Protocol
BEMÆRK: For denne protokol, har vi fokuseret på analyse stromule frekvens i epidermis af N. benthamiana blade. Adskillige stabile transgene linjer er blevet genereret, der kan anvendes til dette formål, herunder 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 og NRIP1: Cerulean 6. Begge disse linjer viser robust ekspression af fluoroforer i chloroplasten stroma af blade dyrket under en lang række betingelser. Alternativt kan chloroplast målrettet fluoroforer være forbigående udtrykt i N. benthamiana anvendelse af Agrobacterium Transformations 13. Dette er mindre ideel end de transgene linjer, da Agrobacterium infiltrationer fremkalde nogle basale forsvar reaktioner i N. benthamiana og interaktioner med Agrobacterium kan ændre stromule frekvens i bladet 14, potentielt komplicere fortolkning af resultaterne. Endelig, for at visualisere stromule dannelse in vitro,kloroplaster kan udvindes fra enhver planteart, enten ved hjælp af genetisk kodede fluorophorer eller et fluorescerende farvestof, som beskrevet i afsnit 5 nedenfor. 9,15
BEMÆRK:. Detaljerede metoder til planteavl er tidligere blevet beskrevet 16 Kort fortalt vokse N. benthamiana planter i 4 "potter fyldt med enhver professionel jord mix, der giver god dræning. Dæk frøplanter med en klar plast kuppel i de første 10-14 dage til at give et fugtigt miljø for spiring. Tilføj enhver standard gødning mix efter producentens anvisninger til 14- daggamle planter. Dyrk planter under hvidt lys, bruger ~ 100 pmol fotoner m -2 sek -1 lysintensitet. Vandplanter regelmæssigt.
1. Forberedelse Leaf Prøver til visualisering
BEMÆRK: Stromule dynamik påvirkes af sårede otte, så forberedelse væv bør gennemføres umiddelbart før visualisere stromules ved konfokal fluorescensmikroskopi. Ideelt set bør en prøve visualiseret med 15 min efter fjernelse fra anlægget.
- Skær en lille del af bladet ved hjælp af en meget skarp barberblad. Brug altid den samme region af bladet for konsistens, og være sikker på at visualisere den samme overflade (adaxial eller abaxial) i alle forsøg.
- Umiddelbart efter opskæring sektion bladet, nedsænkes afsnittet blad i en 5 ml nålløs sprøjte fyldt med vand, fjerne luft fra sprøjten, og anvende et vakuum ved at dække sprøjtens åbning med en finger og trække stemplet.
- Slip stemplet forsigtigt for at undgå at beskadige afsnittet bladet. Gentag dette to eller tre gange, eller indtil det meste af luften er blevet fjernet, og bladet synes at være dyb grøn.
BEMÆRK: Dette trin fjerner luft i bladet, der kan forstyrre nøjagtig visualisering af stromules.
- Slip stemplet forsigtigt for at undgå at beskadige afsnittet bladet. Gentag dette to eller tre gange, eller indtil det meste af luften er blevet fjernet, og bladet synes at være dyb grøn.
- Tilføj en dråbe vand til et dias og placere afsnittet blad på dette fald. Derefter tilføje en anden drop af vand til toppen af bladet, og placere et dækglas over bladet. Hvis der er nogen luftbobler, forsigtigt trykke dækglasset indtil de fjernes. Objektglasset er nu parat til mikroskopi og skal visualiseres straks.
2. Visualisering Stromules med Konfokal Fluorescens mikroskopi
- Med transmitteret lys, fokusere på et synsfelt nær centrum af afsnittet med blad (væk fra cellerne beskadiget af barberbladet). Brug en 20X objektiv så mange chloroplaster kan visualiseres samtidigt. Gem et billede med transmitteret lys, så celletyper kan skelnes senere, hvis det er nødvendigt.
- Skift belysning kilde til en laser med passende excitation og emission filtre til at blive brugt fluoroforen. For eksempel, ophidse GFP med en 488 nm laser og indsamle emissioner mellem 500 nm og 525 nm.
- Brug af mikroskopet software, skal du vælge GFP kanal og klik for at justere pinhole blænden til en Airy enhed. Vælg laserscanning, at begynde at visualisere prøven, og klik derefter på GFP-kanal til at justere laser intensitet og detektoren gevinst at minimere laser strøm, mens stadig klart visualisere stromules. Når disse indstillinger er fastlagt, holde dem så konsekvent som muligt i alle eksperimenter.
- Forbered en z -stack eksperiment, der vil indsamle en serie af billeder gennem bladet epidermis i synsfeltet.
- For z -stack, inkluderer alle epidermale chloroplaster i synsfeltet for at undgå bias (for eksempel hvis chloroplaster nær bladoverfladen har flere stromules under testede betingelser).
- Tag billeder på den maksimale interval muligt, vil omfatte alle stromules men minimere den tid, der kræves for en z -stack. For eksempel, hvis en Airy som svarende til en in-focus konfokal sektion, der er 2 um dyb, optagelse af et billede hver 2 um sandsynligvis ideal.
BEMÆRK: Bladet epidermis er en ujævn overflade, så den totale dybde z -stack vil variere afhængigt af prøven; de fleste z -stacks vil kræve 10-20 billeder, men kan indeholde mere. - Juster scanning hastighed og billedopløsning som nødvendigt for at sikre, at z -stack indsamles hurtigt (typisk inden for 5-10 min, hvis det er muligt). Gem z -stack til senere analyse.
3. Billedbehandling
- Bestem stromule hyppighed et billede analyse software. Til denne protokol, anbefaler vi at bruge ImageJ, som er offentligt tilgængelige fra National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), eller den populære opgradering af ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji).
- Flet z -stack til et enkelt billede med den maksimale intensitet projektion i softwaren.
- Identificere og manuelt tælle alle chloroplaster i billedet.
- For hver kloroplast, visuelt afgøre, om en eller flere stromulesses der strækker sig fra chloroplast i det fusionerede z -stack image. For eksempler, se figur 1.
BEMÆRK: Da de biologiske funktioner af stromules ikke er kendte, kan enhver tynd, stroma-fyldt, rørformet forlængelse fra chloroplasten betragtes som en "stromule", uanset længden. Som en generel regel, en stroma-fyldt fremspring fra chloroplasten er en stromule hvis det er mindre end ca. 1 um i diameter langs det meste af sin længde 7. Sørg for, at én person analyserer alle billeder til at kontrollere for subjektive forskelle i afgørelsen af, om en chloroplast har en stromule. En anden forsker, bør selv kontrollere stromule frekvenser for yderligere at reducere subjektive fordomme.
4. Eksperimentel Design og Sampling
BEMÆRK: Stromule frekvens varierer meget mellem bladene, men flere rapporter antyder, at der er lille variation i stromule frekvens inden for et enkelte kdobbelt blad 9,17.
- Beregn blad stromule frekvensen fra en enkelt synsfelt på det ene blad. Kassér bladet, og overveje dette en selvstændig prøve. Må ikke overveje særskilte synsfelter fra en blad som uafhængige stikprøver.
BEMÆRK: Der er ikke bred enighed om, hvordan man bedst måle ændringer i stromule aktivitet, og indtil funktionen af stromules er mere klart defineret, bør forskerne fortsat være kreative i at kvantificere stromule dynamik. Til sammenligning på tværs af litteraturen, men fælles standarder for rapportering bør anvendes som supplement til mere kreative tilgange. Som et minimum altid meddelelse frekvensen af chloroplaster, der har en eller flere stromules. - Bestemme frekvensen af chloroplaster, der har stromules i et synsfelt. Brug ImageJ at identificere alle kloroplaster i et synsfelt. Så for hver kloroplast afgøre, om disse chloroplast har dannet mindst én stromule. Anmeld stromule frekvens som Percentage af chloroplaster med en stromule.
BEMÆRK: Nogle forskere omdanne den procentdel, for eksempel med arcsinus transformation, før rapportering stromule frekvenser; mens dette er en mulighed for statistisk analyse, arc sinus af stromule frekvens er ikke en intuitiv værdi, og behøver ikke at blive rapporteret i hovedteksten eller figurer af en undersøgelse.- Som en alternativ tilgang, tælle det samlede antal stromules, og dividere det med det samlede antal af kloroplaster.
BEMÆRK: I de fleste tilfælde vil dette give lignende resultater at nærme 4.2; Det kan overvurdere stromule frekvens, men hvis en enkelt chloroplast har dannet mange stromules. I den viste under repræsentative resultater eksempel for eksempel flere chloroplaster har to eller flere stromules, øge antallet af stromules pr chloroplast til 40/87 (versus en stromule frekvens på 33/87). - Alternativt, fastlægge stromule længde i stedet for stromule frekvens. Længde kan målesi ImageJ ved at spore stromule med frihånd linje værktøj.
BEMÆRK: Da den biologiske rolle stromules fortsat ukendt, er det ikke klart, at stromule længde påvirker deres funktion. Rapporter betydelige forskelle i stromule længde, hvis de observeres, men også indberette stromule frekvenser (som beskrevet i 4.2).
BEMÆRK: Stromule frekvens kan være meget variabel mellem forskellige blade under de samme vækstbetingelser. Så selv bestemme stromule frekvens kan være tidskrævende, eksperimenter bør nøje designet til at omfatte store stikprøvestørrelser. Brug datasæt fra vores laboratorium, vi konstateret, at en stikprøve på mindst 16 planter til hver behandling er normalt tilstrækkelig stærk til at afgøre, om der er en statistisk signifikant forskel på mindst en 1,5-gange ændring i stromule frekvens mellem to betingelser (med standard α = 0,05 og β = 0,80).
- Som en alternativ tilgang, tælle det samlede antal stromules, og dividere det med det samlede antal af kloroplaster.
- Statistisk analyse af resultaterne.
- At sammenligne migen stromule frekvenser af to behandlinger, bruge Welch t-test (også kendt som den heteroscedastic t test eller t-test under forudsætning af ulige varians).
BEMÆRK: Denne test er ikke så kraftig som den konventionelle Students t-test, men Welch t-test er fordelagtig, fordi den ikke antage, at variansen i stromule frekvens fordeling er ens mellem behandlingerne.
BEMÆRK: Da stromule frekvens er en "del", er dens fordeling sampling forudsiges at være binomial snarere end normalt, hvilket kunne teoretisk skew statistisk analyse, hvis stikprøvestørrelserne er meget lav, eller hvis stromule frekvens er meget lav (tæt på 0%) eller meget høj (næsten 100%). Nogle rapporter har brugt arcsin transformationer inden statistisk analyse, som har til formål at omdanne en binomialfordeling til en normal fordeling, og dermed opfylde de almindelige krav til en Students t-test eller ANOVA. I praksis er der imidlertid enrcsine transformationer har ringe eller ingen effekt på statistisk analyse, og er derfor ikke anbefales. I stedet gentage eksperimenter for at øge stikprøvestørrelsen, hvilket vil øge statistisk styrke og reducere fejl i fortolkningen af data. - Uanset statistisk metode der anvendes, skal du omhyggeligt rapportere strategi prøvetagning, stikprøvestørrelse, statistisk test, og p-værdi for hvert forsøg.
BEMÆRK: Som med andre inden for biologi, kan en p-værdi mindre end 0,05 anses for "statistisk signifikant", selv om forskerne helt sikkert bør indberette den præcise p-værdi opnået. Hvis p er lidt over 0,05, hvilket øger antallet af stikprøver med to eller tre forsøg kan bidrage til at afklare, om den observerede forskel er reproducerbar og statistisk signifikant.
- At sammenligne migen stromule frekvenser af to behandlinger, bruge Welch t-test (også kendt som den heteroscedastic t test eller t-test under forudsætning af ulige varians).
5. Udpakning Intakte Chloroplaster at Visualiser Stromule Dynamics
BEMÆRK: Flere metoderer blevet anvendt til at isolere chloroplaster fra blade, herunder en lidt anden protokol i en nylig undersøgelse af stromule dannelse in vitro 15. Protokollen beskrevet nedenfor anvender en relativt enkel metode, der ikke giver biokemisk rene chloroplast prøver, men som i stedet isolere en stor mængde af intakte, sunde chloroplaster 9,18.
- Forbered kold ekstraktion buffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl2 og 1,0 mM MnCI2. PH justeres til 6,9 med NaOH og HCI, og opbevares i køleskab før brug.
BEMÆRK: Skønt det ikke er nødvendigt, ved hjælp af kolde buffere og holde prøver på is når det er muligt, vil give en højere andel af intakte chloroplaster. - Forbered isolation buffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MnCI2, 1,0 mM MgCl2, 10 mM KCI og 1,0 mM NaCl. PH justeres til 7,6 med NaOH og HCI og opbevares i køleskab før brug.
- Hvis bladene er ikkeudtrykker et genetisk kodet stromal fluorofor, forberede carboxyfluorescein-diacetat (CFDA) opløsning: 50 mM CFDA stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) (2,3 mg CFDA pr 1,0 ml DMSO).
BEMÆRK: Den nøjagtige koncentration er ikke kritisk. Hold CFDA lager i mørke på alle tidspunkter. Opbevar små portioner af 50 mM CFDA ved -20 ° C. - For at isolere kloroplaster, fjern ~ 5-10 g blade fra flere planter og kortvarigt skyl i koldt vand. straks anbringes i 50 ml kold ekstraktionspuffer. Grind blade under anvendelse af en blender med flere korte pulser. Filtreres gennem to eller tre lag osteklæde for at fjerne blade debris, opdele de ekstraherede chloroplaster i to 50 ml centrifugerør, og centrifugeres i 1 min ved 750 x g.
- Supernatanten fjernes, og resuspender grønne kloroplaster i 10 ml isolation buffer. Centrifuger igen i 1 min ved 750 x g, kasseres supernatanten, og resuspender chloroplaster i isolation buffer for at bringe slutvolumenet til 5 ml.
- Overførsel 201 l af kloroplaster til et dias, dække med et dækglas, og begynde mikroskopi.
BEMÆRK: Chloroplaster fra transgene planter, der udtrykker plastid-målrettede fluorescerende proteiner er nu klar til visualisering ved konfokal fluorescensmikroskopi. - Farv grønkorn fra planter, der ikke udtrykker plastid målrettet fluorescerende proteiner til at visualisere stromules.
- Tilsæt 5 pi 50 mM CFDA lager til de 5 ml kloroplaster-suspenderet i isolation buffer. Bring slutkoncentrationen til 50 uM.
- Tillad kloroplaster at inkubere i 5 min, og derefter overføre en lille portion (~ 50 pi) til et dias, dække med et dækglas, og begynde mikroskopi.
- Brug en FITC eller GFP filtersæt. Brug en 20X målsætning at visualisere mange chloroplaster samtidigt, eller en højere målsætning at visualisere et enkelt isoleret chloroplast.
BEMÆRK: CFDA vil fluorescere inde i stroma af intakte chloroplaster. - Hvis der er stærk baggrund fluorescens, vaske chloroplasts igen i 10 ml isolation puffer efter 5 minutters inkubation med CFDA, centrifugeres i 1 minut ved 750 xg, kasseres supernatanten, og resuspender i 5 ml isolation puffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol blev anvendt til at visualisere stromule frekvens på dag og nat i kimbladene af unge N. benthamiana udplantningsplanter. Skiver fra en z-stak blev lagt sammen til et enkelt billede (figur 1A). For visuelle formål, at billedet var derefter desaturerede og omvendt, så stroma er sort (figur 1B). Kloroplaster blev mærket for enten at have nogen stromules (grøn asterisk) eller har mindst en stromule (magenta asterisk). Af de 87 epidermale chloroplaster visualiseret, 33 har stromules. Således stromule frekvens i denne blad er 37,9%.
Ved hjælp af denne analyse blev protokollen gentaget i yderligere 21 anlæg (én blad per plante) i løbet af dagen og i alt 24 planter på natten. I dag, den gennemsnitlige stromule frekvens var 20,8 ± 1,8%; om natten, den gennemsnitlige stromule frekvens var 12,8 ± 0,9% (figur2). Stromule frekvens var signifikant højere i løbet af dagen, som fastsat af Welch t-test (n ≥ 22, p <0,0005). Bemærk, at selv om over 23.000 kloroplaster og flere hundrede celler blev observeret, stikprøvestørrelsen, n, rapporteres som 22, antallet af uafhængige planter undersøgt.
Under anvendelse af protokollen beskrevet her, blev chloroplast stromules observeret in vitro efter isolering fra blade af N. benthamiana udtrykker plastid målrettet GFP (figur 3A), eller efter brug af CFDA at farve chloroplaster isoleret fra N. benthamiana (figur 3B) eller Spinacia oleracea (figur 3C).
Figur 1. Kvantificering stromule frekvens i N. Benthamiana blade. (A) A z -stack fra en delvis synsfelt af epidermis N. benthamiana udtrykker stromale GFP blev fusioneret for at vise alle epidermale kloroplaster og stromules i et enkelt billede. (B) Dette billede blev konverteret til sort-hvid og omvendt for visuel formål. Chloroplaster med stromules er angivet med en magenta asterisk; chloroplaster uden stromules er angivet med en grøn asterisk. Scale søjler repræsenterer 10 um. Modificeret fra Brunkard et al. 9 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sammenligning stromule frekvens tværs betingelser. Denne protokol blev anvendt til at bestemme stromule frekvens i 22 anlæg i dag og 24 planter på natten. Stromule frekvens var signifikant højere i løbet af dagen end om natten (Welch t-test, n ≥ 22, p <0,0005). Fejlsøjler indikerer standardafvigelser. Modificeret fra Brunkard et al. 9 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Visualisering stromules efter udvinding intakte chloroplaster fra bladene. (A) Chloroplaster fra transgene N. benthamiana leaves udtrykt GFP (grønt) målrettet til chloroplasten blev isoleret under anvendelse af de protokoller, der beskrives her. (B) Chloroplaster blev isoleret fra vildtype N. benthamiana blade og farvet med CFDA, som fluoresces kun inde intakte, levedygtige chloroplaster (vist med gult). (C) Chloroplaster kan også isoleres fra andre plantearter, såsom spinat (S. oleracea), og derefter farvet med CFDA (gul). Klorofyl autofluorescens er vist med rødt. Modificeret fra Brunkard et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved undersøgelse stromules, skal tre vigtige faktorer tages i betragtning i hele: (i) manipulation af plantevævet skal holdes på et absolut minimum, (ii) det eksperimentelle system skal holdes konsekvent, og (iii) stikprøvestrategier skal nøje planlagt sikre robust, analyseres reproducerbare data.
Stromules er bemærkelsesværdigt dynamisk: de kan udvide og trække hurtigt, før en observatør øjne under lup. Desuden stromule frekvens varierer betydeligt i afhængighed af en lang række behandlinger, herunder stimuli, der ikke kan undgås for at visualisere stromules (såsom blad sårdannelse). Den primære løsning på dette problem, som er rettet med de protokoller, der er beskrevet her, er at udføre velkontrollerede forsøg, at holde alle variabler konsekvent. Dette omfatter for eksempel fremstilling hver prøve til visualisering umiddelbart før at bringe det til mikroskopet; planter skal ikke blive beskadigetumiddelbart før visualisering. Den anden løsning på dette problem er at minimere kompleksiteten af protokoller: ideelt set bør enhver form for behandling påføres direkte til planten uden at fjerne bladet eller forårsage nogen skade.
Stromules er blevet undersøgt i en svimlende vifte af arter og celletyper, herunder rod hår hvede, tomat frugter og etiolerede tobak kimplanter 8,19. Disse banebrydende undersøgelser avancerede forståelsen af stromule dynamik under plante udvikling og udforskede rækken af stromule aktivitet. Drage sammenligninger fra disse forskellige forsøgssystemer imidlertid kan føre til fejlfortolkninger, da forskellige typer af plastider er involveret i betydeligt forskellige biologiske processer.
For eksempel chloroplaster gøre stromules som reaktion på oxidativ stress forårsaget af den fotosyntetiske elektron kæden, men da leucoplasts mangler fotosyntetiske maskiner, er de ikke følsomme over forsamme stimuli 9. Ethvert eksperimentelt system kan anvendes til at undersøge stromules, men det eksperimentelle system skal holdes konsekvent i hele undersøgelsen, hvis der skal drages nogen sammenligninger. Faktorer at overveje omfatte arter, celletype, udviklingstrin eller alder af planten, og metode til farvning stromules (enten gennem stabil transgen ekspression, forbigående transgen ekspression, eller en ekstern fluorophor); selv små variationer af disse faktorer kan forvirre senere fortolkning af resultater.
Endelig skal enhver undersøgelse af stromule biologi bruge en robust, pålidelig prøvetagning strategi for at sikre, at resultaterne er reproducerbare og biologisk relevant. Sampling gentagne gange fra en enkelt plante, fx at tage billeder fra flere regioner i det ene blad, vil tilsyneladende forbedre statistisk styrke, men kan være misvisende. Som vist i de repræsentative ovenstående data kan stromule hyppigheden af et enkelt blad variere drastisk fra den gennemsnitlige stromule frekvenspå tværs af mange blade: i dette blad, som blev visualiseret under dag, 37,9% af chloroplaster fremstillet stromules, selvom den gennemsnitlige stromule frekvens tværs blade under dag var næsten halvdelen, kun 20,8%.
I betragtning af, hvor lidt er kendt om stromule dynamik på dette tidspunkt, bør enhver eksperiment fuldstændigt gentaget mindst tre gange, og mere, hvis det er muligt, for at sikre, at uforudsete variable er ikke ansvarlige for eventuelle ændringer i stromule aktivitet, der observeres. Frem for alt andet, da stromule biologi felt er lige begyndt at tage ud, forskere bør omhyggeligt dokumentere og rapportere alle aspekter af forsøgets udformning, herunder kreative afvigelser fra den simple protokollen beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| NaOH | Fischer-Scientific | S320-1 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| EDTA | Fischer-Biotech | BP121 | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss Inc | Model: LSM710 | |
| Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) | Sigma-Aldrich | 21879 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | EMD | MX1458-6 | |
| Waring blender | Waring | Model: 31BL92 | |
| Fiji | fiji.sc | Open-source software for analyzing biological images |
References
- Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
- Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).
- Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata. Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).
- Nomura, H., et al. Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis. Nat. Commun. 3, 926 (2012).
- Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).
- Caplan, J. L., et al. Chloroplast stromules runction during innate immunity. Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).
- Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function. Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).
- Gray, J. C., et al. Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid. Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).
- Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).
- Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants. Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).
- Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis. Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).
- Chiang, Y. -H., et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis. Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).
- Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics. Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).
- Erickson, J. L., et al. Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays. BMC Plant Biol. 14 (1), 127 (2014).
- Ho, J., Theg, S. M. The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana. PLoS One. 11 (2), e0146489 (2016).
- Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. Method. Mol. Biol. , 185-198 (2015).
- Schattat, M. H., Klösgen, R. B. Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11, 115 (2011).
- Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. Method. Mol. Biol. 684, 321-325 (2011).
- Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell. Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).
