반 분석을에서 테스트 할 수있는 배양 시간 및 화합물 농도를 결정함으로써 후속 연구를 안내하는 데 도움이됩니다.
카라는 원래 비 복제 또는 이중 활성 분자 (7) 진행의 병목 현상을 완화하기 위해 개발되었다. 카라 차 심사 안타 CFU 분석 (그림 1)의 농도 – 반응 확인 사이의 중간 단계 역할을합니다. 하나의 CARA 판 살아남은 박테리아를 열거하는 데 사용되는 직렬 희석을 준비하는 데 필요한 다양한 마이크로 타이 터 플레이트 및 한천 페트리 접시를 대체 할 수 있기 때문에, CARA 빠르게 분자의 활동을 평가하고 화합물의 농도를 포함하여 한 번에 여러 변수를 테스트하는 간단한 방법을 제공합니다 상기 화합물에 대한 노출 시간.
CFU 분석에서, 종종 10 6 -fold까지 범위를 연속 희석뿐만 아니라, 한천 플레이트는 일반적으로 추가 ~ 800 배 (트라이 스타일의 페트리 접시에 8 ㎖의 상에 10 μL)에 의해 분자를 희석. 활성 화합물에 대한 우리의 두 단계, 멀티 스트레스 스크리닝 분석 M. TU 비는 복제berculosis는 분석의 비 – 복제 단계의 화합물에 존재하는 하나의 1/5 가지 분석 6-9 (복제) 상에 원래의 농도로 존재하며, 즉, 5 배의 이월 계수를 갖는다. 카라 완화 할 휴대 오버 효과 활성탄으로 작은 분자를 이온 봉쇄에 의해. 결핵 약물 임상 후보의 대부분은 7 스트렙토 마이신 아미노 글리코 사이드를 제외하고, 신속하고 완전히 활성탄 귀속. CFU 분석에 대한 한천 플레이트에서 활성탄의 포함에 의해 박테리아 성장 억제, 또는 박테리아 명을 방지 실시 오버 TMC207와 PA-824 7,21,22. 따라서, 세균 한천에서 활성탄을 혼입에 의해, 카라 세포 및 시험 제제의 희석액에 의존하지 않는다.
카라는 복제 활성 및 비 복제 활성 성분의 살균 효과의 정균 또는 살균에 미치는 영향을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. g에서eneral, 카라 표준 MIC 90 분석법 병렬로 사용된다. 카라의 예측 능력은 MIC (90)와 CARA 결과 (그림 2, 표 1) 비교에서 온다. 항 미코 박테리아 제를 연구하는 데 사용하는 경우, 카라 정확하게 정균 (도 4b), 비 – 복제 살균제 (도 4C), 또는 이중 활성 (도 4D)를 복제, 살균제 (도 4a)를 복제하는 활성을 예측할 수있다. 카라는 용량과 시간에 걸쳐 화합물의 활동의 간단한 평가를 허용한다. CFU 분석은 단독 투여 량 및 시간의 넓은 범위의 화합물의 활성을 평가하기위한 노력과 재료가 많이 필요하지만 카라 결과에게 조건의 범위를 좁힐 때, 태스크 (화합물 명백히 활성 인도 5 관리된다 ).
카라는의 작용을 공부 유틸리티를 가지고 있지만마이코 박테리아에 NTI-감염 제는 분석은 한계가있다. 카라는 좁은 다이나믹 레인지 (2-3 로그 10)가 하나 이상 2 (10) 로그 (3) 세균 죽이되지 않을 수 있습니다 예상되는 조건에 대해 적절하지 않을 수 있습니다. CARA 예측은 이러한 CFU 분석 등의 세균 숫자를 열거하는보다 엄격한하고 정확한 방법을 사용하여 더 많은 연구를 필요로한다. 이러한 PAS 일부 항 감염 제의 후 항생제 효과는 결핵균 7 복제에 대해 살균 및 정균 활성을 갖는 화합물을 구별하는 수단으로 예측 카라 혼동 할 수있다.
카라의 품질을 개선하기 위해 두 가지 권장 사항이 있습니다. 체적 정확성을 유지하고 마이크로 웰의 외부 튀는을 피하면서 첫째, 하나는, 마이크로 빠르게 한천 응고 전에 CARA을 부어해야합니다. 에 관계없이 필요한 접시의 수, 우리는 m를 유지하는 데 도움 매체의 0.5 ~ 1 L의 배치를 만드는 것이 좋습니다플레이트를 부어하는데 필요한 시간에 해당하는 기간 동안 액체 형태 edium. 부분적으로 막힌 팁을 사용하는 것을 피한다 매체와 마이크로 작성하는 동안 자주 팁을 변경. 둘째, 하나는 복제 사이에 형광 인공적인 변동성을 최소화해야합니다. 마이코 박테리아 microcolonies는 이러한 결핵균과 같은 병원성 마이코 박테리아에 대한 특히, 종종 비정상적으로 성장한다. 예를 들어, 한천 표면에 성장 microcolonies은 크기, 형상, 높이가 다를 수 있고, 또는 마이크로 웰의 내벽까지 연장 될 수있다. 하나의 문제는 현상 시약과 균일 모든 세균을 포함한다. 또 다른 장애물은 37 ° C에서 장기간 배양 한 후, CARA 마이크로의 고체 세균 매체가 개발 시약을 흡수에 건조하고 경향이 될 수 있다는 것이다. 활성탄은 결합 레사 주린 형광 7 급랭 수 있기 때문에 현상액 레사 주린 흡수 건조 우물 활성 charcoa 잘 – 투 – 웰 변동이있을 수있다리터 담금질 레사 주린 형광. 개발 시약은 동일하게 모든 마이코 박테리아 식민지를 도달하고, 레사 주린은 활성탄보다 안전하게 유지 – 사전 습윤 즉시 개발 시약을 추가하기 전에 PBS 모든 CARA 마이크로 웰의 표면은 이러한 문제를 모두 완화합니다. 카라는 식별하고, 또는 다른 세균 종에 대한 중간 처리량 약물 발견 분석에서 마이코 박테리아 돌연변이의 표현형의 특성에 응용 프로그램을 가질 수있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 원고 및 화학 지원 J. 데이비드 워렌 (웨일 코넬 의과 대학)가 CARA을 개발하는 동안의 전문가 검토 크리스틴 번즈 – 황에 감사하고 있습니다. 이 작품은 번역 상 약에있는 빌과 멜린다 게이츠 재단, 애비 하워드 P. 밀스타인 프로그램의 TB 약 가속기 프로그램 및 NIH TB 연구 장치 (U19 AI111143)에 의해 지원되었다. 미생물학 및 면역학의 부서는 윌리엄 랜돌프 허스트 재단이 지원됩니다. SSK는 NIH 보조금 K08AI108799에 의해 지원되었다.
Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
activated charcoal | Sigma | C5510 | |
PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
tween 80 | Sigma | P8074 | |
tyloxapol | Sigma | T8761 | |
sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
rifampicin | Sigma | R3501 | |
6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
resazurin powder | Sigma | R7017 | |
sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
14 mL Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
50 mL conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |