Protocol
NOTA: Para este protocolo, se han centrado en el ensayo de la frecuencia stromule en la epidermis de N. deja benthamiana. Varias líneas transgénicas estables que se han generado que se puede utilizar para este propósito, incluyendo 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 y NRIP1: Cerulean 6. Ambas líneas muestran la expresión robusta de fluoróforos en el estroma del cloroplasto de hojas cultivadas en una amplia gama de condiciones. Alternativamente, fluoróforos cloroplasto orientada se pueden expresar de forma transitoria en N. benthamiana utilizando Agrobacterium Transformaciones 13. Esto es menos ideal que las líneas transgénicas, ya que las infiltraciones de Agrobacterium inducen unas respuestas de defensa basal en N. benthamiana y las interacciones con Agrobacterium pueden alterar la frecuencia stromule en la hoja 14, lo que podría complicar la interpretación de los resultados. Por último, para visualizar la formación de stromule in vitro,cloroplastos pueden ser extraídos de cualquier especie vegetal, ya sea utilizando fluoróforos genéticamente codificados o un colorante fluorescente, tal como se describe en la sección 5 a continuación. 9,15
NOTA:. Métodos detallados de cultivo de plantas se han descrito previamente 16 Brevemente, crecer N. benthamiana plantas en macetas de 4 "con cualquier mezcla de tierra profesional que ofrece un buen drenaje. Cubra plántulas con una cúpula de plástico transparente para los primeros 10-14 días para proporcionar un ambiente húmedo para la germinación. añadir cualquier mezcla de fertilizante estándar siguiendo las instrucciones del fabricante para 14- plantas días de edad. cultivar plantas bajo luz blanca, utilizando ~ 100 mmol fotones m-2 s-1 de intensidad de luz. Las plantas de agua con regularidad.
1. Preparación de muestras de hojas para la visualización
NOTA: la dinámica Stromule se ven afectados por hiriendo a 8, por lo que la preparación del tejido debe llevarse a cabo inmediatamente antes de visualizar stromules por microscopía de fluorescencia confocal. Idealmente, una muestra debe ser visualizado con 15 min después de la eliminación de la planta.
- Cortar una pequeña sección de la hoja usando una hoja de afeitar muy agudo. Utilice siempre la misma región de la hoja de coherencia, y estar seguro de visualizar la misma superficie (adaxial o abaxial) en todos los experimentos.
- Inmediatamente después de cortar la sección de hoja, sumergir la sección de hoja en un 5 ml jeringa sin aguja llena de agua, eliminar el aire de la jeringa, y aplicar un vacío al cubrir el orificio de la jeringa con un dedo y tirando del émbolo.
- Liberar el émbolo suavemente para evitar daños en la sección de la hoja. Repita esto dos o tres veces, o hasta que la mayor parte del aire se ha eliminado y la hoja parece ser de color verde oscuro.
NOTA: Este paso elimina el aire de la hoja que puede interferir con la visualización precisa de stromules.
- Liberar el émbolo suavemente para evitar daños en la sección de la hoja. Repita esto dos o tres veces, o hasta que la mayor parte del aire se ha eliminado y la hoja parece ser de color verde oscuro.
- Añadir una gota de agua a un portaobjetos y colocar la hoja en la sección de esta caída. A continuación, añadir otro drop de agua a la parte superior de la hoja, y colocar un cubreobjetos sobre la hoja. Si hay burbujas de aire, golpee suavemente la hoja de la cubierta hasta que se eliminan. El portaobjetos ahora está listo para la microscopía, y debe ser visualizado inmediatamente.
2. Visualizar Stromules con confocal de microscopía de fluorescencia
- Con luz transmitida, se centran en un campo de visión cerca del centro de la sección de la hoja (lejos de las células dañadas por la cuchilla de afeitar). Utilice un objetivo 20X de modo que muchos cloroplastos pueden ser visualizadas simultáneamente. Guardar una imagen con luz transmitida de modo que los tipos de células se pueden distinguir después, si es necesario.
- Cambiar la fuente de iluminación a un láser con filtros de excitación y emisión apropiados para ser usado fluoróforo. Por ejemplo, excitar GFP con un láser de 488 nm y recoger las emisiones entre 500 nm y 525 nm.
- El uso de software del microscopio, seleccionar el canal GFP y haga clic para ajustar la apertura del agujero de alfiler de 1 Airy unidad. Seleccionar escaneo láser, para iniciar la visualización de la muestra, y luego haga clic en el canal de GFP para ajustar la intensidad del láser y la ganancia del detector para minimizar la potencia del láser al mismo tiempo visualizar claramente stromules. Una vez que se han determinado estos valores, los mantenga lo más constante posible a lo largo de todos los experimentos.
- Preparar un experimento -stack z que recogerá una serie de imágenes a través de la epidermis de la hoja en el campo de visión.
- Para el -stack z, incluir todos los cloroplastos epidérmicas en el campo de visión para evitar el sesgo (por ejemplo, si los cloroplastos cerca de la superficie de las hojas tienen más stromules en condiciones ensayadas).
- Tomar imágenes en el intervalo máximo posible, que incluirá todos los stromules sino reducir al mínimo el tiempo necesario para que una -stack z. Por ejemplo, si 1 unidad de Airy es equivalente a una sección confocal de enfoque que es 2 m de profundidad, teniendo una imagen cada 2 micras es probable ideal.
NOTA: La hoja epidermis es una superficie irregular, por lo que la profundidad total de la z -stack variará dependiendo de la muestra; la mayoría de -stacks z requerirán 10-20 imágenes, pero pueden incluir más. - Ajustar la velocidad de exploración y la resolución de la imagen si es necesario para asegurarse de que el -stack z es recogida rápidamente (normalmente dentro de 5-10 minutos, si es posible). Guarde el -stack z para su posterior análisis.
Procesamiento 3. Imagen
- Determinar la frecuencia stromule usando cualquier software de análisis de imágenes. Para este protocolo, se recomienda utilizar ImageJ, que está disponible públicamente de los Institutos Nacionales de Salud (http://imagej.nih.gov/ij/), o la actualización popular de ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji).
- Combinar la -stack z en una sola imagen con la proyección de intensidad máxima en el software.
- Identificar y contar manualmente todos los cloroplastos en la imagen.
- Para cada cloroplasto, determinar visualmente si una o más stromulesson vistas que se extiende desde el cloroplasto en la imagen de la z fusionada -stack. Para ejemplos, véase la figura 1.
NOTA: Dado que no se conocen las funciones biológicas de stromules, ninguna, estroma llenas, extensión tubular delgada del cloroplasto puede ser considerado un "stromule", independientemente de la longitud. Como regla general, una extensión de estroma llenas desde el cloroplasto es un stromule si es menos de aproximadamente 1 m de diámetro a lo largo de la mayor parte de su longitud 7. Asegúrese de que una persona se analizan todas las imágenes para controlar las diferencias subjetivas en la determinación de si o no un cloroplasto tiene una stromule. Un segundo investigador debe verificar de forma independiente las frecuencias stromule para reducir aún más los sesgos subjetivos.
4. Diseño Experimental y Toma de Muestras
NOTA: Stromule frecuencia es muy variable entre las hojas, pero varios informes sugieren que hay poca variación en la frecuencia stromule dentro de un indivi9,17 hoja dual.
- Calcular la frecuencia hoja stromule de un solo campo de visión de una hoja. Desechar la hoja, y considerar esta una muestra independiente. No considere campos separados de vista de una hoja como muestras independientes.
NOTA: No hay un fuerte consenso sobre la forma de mejores miden los cambios en la actividad stromule, y hasta que la función de stromules se define más claramente, los investigadores deben seguir siendo creativa en la cuantificación de la dinámica stromule. Para la comparación a través de la literatura, sin embargo, las normas comunes de presentación de informes se deben utilizar, además de los enfoques más creativos. Como mínimo, siempre informar de la frecuencia de cloroplastos que tienen uno o más stromules. - Determinar la frecuencia de cloroplastos que tienen stromules en un campo de visión. Utilice ImageJ para identificar todos los cloroplastos en un campo de visión. Entonces, para cada cloroplasto, determinar si el cloroplasto se ha formado al menos un stromule. Informe de frecuencia stromule como el Percentage de los cloroplastos con una stromule.
NOTA: Algunos investigadores transforman el porcentaje, por ejemplo, con la transformación arcoseno, antes de informar de frecuencias stromule; mientras que esta es una opción para el análisis estadístico, el arco seno de la frecuencia stromule no es un valor intuitivo, y no necesita ser informado en el texto principal o cifras de un estudio.- Como un enfoque alternativo, contar el número total de stromules, y se divide por el número total de los cloroplastos.
NOTA: En circunstancias normales, esto va a producir resultados similares de acercarse a 4,2; puede sobreestimar la frecuencia stromule, sin embargo, si un solo cloroplasto ha formado muchos stromules. En el ejemplo mostrado en virtud de los resultados representativos, por ejemplo, varios cloroplastos tienen dos o más stromules, elevando el número de stromules por cloroplasto a 40/87 (en comparación con una frecuencia stromule de 33/87). - Como alternativa, determinar la longitud stromule lugar de la frecuencia stromule. La longitud se puede mediren ImageJ trazando el stromule con la herramienta de línea a mano alzada.
NOTA: Como el papel biológico de stromules sigue siendo desconocida, no está claro que la longitud stromule afecta a su función. Reportar diferencias significativas en la duración stromule si se observan, sino también informar de las frecuencias stromule (como se describe en el apartado 4.2).
NOTA: frecuencia Stromule puede ser muy variable entre diferentes hojas en las mismas condiciones de crecimiento. Por lo tanto, aunque la determinación de la frecuencia stromule puede llevar mucho tiempo, los experimentos deben ser cuidadosamente diseñadas para incluir muestras de gran tamaño. El uso de conjuntos de datos de nuestro laboratorio, se determinó que un tamaño de muestra de al menos 16 plantas para cada tratamiento es por lo general suficientemente potente para determinar si hay una diferencia estadísticamente significativa de al menos un cambio de 1,5 veces en la frecuencia stromule entre dos condiciones (con la norma α = 0,05 y β = 0,80).
- Como un enfoque alternativo, contar el número total de stromules, y se divide por el número total de los cloroplastos.
- El análisis estadístico de los resultados.
- Para comparar el youn stromule frecuencias de dos tratamientos, use la prueba t de Welch (también conocida como la prueba de la prueba t o t heterocedástico suponiendo una varianza desigual).
NOTA: Esta prueba no es tan poderoso como prueba de la t de Student convencional, pero la prueba t de Welch es ventajoso porque no asume que la variación en la distribución de frecuencias stromule es similar entre los tratamientos.
NOTA: Dado que la frecuencia stromule es una "proporción", su distribución muestral se prevé que sea binomial en lugar de lo normal, que podrían análisis estadístico teóricamente sesgo si los tamaños de las muestras son muy bajos o si la frecuencia stromule es muy bajo (cerca del 0%) o muy alta (cerca de 100%). Algunos informes han utilizado transformaciones arcoseno antes del análisis estadístico, que está destinado a transformar una distribución binomial a una distribución normal, y así satisfacer los requisitos de la norma de prueba de la t de Student o ANOVA. En la práctica, sin embargo, unarcsine transformaciones tienen poco o ningún efecto sobre el análisis estadístico, y por lo tanto no se recomiendan. En su lugar, repetir los experimentos para aumentar el tamaño de la muestra, lo que aumentará la potencia estadística y reducir los errores en la interpretación de los datos. - Cualquiera sea el enfoque estadístico se utiliza, asegúrese de informar cuidadosamente la estrategia de muestreo, tamaño de la muestra, prueba estadística, y el valor de p para cada experimento.
NOTA: Al igual que con otros campos de la biología, un valor de p inferior a 0,05 se puede considerar "estadísticamente significativa", aunque los investigadores deben informar sin duda el valor p obtenido precisa. Si p es ligeramente por encima de 0,05, el aumento de tamaño de la muestra con dos o tres experimentos puede ayudar a clarificar si o no la diferencia observada es reproducible y estadísticamente significativa.
- Para comparar el youn stromule frecuencias de dos tratamientos, use la prueba t de Welch (también conocida como la prueba de la prueba t o t heterocedástico suponiendo una varianza desigual).
5. La extracción de cloroplastos intactos para visualizar Stromule Dinámica
NOTA: Existen varios métodosse han utilizado para aislar los cloroplastos de las hojas, incluyendo un protocolo ligeramente diferente en un estudio reciente sobre la formación de stromule in vitro 15. El protocolo se detalla a continuación utiliza un método relativamente simple que no dió muestras cloroplasto bioquímicamente puros, pero en lugar aislar una gran cantidad de cloroplastos, sanos intactos 9,18.
- Preparar tampón de extracción frío: NaOH Hepes 50 mM, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, 1,0 mM MgCl 2, y MnCl 1,0 mM 2. Ajustar el pH a 6,9 con NaOH y HCl, y refrigerar antes de su uso.
NOTA: Aunque no es necesario, utilizando tampones fríos y conservación en hielo cuando sea posible dará lugar a una mayor proporción de cloroplastos intactos. - Preparar tampón de aislamiento: NaOH Hepes 50 mM, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, 1,0 mM MnCl 2, mM MgCl 2 mM, KCl 10, y 1,0 NaCl 1,0 mM. Ajustar el pH a 7,6 con NaOH y HCl y refrigerar antes de su uso.
- Si las hojas no sonexpresar un fluoróforo estromal codificado genéticamente, preparar diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) solución: CFDA 50 mM solución madre en dimetil sulfóxido (DMSO) (2,3 mg CFDA por 1,0 ml DMSO).
NOTA: La concentración exacta no es crítica. Mantenga CFDA de valores en la oscuridad en todo momento. Almacenar pequeñas alícuotas de CFDA 50 mM a -20 ° C. - Para el aislamiento de cloroplastos, retire ~ 5-10 g de hojas de varias plantas y enjuagar brevemente en agua fría. transferir inmediatamente a 50 ml de tampón de extracción en frío. Moler las hojas utilizando una licuadora con varios pulsos cortos. Filtrar a través de dos o tres capas de gasa para eliminar los desechos de la hoja, dividir los cloroplastos extraídos en dos tubos de 50 ml de centrífuga y centrifugar durante 1 min a 750 x g.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender los cloroplastos verdes en tampón de aislamiento 10 ml. Centrifugar de nuevo durante 1 min a 750 xg, desechar el sobrenadante, y los cloroplastos resuspender en tampón de aislamiento para llevar el volumen final a 5 ml.
- Transferencia 201; l de los cloroplastos a una diapositiva, cubrir con un cubreobjetos, y comenzar la microscopía.
NOTA: Los cloroplastos de las plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes plastid orientada ahora están listos para la visualización por microscopía de fluorescencia confocal. - Manchar los cloroplastos de las plantas que no están expresando proteínas fluorescentes plastid orientada para visualizar stromules.
- Añadir 5 l de 50 mM CFDA a los 5 ml cloroplastos a suspender en tampón de aislamiento. Llevar la concentración final a 50 mM.
- Permitir a los cloroplastos incubar durante 5 minutos, y luego transferir una pequeña alícuota (~ 50 l) a una diapositiva, cubren con un cubreobjetos, y comienzan microscopía.
- Use un filtro para FITC o GFP. Utilice un objetivo de 20X para visualizar muchos cloroplastos de forma simultánea, o un objetivo superior para visualizar un solo cloroplasto aislado.
NOTA: CFDA será fluorescente en el interior del estroma de los cloroplastos intactos. - Si hay una fuerte fluorescencia de fondo, lavar el Chloroplasts de nuevo en 10 ml de tampón de aislamiento después de la 5 min de incubación con CFDA, centrifugar durante 1 min a 750 xg, desechar el sobrenadante, y resuspender en 5 ml de tampón de aislamiento.
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Representative Results
Este protocolo se utiliza para visualizar la frecuencia stromule en el día y por la noche en los cotiledones de joven N. plántulas benthamiana. Rebanadas de una pila z se fusionaron en una sola imagen (Figura 1A). Para los propósitos visuales, que la imagen fue entonces desaturado y se invierte de manera que el estroma aparece en negro (Figura 1B). Los cloroplastos se marcaron o bien como no tener stromules (asterisco verde) o que tiene al menos un stromule (asterisco magenta). De los 87 cloroplastos epidérmicas visualizados, 33 tienen stromules. Por lo tanto, la frecuencia stromule en esta hoja es 37,9%.
El uso de este análisis, el protocolo se repitió durante otros 21 plantas (una hoja por planta) durante el día y un total de 24 plantas en la noche. En el día, la frecuencia media stromule fue 20,8 ± 1,8%; en la noche, la frecuencia media fue de 12,8 ± stromule 0,9% (Figura2). Frecuencia Stromule fue significativamente mayor durante el día, según lo determinado por la prueba t de Welch (n ≥ 22, p <0,0005). Tenga en cuenta que si bien se observaron más de 23.000 cloroplastos y varios cientos de células, el tamaño de la muestra, n, se reporta como 22, el número de plantas independientes examinó.
Utilizando el protocolo descrito aquí, no se observaron stromules cloroplasto in vitro tras el aislamiento a partir de hojas de N. benthamiana que expresan GFP plastid orientada (Figura 3A), o después de usar CFDA para teñir los cloroplastos aislados de N. benthamiana (Figura 3B) o Spinacia oleracea (Figura 3C).
Figura 1. Cuantificación de frecuencia stromule en N. benthhojas amiana. (A) A z -stack de un campo de vista parcial de la epidermis de N. benthamiana que expresan GFP estromal se fusionó para mostrar todos los cloroplastos epidérmicas y stromules en una sola imagen. (B) La imagen se convirtió en blanco y negro y se invierte para los propósitos visuales. Los cloroplastos con stromules se indican con un asterisco magenta; cloroplastos sin stromules se indican con un asterisco verde. Las barras de escala representan 10 micras. Modificado de Brunkard et al. 9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Comparación de la frecuencia stromule a través de condiciones. Se utilizó este protocolo para determinar el stromule frecuencia de 22 plantas en el día y 24 plantas por la noche. Stromule frecuencia fue significativamente mayor durante el día que durante la noche (prueba de la t de Welch, n ≥ 22, p <0,0005). Las barras de error indican el error estándar. Modificado de Brunkard et al. 9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Visualización stromules después de extraer los cloroplastos de las hojas intactas. (A) Los cloroplastos de N. transgénico benthamiana deja GFP expresada (verde) dirigida al cloroplasto se aislaron utilizando los protocolos descritos aquí. (B) Los cloroplastos se aislaron de tipo salvaje de N. benthamiana hojas y se tiñó con CFDA, que fluoresces sólo dentro de los cloroplastos intactos, viables (que se muestran en amarillo). (C) Los cloroplastos también se pueden aislar de otras especies de plantas, tales como la espinaca (S. oleracea) y, a continuación, se tiñeron con CFDA (amarillo). autofluorescencia la clorofila se muestra en rojo. Modificado de Brunkard et al. 9
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Discussion
Al investigar stromules, tres factores importantes deben ser considerados a lo largo de: (i) la manipulación del tejido de la planta deben mantenerse a un mínimo absoluto, (ii) el sistema experimental debe mantenerse constante, y (iii) las estrategias de muestreo debe ser planeada cuidadosamente para asegurar robusta, se analizan los datos reproducibles.
Stromules son muy dinámicas: se pueden extender y retraer rápidamente ante los ojos de un observador bajo el microscopio. Por otra parte, la frecuencia stromule varía significativamente en respuesta a una amplia gama de tratamientos, incluyendo estímulos que no se pueden evitar con el fin de visualizar stromules (tales como heridas hoja). La principal solución a este problema, que se dirige a los protocolos descritos aquí, es llevar a cabo experimentos bien controlados, manteniendo todas las variables consistente. Esto incluye, por ejemplo, la preparación de cada muestra para la visualización inmediatamente antes de llevarlo al microscopio; las plantas no deben ser dañadoshasta inmediatamente antes de su visualización. La segunda solución a este problema es reducir al mínimo la complejidad de los protocolos: idealmente, los tratamientos deben ser aplicados directamente a la planta sin la eliminación de la hoja o causar ningún daño.
Stromules se han estudiado en una increíble variedad de especies y tipos de células, incluyendo los pelos radiculares de trigo, frutos de tomate, y las plántulas de tabaco ahiladas 8,19. Estos estudios pioneros avanzaron la comprensión de la dinámica stromule durante el desarrollo de la planta y exploraron la gama de actividades stromule. Dibujo comparaciones de estos diversos sistemas experimentales, sin embargo, puede conducir a errores de interpretación, ya que diferentes tipos de plástidos están involucrados en considerablemente diferentes procesos biológicos.
Por ejemplo, los cloroplastos hacen stromules en respuesta al estrés oxidativo causado por la cadena fotosintética de electrones, pero desde leucoplastos carecen de la maquinaria fotosintética, que no son sensibles a la9 mismos estímulos. Cualquier sistema experimental se puede utilizar para investigar stromules, pero el sistema experimental se debe mantener constante durante todo el estudio si las comparaciones son para ser dibujado. Los factores a considerar incluyen la especie, tipo de célula, la etapa de desarrollo o edad de la planta, y el método de tinción stromules (ya sea a través de la expresión estable del transgén, la expresión transgénica transitoria, o un fluoróforo externo); incluso ligeras variaciones de estos factores pueden confundir la interpretación posterior de resultados.
Por último, cualquier estudio de la biología stromule debe utilizar un sistema robusto, fiable estrategia de muestreo para asegurar que los resultados son reproducibles y biológicamente relevante. El muestreo en varias ocasiones a partir de una sola planta, por ejemplo, tomando imágenes de varias regiones de una hoja, al parecer, va a mejorar la potencia estadística, pero puede ser engañoso. Como se muestra en los datos representativos por encima de, la frecuencia stromule de una sola hoja puede variar drásticamente de la frecuencia media stromulea través de muchas hojas: en que las hojas, que se visualiza durante el día, 37,9% de los cloroplastos hizo stromules, aunque la frecuencia stromule Medio en todos hojas durante el día fue casi la mitad que, sólo el 20,8%.
Por otra parte, teniendo en cuenta lo poco que se sabe acerca de la dinámica stromule en este momento, ningún experimento debe ser replicado por completo al menos tres veces, y más si es posible, para asegurar que las variables imprevistas no son responsables de cualquier cambio en la actividad stromule que se observan. Por encima de todo, ya que el campo de la biología stromule está empezando a despegar, los investigadores deben documentar detalladamente e informar de todos los aspectos del diseño experimental, incluyendo desviaciones creativas de lo simple protocolo descrito aquí.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
- Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
- Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
- Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
- Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926 (2012).
- Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
- Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
- Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
- Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
- Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
- Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
- Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
- Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
- Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
- Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).
- Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).
- Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
- Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).
- Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
- Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).
