Protocol
HINWEIS: Für dieses Protokoll haben wir auf Testen Stromulus Frequenz in der Epidermis von N. fokussiert benthamiana verlässt. Mehrere stabile transgene Linien erzeugt worden , die für diesen Zweck verwendet werden können, einschließlich 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 und NRIP1: Cerulean 6. Beide Linien zeigen robuste Expression von Fluorophoren in den Chloroplasten Stroma der Blätter unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen. Alternativ Chloroplasten-bezogene Fluorophore transient in N. ausgedrückt werden kann benthamiana unter Verwendung von Agrobacterium - Transformationen 13. Dies ist weniger ideal als die transgenen Linien, da einige basalen Abwehrreaktionen in N. induzieren Agrobacterium Infiltrationen benthamiana und Wechselwirkungen mit Agrobacterium kann Stromulus Frequenz in dem Blatt 14, die möglicherweise zu verkomplizieren Interpretation der Ergebnisse zu ändern. Schließlich Stromulus Bildung in vitro zu visualisieren,Chloroplasten können aus jeder beliebigen Pflanzenspezies, entweder genetisch codierten Fluorophore oder einen fluoreszierenden Farbstoff extrahiert werden, wie in Kapitel 5 unten. 9,15
HINWEIS:. Detaillierte Beschreibung der Methoden für Pflanzenanbau wurden bereits beschrieben 16 Kurz gesagt, wachsen N. benthamiana Pflanzen in 4 "Töpfe mit jeder professionellen Bodenmischung gefüllt , die eine gute Drainage zur Verfügung stellt. Decken Sie Sämlinge mit einem durchsichtigen Kunststoff - Kuppel in den ersten 10 bis 14 Tage , um eine feuchte Umgebung für die Keimung zur Verfügung zu stellen. In jedem Standard - Dünger - Mix Anweisungen folgen Herstellers zu 14- Tage alten Pflanzen. wachsen Pflanzen unter weißem Licht, mit ~ 100 & mgr; mol Photonen m -2 s -1 Lichtintensität. Wasserpflanzen regelmäßig.
1. Vorbereiten Blattproben für Visualisierung
HINWEIS: Stromulus Dynamik durch Verwundung 8 betroffen, so sollten Gewebepräparation sofort durchgeführt werden , bevor Stromulus Visualisierungs durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Idealerweise sollte eine Probe mit 15 min nach Entnahme aus der Anlage visualisiert werden.
- Schneiden Sie einen kleinen Abschnitt des Blattes eine sehr scharfe Rasierklinge. Verwenden Sie immer den gleichen Bereich des Blattes für Konsistenz, und sicher sein, die gleiche Oberfläche (adaxial oder abaxial) in allen Versuchen zu visualisieren.
- Unmittelbar nach dem Blattschneidabschnitt, die Blattabschnitt in einem 5 ml nadellose Spritze mit Wasser gefüllt unterzutauchen Entfernen von Luft aus der Spritze und ein Vakuum anzuwenden, indem die Spritzenöffnung mit einem Finger abdecken und den Kolben zu ziehen.
- Lassen Sie den Kolben sanft zu vermeiden, dass die Blattabschnitt zu beschädigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- oder dreimal, oder bis die meisten der Luft entfernt worden ist und das Blatt erscheint tiefgrün sein.
Hinweis: Dieser Schritt Luft in dem Blatt entfernt, die genaue Visualisierung von stromules stören können.
- Lassen Sie den Kolben sanft zu vermeiden, dass die Blattabschnitt zu beschädigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- oder dreimal, oder bis die meisten der Luft entfernt worden ist und das Blatt erscheint tiefgrün sein.
- Fügen Sie einen Tropfen Wasser zu einer Folie und legen Sie den Blattabschnitt auf diesen Rückgang. Dann fügen Sie eine weitere drop Wasser an die Spitze des Blattes, und legen Sie eine Deckglas über das Blatt. Wenn es irgendwelche Luftblasen sind, vorsichtig das Deckglas klopfen, bis sie entfernt werden. Der Schlitten ist nun bereit für die Mikroskopie und sollten sofort sichtbar gemacht werden.
2. Visualizing Stromules mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie
- Mit durchgehendem Licht, konzentrieren sich auf ein Sichtfeld in der Nähe der Mitte des Blattes Abschnitt (weg von den durch die Rasierklinge geschädigte Zellen). Verwenden Sie ein 20x-Objektiv, so dass viele Chloroplasten gleichzeitig sichtbar gemacht werden kann. Speichern eines Bildes mit Durchlicht, so dass Zelltypen später unterschieden werden kann, falls erforderlich.
- Schalten Sie die Beleuchtungsquelle einen Laser mit geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern für das Fluorophor verwendet wird. Beispielsweise GFP mit einem 488 nm Laser erregt und Emissionen zwischen 500 nm und 525 nm erhalten.
- Mit Hilfe der Software des Mikroskops, wählen Sie die GFP-Kanal und klicken Sie auf die Lochblende auf 1 Ai einzustellenry Einheit. Wählen Sie Laserscanning, starten die Probe zu visualisieren, und klicken Sie dann auf das GFP-Kanal, um die Laserintensität einzustellen und die Detektorverstärkung der Laserleistung zu minimieren, während immer noch deutlich stromules zu visualisieren. Sobald diese Einstellungen festgelegt worden sind, halten sie so konsequent wie möglich in allen Experimenten.
- Bereiten Sie eine z -stack Experiment , das eine Reihe von Bildern durch die Blattepidermis im Sichtfeld sammeln.
- Für die z -stack, umfassen alle epidermalen Chloroplasten in dem Sichtfeld Verzerrungen zu vermeiden (zum Beispiel, wenn die Chloroplasten in der Nähe der Blattoberfläche mehr stromules unter Bedingungen getestet haben).
- Nehmen Bilder mit der maximalen Intervall möglich , dass alle stromules beinhalten wird , aber minimiert die Zeit für eine z -stack erforderlich. Wenn zum Beispiel 1 Airy Einheit entspricht einem fokussierten konfokalen Abschnitt, der 2 & mgr; m tief ist, um ein Bild nehmen alle 2 & mgr; m wahrscheinlich ideal ist.
HINWEIS: Das Blatt epidermis ist eine unebene Oberfläche, so dass die Gesamttiefe der z -stack auf der Probe abhängig variieren; die meisten z -stacks werden 10-20 Bilder erfordern, kann aber mehr beinhalten. - Passen Scangeschwindigkeit und Bildauflösung als notwendig , um sicherzustellen , dass die z -stack schnell gesammelt wird ( in der Regel innerhalb von 5-10 min, wenn möglich). Speichern Sie die z -stack für eine spätere Analyse.
3. Bildverarbeitung
- Bestimmen Sie Stromulus Frequenz unter Verwendung eines beliebigen Bildanalyse-Software. Für dieses Protokoll, empfehlen wir die Verwendung ImageJ, die von der National Institutes of Health öffentlich zugänglich ist (http://imagej.nih.gov/ij/) oder dem beliebten Upgrade von ImageJ, Fidschi (http://fiji.sc / Fidschi).
- Zusammenführen der z -stack in einem einzigen Bild die maximale Intensitätsprojektion in der Software.
- Identifizieren und von Hand alle Chloroplasten im Bild zu zählen.
- Für jede Chloroplasten bestimmen visuell, ob ein oder mehrere stromulessind zu sehen in der fusionierten z -stack Bild von den Chloroplasten erstreckt. Beispiele siehe Abbildung 1.
Hinweis: Da die biologischen Funktionen von stromules nicht bekannt sind, jede dünne, Stroma gefüllten, röhrenförmige Verlängerung aus dem Chloroplast kann ein "Stromulus" angesehen werden, unabhängig von der Länge. Als allgemeine Regel wird ein Stroma gefüllte Verlängerung von der Chloroplast ist ein Stromulus wenn es weniger als etwa 1 um im Durchmesser über den grßten Teil seiner Länge 7 ist. Stellen Sie sicher, dass eine Person alle Bilder Analysen zur subjektiven Unterschiede zur Kontrolle bei der Bestimmung, ob ein Chloroplasten ein Stromulus hat. Ein zweiter Forscher sollten die Stromulus Frequenzen unabhängig überprüfen zu weiteren subjektive Vorurteile reduzieren.
4. Experimentelles Design und Sampling
HINWEIS: Stromulus Frequenz ist sehr variabel zwischen Blättern, aber mehrere Berichte deuten darauf hin, daß es wenig Variation in Stromulus Frequenz innerhalb eines indiviDoppelblatt 9,17.
- Berechne die Blatt Stromulus Frequenz von einem einzigen Sichtfeld eines Blattes. Nehmen Sie das Blatt, und betrachten dies eine unabhängige Probe. Achten Sie nicht auf separaten Sichtfelder von einem Blatt als unabhängige Stichproben.
HINWEIS: Es gibt keinen Konsens darüber, wie man am besten messen Veränderungen in Stromulus Aktivität, und bis die Funktion von stromules mehr klar definiert, Forscher sollten weiterhin bei der Quantifizierung Stromulus Dynamik, kreativ zu sein. Zum Vergleich: in der Literatur sollten jedoch gemeinsame Standards für die Berichterstattung zusätzlich zu mehr kreative Ansätze verwendet werden. Bei einem Minimum, können immer die Frequenz von Chloroplasten, die eine oder mehrere stromules haben. - Bestimmen Sie die Häufigkeit der Chloroplasten, die stromules in einem Sichtfeld haben. Verwenden ImageJ um alle Chloroplasten identifizieren, in einem Sichtfeld. Dann wird für jede Chloroplasten, bestimmen, ob die Chloroplasten mindestens eine Stromulus gebildet hat. Bericht Stromulus Frequenz wie die Percentage von Chloroplasten mit einem Stromulus.
ANMERKUNG: Manche Forscher Transformations den Prozentsatz, beispielsweise mit dem Arcussinus-Transformation vor Stromulus Frequenzen Berichterstattung; Während dies eine Option für die statistische Analyse, ist die Arkussinus Stromulus Frequenz nicht ein intuitives Wert und muss nicht im Haupttext oder Zahlen einer Studie berichtet werden.- Als alternativer Ansatz, die Gesamtzahl der stromules zählen und teilen sie durch die Gesamtzahl der Chloroplasten.
HINWEIS: In den meisten Fällen diese ähnliche Ergebnisse liefern wird 4.2 zu nähern; es kann die Stromulus Frequenz, aber überschätzen, wenn ein einzelner Chloroplasten viele stromules gebildet hat. Im Beispiel unter repräsentativen Ergebnisse gezeigt, haben beispielsweise mehrere Chloroplasten zwei oder mehr stromules, die Anzahl der pro stromules Chloroplasten zu 40/87 Anhebung (im Vergleich zu einer Stromulus Frequenz von 33/87). - Alternativ bestimmen die Stromulus Länge anstelle von Stromulus Frequenz. Länge gemessen werdenin ImageJ durch die Stromulus mit dem freihändig Zeilen-Tool zu verfolgen.
HINWEIS: Da die biologische Rolle von stromules unbekannt bleibt, ist es nicht klar, dass Stromulus Länge ihrer Funktion beeinträchtigt. Bericht erhebliche Unterschiede in Stromulus Länge, wenn sie beobachtet werden, sondern auch die Stromulus Frequenzen aus (wie in 4.2 beschrieben).
HINWEIS: Stromulus Frequenz kann zwischen verschiedenen Blättern unter den gleichen Wachstumsbedingungen stark variieren. Daher wird, obwohl Stromulus frequenzbestimmendes kann sollten sorgfältig große Probengrößen enthalten ausgelegt werden zeitraubend, Experimente sein. Mit Datensätze aus unserem Labor haben wir festgestellt, dass eine Stichprobengröße von mindestens 16 Pflanzen für jede Behandlung in der Regel stark genug ist, um zu bestimmen, ob es einen statistisch signifikanten Unterschied von mindestens einem 1,5-fache Veränderung der Stromulus Frequenz zwischen zwei Zuständen ist (mit Standard α = 0,05 und β = 0,80).
- Als alternativer Ansatz, die Gesamtzahl der stromules zählen und teilen sie durch die Gesamtzahl der Chloroplasten.
- Die statistische Analyse der Ergebnisse.
- Zum Vergleich der mirein Stromulus Frequenzen von zwei Behandlungen, verwenden Sie die t - Test Welch (auch als heteroscedastic t - Test oder t - Test unter der Annahme , ungleiche Varianz bekannt).
HINWEIS: Dieser Test ist nicht so mächtig wie die t - Test herkömmlichen Student, aber Welch t - Test ist vorteilhaft , da sie nicht davon ausgehen , dass die Varianz in Stromulus Häufigkeitsverteilung zwischen den Behandlungen ähnlich ist.
HINWEIS: Da Stromulus Frequenz ein "Verhältnis", wird seine Stichprobenverteilung vorhergesagt binomischen zu sein, anstatt normal, die Skew statistische Analyse theoretisch könnte, wenn Probengrößen sehr niedrig sind oder wenn Stromulus Frequenz ist sehr gering (nahe 0%) oder sehr hoch (nahezu 100%). Einige Berichte haben verwendet Arkussinus Transformationen vor der statistischen Analyse, die dazu bestimmt ist binomialverteilt zu einer Normalverteilung zu transformieren und damit die Standardanforderungen eines Studenten-t - Test oder ANOVA erfüllen. In der Praxis wird jedoch einrcsine Transformationen haben wenig oder keine Wirkung auf die statistische Analyse, und werden daher nicht empfohlen. Stattdessen wiederholen Experimente Probengröße zu erhöhen, was die statistische Aussagekraft zu erhöhen und reduzieren Fehler bei der Interpretation der Daten. - Was auch immer statistischer Ansatz verwendet wird, sollten Sie sorgfältig zu berichten über die Strategie der Probenahme, Probengröße, statistischen Test, und p - Wert für jedes Experiment.
Hinweis: Wie bei anderen Bereichen der Biologie, einen p - Wert von weniger als 0,05 betrachtet werden kann "statistisch signifikant", obwohl Forscher sicherlich die genaue p - Wert erhalten berichten. Wenn p etwas über 0,05 ist, kann die Stichprobengröße mit zwei oder drei Versuchen zu erhöhen helfen , zu klären , ob der beobachtete Unterschied ist reproduzierbar und statistisch signifikant.
- Zum Vergleich der mirein Stromulus Frequenzen von zwei Behandlungen, verwenden Sie die t - Test Welch (auch als heteroscedastic t - Test oder t - Test unter der Annahme , ungleiche Varianz bekannt).
5. Extrahieren von Intact Chloroplasten Stromulus Dynamics zu visualisieren
HINWEIS: Mehrere Methodeneinem etwas anderes Protokoll zu isolieren Chloroplasten von Blättern verwendet werden, einschließlich in einer aktuellen Studie über Stromulus Bildung in vitro 15 wurden. Das Protokoll detailliert unten verwendet eine relativ einfache Methode , die nicht biochemisch reinen Chloroplasten Proben nicht fließt, sondern hat stattdessen eine große Menge an intakten, gesunden Chloroplasten 9,18 isolieren.
- Bereiten kalten Extraktionspuffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM Sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl 2 und 1,0 mM MnCl 2. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9 mit NaOH und HCl, und im Kühlschrank lagern vor dem Gebrauch.
HINWEIS: Obwohl es nicht notwendig, kalte Puffern und Proben auf Eis zu halten, wenn möglich, einen höheren Anteil an intakten Chloroplasten ergibt. - Bereiten Sie Isolationspuffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM Sorbit, 2 mM EDTA, 1,0 mM MnCl 2, 1,0 mM MgCl 2, 10 mM KCl und 1,0 mM NaCl. Der pH-Wert auf 7,6 mit NaOH und HCl und im Kühlschrank lagern vor dem Gebrauch.
- Wenn die Blätter sind nichteine genetisch kodierte Stromatumoren Fluorophore, bereiten Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) Lösung zum Ausdruck: 50 mM CFDA-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) (2,3 mg CFDA pro 1,0 ml DMSO).
HINWEIS: Die genaue Konzentration ist nicht kritisch. Halten Sie CFDA Lager im Dunkeln zu allen Zeiten. Speichern von kleinen Aliquots von 50 mM CFDA bei -20 ° C. - Zur Isolierung Chloroplasten, entfernen ~ 5-10 g Blätter von verschiedenen Pflanzen und spülen Sie kurz in kaltem Wasser. Ab sofort übertragen zu 50 ml kaltem Extraktionspuffer. Grind Blätter einen Mixer mit mehreren kurzen Impulsen. Man filtriert durch zwei oder drei Schichten Seihtuch Blattreste zu entfernen, unterteilen die extrahierte Chloroplasten in zwei 50 ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren für 1 min bei 750 x g.
- Überstand verwerfen und resuspendieren die grünen Chloroplasten in 10 ml Isolationspuffer. Zentrifuge erneut für 1 min bei 750 xg, Überstand verwerfen und Resuspension Chloroplasten in Isolationspuffer Endvolumen auf 5 ml zu bringen.
- Transfer 201; l der Chloroplasten zu einer Folie, Deckel mit einem Deckglas und beginnen Mikroskopie.
HINWEIS: Chloroplasten aus transgenen Pflanzen plastidenspezifische gezielte fluoreszierende Proteine exprimieren, sind nun bereit für die Visualisierung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie. - Stain Chloroplasten von Pflanzen, die nicht plastidenspezifische gezielte fluoreszierende Proteine exprimieren stromules zu visualisieren.
- In 5 ul 50 mM CFDA Lager zu den 5 ml in Isolationspuffer-Chloroplasten suspendiert. Bringen Sie die Endkonzentration auf 50 & mgr; M.
- Lassen Sie Chloroplasten für 5 min inkubiert und dann übertragen Sie eine kleine Teilmenge (~ 50 & mgr; l) zu einer Folie, Deckel mit einem Deckglas und beginnen Mikroskopie.
- Verwenden Sie ein FITC oder GFP-Filtersatz. Verwenden Sie ein 20X Ziel vieler Chloroplasten gleichzeitig sichtbar zu machen, oder ein höheres Ziel, einen einzelnen isolierten Chloroplasten zu visualisieren.
HINWEIS: CFDA innerhalb des Stroma von intakten Chloroplasten fluoresziert. - Wenn es eine starke Hintergrundfluoreszenz, waschen Sie die chloroplasts wieder in 10 ml Isolationspuffer nach der 5 min Inkubation mit CFDA, Zentrifuge für 1 min bei 750 · g, Überstand verwerfen und Resuspension in 5 ml Isolationspuffer.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde verwendet , Stromulus Frequenz am Tag sichtbar zu machen und in der Nacht in den Kotyledonen der jungen N. benthamiana Sämlinge. Scheiben von einem z- Stapel wurden in einem einzigen Bild (Abbildung 1A) verschmolzen. Zur visuellen Zwecken wurde das Bild dann entsättigt und invertiert , so daß Stroma erscheint schwarz (1B). Die Chloroplasten wurden beschriftet entweder als keine stromules mit (grüner Stern) oder mit mindestens einem Stromulus (Magenta Stern). Von den 87 epidermalen Chloroplasten sichtbar gemacht, haben 33 stromules. Somit ist die Frequenz in diesem Stromulus Blatt 37,9%.
Mit dieser Analyse wurde das Protokoll für weitere 21 Pflanzen wiederholt (ein Blatt pro Pflanze) während des Tages und insgesamt 24 Pflanzen in der Nacht. An dem Tag war der durchschnittliche Stromulus Frequenz 20,8 ± 1,8%; in der Nacht, war die durchschnittliche Stromulus Frequenz von 12,8 ± 0,9% (Abbildung2). Stromulus Frequenz war während des Tages deutlich höher, wie der t - Test bestimmt Welch (n ≥ 22, p <0,0005). Beachten Sie, dass , obwohl mehr als 23.000 Chloroplasten und mehrere hundert Zellen beobachtet wurden, die Stichprobengröße, n, wird als 22 berichtet, untersucht die Anzahl der unabhängigen Pflanzen.
Nach der Isolierung aus Blättern von N. Mit dem Protokoll hier beschriebenen Chloroplasten stromules wurden in vitro beobachtet benthamiana plastidenspezifische gezielte GFP (3A) exprimieren, oder nach CFDA mit Chloroplasten von N. isoliert zu färben benthamiana (3B) oder Spinacia oleracea (3C).
Abbildung 1. Quantifizieren Stromulus Frequenz in N. benthamiana Blätter. (A) A z -stack aus einem Teilsichtfeld der Epidermis von N. benthamiana exprimierenden Stromatumoren GFP wurde fusionierte alle epidermalen Chloroplasten und stromules in einem einzigen Bild zu zeigen. (B) Dieses Bild wurde umgewandelt in Schwarzweiß und für visuelle Zwecke invertiert. Chloroplasten mit stromules werden durch einen Magenta * gekennzeichnet; Chloroplasten ohne stromules sind mit einem grünen Sternchen gekennzeichnet. Maßstabsbalken repräsentieren 10 & mgr; m. Geändert von Brunkard et al. 9 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Vergleicht man Stromulus Frequenz über Bedingungen. Dieses Protokoll wurde verwendet , um die str zu bestimmenOmule Frequenz in 22 Anlagen in den Tag und 24 Pflanzen in der Nacht. Stromulus Frequenz war im Laufe des Tages deutlich höher als in der Nacht (Welch-t - Test, n ≥ 22, p <0,0005). Fehlerbalken zeigen Standardfehler. Geändert von Brunkard et al. 9 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Visualizing stromules nach intakten Chloroplasten aus den Blättern extrahiert wird . (A) Chloroplasten aus transgenen N. benthamiana Blätter ausgedrückt GFP (grün) auf den Chloroplasten gezielt wurden unter Verwendung der beschriebenen Protokolle hier isoliert. (B) Chloroplasten wurden aus Wildtyp N. isoliert benthamiana Blätter und gefärbt mit CFDA, die Fluoresces nur innerhalb intakten, lebensfähigen Chloroplasten (gelb dargestellt). (C) Chloroplasten können auch aus anderen Pflanzenarten, wie Spinat (S. oleracea) isoliert werden und dann mit CFDA (gelb) gefärbt. Chlorophyll ist die Autofluoreszenz in rot dargestellt. Geändert von Brunkard et al. 9
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Discussion
Wenn stromules untersuchen, drei wichtige Faktoren müssen in allen in Betracht gezogen werden: (i) Manipulation des Pflanzengewebes muss auf ein absolutes Minimum beschränkt werden, (ii) das experimentelle System muss konsistent gehalten werden, und (iii) Probenahmestrategien sorgfältig geplant werden müssen, um sicherzustellen, robust, sind reproduzierbare Daten analysiert.
Stromules sind bemerkenswert dynamisch: sie, bevor ein Beobachter die Augen unter dem Mikroskop schnell ein- und ausfahren kann. Zudem variiert Stromulus Frequenz signifikant in Reaktion auf eine Vielzahl von Behandlungen, einschließlich der Stimuli, die nicht vermieden werden kann, um stromules (wie Blatt Verwundung) visualisieren. Die primäre Lösung für dieses Problem, das mit den hier beschriebenen Protokolle adressiert wird, ist gut kontrollierte Experimente durchzuführen, wobei alle Variablen konsistent. Dazu gehören beispielsweise jede Probe zur Visualisierung Vorbereitung unmittelbar bevor es dem Mikroskop zu bringen; Pflanzen nicht beschädigt werden,bis unmittelbar vor Visualisierung. Die zweite Lösung für dieses Problem ist die Komplexität der Protokolle zu minimieren: Im Idealfall werden alle Behandlungen sollten ohne Entfernen des Blattes oder verursacht Schaden direkt auf die Pflanze aufgebracht werden.
Stromules wurden in einer verwirrenden Vielzahl von Arten und Zelltypen, einschließlich Weizenwurzelhaare, Tomatenfrüchten und etiolated Tabak Setzlinge 8,19 sucht. Diese Pionierarbeiten voran das Verständnis der Stromulus Dynamik der Pflanzenentwicklung und erforscht den Bereich der Stromulus Aktivität. Zeichnung Vergleiche von diesen verschiedenen experimentellen Systemen können jedoch zu Fehlinterpretationen führen, da verschiedene Arten von Plastiden in deutlich verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind.
Beispielsweise Chloroplasten machen stromules in Reaktion auf oxidativen Stress, der durch die photosynthetischen Elektronenkette verursacht, aber da Leukoplasten photo Maschinen fehlt, sind sie auf die nicht empfindlichgleiche Reize 9. Jede Versuchssystem verwendet werden stromules zu untersuchen, aber die Versuchssystem muss während der gesamten Studie konsistent gehalten werden, wenn irgendwelche Vergleiche gezogen werden. Faktoren zu berücksichtigen Spezies, Zelltyp, Entwicklungsstadium oder dem Alter der Pflanze und ein Verfahren zur Färbung stromules (entweder durch stabile Transgen-Expression, vorübergehende Transgen-Expression oder eine externe Fluorophore) umfassen; sogar leichte Variationen dieser Faktoren kann später die Interpretation der Ergebnisse durcheinander bringen.
Schließlich muss jede Studie von Stromulus Biologie eine robuste, zuverlässige Probenahmestrategie verwenden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse sind reproduzierbar und biologisch relevant. Sampling wiederholt aus einer einzigen Anlage, beispielsweise Aufnahme von Bildern aus verschiedenen Regionen eines Blattes, wird offenbar statistische Aussagekraft zu verbessern, kann aber irreführend sein. Wie oben in den repräsentativen Daten gezeigt, kann die Stromulus Frequenz eines einzelnen Blattes dramatisch von der mittleren Frequenz variieren Stromulusüber viele Blätter: in diesem Blatt, das während des Tages, 37,9% der Chloroplasten aus stromules, obwohl die mittlere Frequenz über Stromulus Blätter während des Tages fast die Hälfte, nur 20,8% betrug visualisiert wurde.
Darüber hinaus gegeben, wie wenig über Stromulus Dynamik zu diesem Zeitpunkt bekannt ist, sollte jeder Versuch völlig mindestens dreimal wiederholt werden, und wenn möglich, um sicherzustellen, dass unvorhergesehene Variablen für alle Änderungen in Stromulus Aktivität verantwortlich sind, die beobachtet werden. Vor allem, da nur die Stromulus Biologie Feld zu starten beginnt, sollten die Forscher sorgfältig dokumentieren und alle Aspekte des experimentellen Designs berichten, einschließlich kreative Abweichungen von dem einfachen Protokoll hier beschrieben.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
- Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
- Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
- Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
- Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926 (2012).
- Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
- Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
- Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
- Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
- Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
- Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
- Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
- Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
- Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
- Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).
- Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).
- Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
- Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).
- Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
- Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).
