Introduction
In den letzten Jahrzehnten haben die Imaging-Technologien die Art und Weise revolutioniert, die Ärzte diagnostizieren und Überwachung von Krankheiten. Diese bildgebenden Verfahren, wurden jedoch weitgehend auf Ganzkörperbildgebungssysteme, wie Positronenemissionstomographie (PET), Single-Photon-Emissions-Computertomographie (SPECT), Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRI). Besondere Aufmerksamkeit wurde auf Krebs bezahlt und technologischen Durchbrüche haben Bildgebung stark die Art und Weise verbessert, dass diese Krankheit diagnostiziert und behandelt wird. Trotz dieser Fortschritte gibt es einen Ort, an dem diese Imaging-Technologien einfach nicht passen: der OP. Während Ganzkörperbildgebungstechniken in der chirurgischen Planung helfen können, fehlt ihnen typischerweise räumliche Auflösungen hoch genug Ärzte in Echtzeit , um festzustellen , ob alle Tumorgewebe entfernt wurde oder Gewebe Resttumor bleibt bei den operativen Margen 1 versteckt. Stellt sicher, dass keine infiltrativenTumorränder hinter ist links eine der wichtigsten operativen Ziele und Chirurgen müssen einen Drahtseilakt zwischen strengen und vorsichtigen Gewebsresektion gehen. Wenn zu viel entfernt wird, sind unerwünschte Nebenwirkungen für den Patienten verstärkt; wenn zu wenig entfernt wird, werden die Rezidivrate 2 erhöht, 3. Daher ist es entscheidend, eine genaue Tumorränder zu beschreiben, und wir glauben, dass chemolumineszierende intraoperative Bildgebung kann helfen, die Genauigkeit der Identifikation von Tumorgrenzen zu verbessern, indem Chirurgen sichtbar zu machen bösartigem Gewebe zu helfen, die sonst unentdeckt mit etablierten Techniken bleiben könnte.
Es gibt viele Imaging-Technologien derzeit für eine mögliche Verwendung als intraoperativen Bildgebungssysteme untersucht. Dazu gehören β- und γ-Strahlung emittierenden Sonden 4, optische Fluoreszenz 5, Raman - Spektroskopie 6 >, 7 und Cherenkov Lumineszenz 8, 9. Bis heute jedoch keine von diesen als klinische Standardtools etabliert geworden. Optische Fluoreszenz-Bildgebung hat sich bisher die vielversprechendsten dieser Techniken zu sein und ist deshalb die erforscht. Während es bereits ein wertvolles Werkzeug für viele Anwendungen gezeigt worden ist, ist es nicht ohne Einschränkungen. Tatsächlich ist ihr Hauptnachteil der Hintergrundfluoreszenz von Natur aus autofluoreszenten biologischem Gewebe erzeugt. Dieser Hintergrund autofluoreszierenden Signal ist ein Produkt der Anregung von dem umgebenden Gewebe, zusätzlich zu dem Fluorophor, von der externen Lichtquelle zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals erforderlich ist. Aus praktischer Sicht kann diese Autofluoreszenz führen möglicherweise zu niedrigen Signal-zu-Rausch-Verhältnisse, die die Nützlichkeit dieser Technologie im Operationsraum begrenzen.
Der DirektorVorteil der Chemilumineszenz-Bildgebung über Fluoreszenz-Bildgebung ist, dass kein Anregungslicht notwendig ist. Als Ergebnis gibt es keine Hintergrundautofluoreszenz. In Chemilumineszenz Bebilderung wird die Anregungsenergie chemisch statt erzeugt. Dieses Verfahren erzeugt keine unbeabsichtigte Signaluntergrund und somit zu höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis führen kann. Dies könnte dazu führen letztlich in die genauere und präzise Erkennung von operativen Margen. Etwas überraschend hat sich der Nutzen dieses Ansatzes als intraoperativen Bildgebungstechnik unerforscht 10 geblieben. Tatsächlich ist das nächste Beispiel dieser Technik die Oxidation von Luminol durch Myeloperoxidase in Mäusen , 11, 12, 13. Chemilumineszenter biomedizinischen Bildgebung ist daher ein ziemlich unerforschtes Gebiet der Forschung, die folgende Vorteile bieten könnte: (1) minimale Autofluoreszenz, was zu einem niedrigen Hintergrundsignal mit hallogher Signal-zu-Rausch-Verhältnisse; (2) abstimmbaren Wellenlängen des chemolumineszenten Emissionen im Bereich vom sichtbaren bis zum nahen Infrarot; und (3) funktionalisierbarer chemolumineszenten Komplexe , die, wenn sie mit Linker - Technologien kombiniert und Biomoleküle gezielt , die bereits existieren, 14 Zugriff auf ganze Bibliotheken von gezielten molekularen Bildgebung Sonden liefern.
Diese Proof-of-Principle-Studie zeigt die potentielle Nützlichkeit von Chemilumineszenz-Bildgebung in der biomedizinischen Einstellung eines Ruthenium-basierte Bildgebungsmittel verwendet wird. Die chemolumineszenten Eigenschaften dieser Verbindung sind gut untersucht, mit Untersuchungen aus der Zeit der Mitte der 1960er Jahre 15. Bei chemischer Aktivierung erzeugt das Mittel Licht bei etwa 600 nm 16, die für medizinische Abbildungszwecke gut geeignet ist. Die Aktivierungsenergie wird durch eine Redox - Reaktion zur Verfügung gestellt , die in einen angeregten Zustand-was dazu führt , eine Lebensdauer von 650 ns in Wasser 17 -foll hatdurch die Erzeugung von Photonen bei Entspannung der angeregten Zustand zu verdanken. Durch die Verwendung eines speziell gestalteten Fern Vernebler, konnten wir die Verbindung , die sowohl ex vivo und in vivo zu detektieren. Die Ergebnisse der anfänglichen Experimente sind sehr vielversprechend, was auf eine weitere Untersuchung dieser Technologie.
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Protocol
Ethik - Erklärung: Alle in vivo Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) ausgeführt beschrieben.
1. Aufbau eines Vernebelungsgerät
- Bringen Holzteil A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) aufrecht im Zentrum von Teil B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) mit zwei Schrauben (4 x 25 mm 2). Befestigen Holzteil C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) in der Mitte des Teils A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) mit einer Schraube, so dass ein Teil C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) noch bewegt werden. Siehe Abbildung 1.
- Bohren Sie zwei Löcher durch die untere Spitze der Sprühflasche Auslöser einer Kunststoff 3 Unzen Mini Sprayer (D), und drücken Sie eine Edelstahlstange (10 cm von 1/16 "Stahl) (E) durch zwei Schleifen zu bilden, eine auf entweder Seite des Auslösers. Wickeln Sie den unteren Teil der Sprühflasche mit Klebeband (F) die Kabelbinder ein Abrutschen zu verhindern. Bringen Sie die Sprühflasche Holzteil C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) unter Verwendung der beiden Kunststoff - Kabelbinder (28 cm) (G).
- Schneiden Sie das 011-Servomotor (I) aus, und schließen Sie sie mit den losen Kabel der Servosteuerung (H). Befestigen Sie dann den Servomotor an die Spitze der Holzteil A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) unter Verwendung von Klebeband.
- Bringen Sie einen Bleistift (J) an den Servomotorhebel mit der Büroklammer (K). Dicht verbinden mit Klebeband die äußersten Teile des Stiftes an den Stahlstab Schleifen Kunststoff abgedeckt Twist Drähte (L) und befestigen Sie die Enden auf dem Bleistift.
- Schneiden Sie die Servomotor-Steuereinheit des Magnetkabelstecker (M) und bringen Sie ihn an die Lautsprecherkabel (N) ab. Dann kleben Sie das Servomotor - Steuereinheit zu Holzteil B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Schneiden Sie ein w1 Kabel mit Magnet Anschlüsse in zwei Hälften und heften sich an das lose Ende des Kupfer s ein Teilpeaker Kabel (1 m). Schließen Sie den (magnetisch) i2 Kippschalter und p1 Leistung der zur Verfügung stehenden w1 Kabel und einer 9V-Batterie.
2. Empfindlichkeit Bestimmung der Methode
- In einem 1,5 - Mikrozentrifugenröhrchen ml, werden die Lösungen von [Ru (bpy) 3] Cl 2 bei der Umkehrosmose Wasser (100 & mgr; l) in Mengen von 260 & mgr; g (347 nmol), 52 & mgr; g (69 nmol), 26 & mgr; g (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 & mgr; g (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), und 3 ng (3,5 pmol).
- Mischungs 100 ul jeder [Ru (bpy) 3] Cl 2 Lösung mit 100 ul einer wässrigen Lösung von Ammonium - Cernitrat ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) in Wasser (25 mM) auf einem Mikroskop - Objektträger.
- Stellen Sie den Erwerb in der Biolumineszenz Leser, indem Sie die Imaging - Software zu initialisieren.
- Melden Sie sich in das Benutzerprofil in und suchen die acquisition Bedienfeld. Klicken Sie auf "Initialisieren" und warten, bis das Gerät bereit ist.
- Suchen Sie nach "Imaging-Modus" und stellen Sie sicher, "Luminescent" und "Photograph" werden überprüft und, dass "Fluorescent" nicht markiert ist.
- Ändern "Belichtungszeit" Einstellung für "Luminescent" bis 20 s. Legen Sie die übrigen Einstellungen für "Luminescent" wie folgt: "Binning": Medium; "F / Stop": 1; und "Emission Filter": Open.
HINWEIS: Die Belichtungszeiten benötigen nach der Instrumentierung und experimentellen Einstellung angepasst werden, verwendet werden, falls abweichend von der dargestellten Einrichtung. - Für "Photograph", verwenden Sie die folgenden Einstellungen: "Belichtungszeit": Auto; "Binning": Medium; und "F / Stop": 8. Stellen Sie den "Betreff Höhe" gemäß Abbildung target.Look für das "Field of View" Dropdown-Menü. Die Grundeinstellung ist "C" Wechseln Sie zu "B" (14 cm Abstand zwischen der cAmera und Probentisch).
- Stellen Sie den Vernebler, indem Sie einen Objektträger auf einem Blatt aus schwarzem Tonpapier auf dem Boden der Imaging - Kammer platziert es aus dem Oxidationsmittel zu schützen. Mischen Sie einen 100 μLdroplet von [Ru (bpy) 3] Cl 2 -Lösung mit 100 & mgr; l einer wässrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Beobachten Sie das grüne Feld Fadenkreuz.
- Legen Sie die abzubildenden Objekt auf dem schwarzen Tonpapier, so dass der Bereich von Interesse ist in der Mitte des grünen Fadenkreuz-Licht-Box angezeigt auf der Probenbühne. Bereiten Sie den Vernebler durch die Kunststoff-Sprühflasche aus dem Holzbock lösen. Füllen Sie eine Lösung von Triethylamin (1: 3 in Wasser / Ethanol) in seine Kunststoffbehälter und bringen es auf den Holzbock.
- Setzen Sie den Vernebler in der Biolumineszenz Leser und stellen Sie sicher, dass das Netzkabel aus dem Vernebler Kabel ist nicht angeschlossen. Stellen Sie sicher, dass der Netzschaltereingeschaltet ist, ist der Kippschalter ausgeschaltet und die rote LED leuchtet Setzen Sie den Vernebler, so dass der Spritzstrom wird auf den Bereich von Interesse auf dem Imaging-Objekt gerichtet, während die Sicht nach Behinderung von der Kamera auf das Motiv Bildgebung zu minimieren durch die Sprühdüse Kopf.
- Legen Sie kleine, schwarze Stücke Tonpapier über eventuelle Hot - Spots (zB weiße Flecken auf mikroskopische Dias oder Injektionsstellen) , um sie vor Spritzwasser zu schützen. Legen Sie mindestens 40 cm des Zerstäubers Remote-Kabel innerhalb der Imaging-Kammer, so dass es nicht mit dem abzubildenden Objekt, dem Vernebler oder die magnetische Türverriegelung nicht stört. Schließen Sie das Abbildungssystem Tür.
HINWEIS: Das Fadenkreuz wird Größe ändern auf der Grundlage der "Field of View" Einstellung in "Bild Wohnen"; stellen Sie sicher, dass diese auf "B" gesetzt.
- ein Bild erwerben, indem Sie die Bildsequenz zu initiieren. Klicken Sie auf "Erwerben" im "Acquisition Systemsteuerung". Auf der ersten Bildgebungs sequrenz, ermöglichen automatisches Speichern, wenn ein Datenordner gewünscht (empfohlen) und wählen. Ignorieren Sie die "Edit Imaging Labels" Dialog bis zum Ende der Sequenz.
HINWEIS: Die Steuerungssoftware zeigt das Gerät die Aktionen Schritt-für-Schritt in Echtzeit. Nach der Messung der Vorbereitung und der Probentisch in die rechte Position bewegt, öffnet er den Kameraverschluß und zählt die Messzeit. Die Verschlussöffnung kann auch durch ein Klickgeräusch von der Maschine erzeugten hören. - Da der Verschluss öffnet, Spray drei Ausbrüche von einer Lösung von Triethylamin (1: 3 in Wasser / Ethanol, 0,24 ± 0,04 ml pro Burst-Spray) durch den Kippschalter dreimal Schalt Chemilumineszenz zu erzeugen.
HINWEIS: Die Probenbühne während der Messung bewegt. Lassen Sie genug (mindestens 40 cm) Kabel im Inneren des Gerätes, dies zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung durch den Vernebler versprüht werden kann durch das Steigrohr angestrebt werden, und dass es keine Luftblasen in das Rohr. Haben mehrere Ersatz batteries für den Zerstäuber bereit, falls erforderlich.
3. In - vivo - Bildgebung nach systemischer intravenöser Injektion
- In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Herstellung von 100 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Lösung zwischen 8 und 33 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 enthält. Bereiten einer wäßrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in Wasser (25 mM) zur gleichen Zeit.
- Intravenös injizieren 100 ul [Ru (bpy) 3] Cl 2 in die Schwanzvene von gesunden Mäusen (n = 5).
- Euthanize die Mäuse 10 min nach der Injektion über CO 2 Erstickung.
- Entfernen Sie die Haut mit einem Y-Schnitt aus dem Rumpf, entfernen Sie dann den Rippenbogen in einer U-Form das Herz und die Lungen zu belichten. Perfundieren die Mäuse durch einen Auslass in dem rechten Vorhof Schneiden und Injizieren 20 ml PBS durch eine 24 Gauge - Nadel in den linken Ventrikel 18. Vorsichtig durch den Bauch geschnittenHaut und der Niere und der Leber aus. Schneiden in Längsrichtung durch die Organe einen sichtbaren Schnitt zu erstellen.
- Stellen Sie den Erwerb wie in Schritten von 2,3 bis 2,6, mit den folgenden Änderungen beschrieben.
- Nach gründlichem den Vernebler Kunststoffbehälter Waschen, füllen Sie es mit einer Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in Wasser (25 mM) anstelle von Triethylamin.
HINWEIS: Es ist wichtig , um gründlich die Verneblerdüse nach jedem Gebrauch gründlich, da kristallisieren (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 kann die Sprühdüse nach mehreren Verwendungen zerstören.
- Nach gründlichem den Vernebler Kunststoffbehälter Waschen, füllen Sie es mit einer Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in Wasser (25 mM) anstelle von Triethylamin.
- Verwenden Sie die ganze Tier oder Organproben für die Bildgebung.
- Für ganze Bauch Bildgebung, positionieren Sie die Maus Karkasse mit dem offenen Bauch die Kamera und den Kopf nach auf der Rückseite des Geräts zeigt. Das Organ Center abgebildet (zB Leber oder Niere) im grünen Licht - Box Fadenkreuz werden.
- Foder einzelne Organ Bildgebung und Quantifizierung, entfernen Sie die Maus aus dem Abbildungsinstrument und stecken Sie es nach unten. Ausgehend von dem bereits geöffneten Körperhöhle, auszuschneiden die inneren Organe (zB Niere, Leber, Lunge, Muskel, Milz, Gehirn und Herz). Schnitt durch das Hinterbein Haut Muskelgewebe auszuschneiden. Öffnen Sie vorsichtig den Schädel mit einem Skalpell das Gehirn auszuschneiden.
- Wenn das interessierende Organ Leber, Niere oder Milz, schneiden alle Organe in der Hälfte der Länge nach, legen jedes Organ auf einer Petrischale oder ein Stück schwarzes Tonpapier.
- Befolgen Sie die Anweisungen in den Schritten 2,3-2,6 um die relative Emission des chemolumineszenten Tracer für die einzelnen Organe herzustellen.
4. In - vivo - Imaging von Lymphknoten
- Herstellung von 10 & mgr; l einer PBS - Lösung , enthaltend 80 nMol [Ru (bpy) 3] Cl 2. Bereiten einer wäßrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) zur gleichen Zeit.
- Injizieren Sie 10 ul der Lösung subdermally in die Hinterpfote von gesunden Mäusen (n = 5). Als Negativkontrolle, injizieren die kontralaterale Pfote mit 10 & mgr; l reinem PBS. Opfern , um die Mäuse über CO 2 Ersticken 15 Minuten nach der Injektion. Entfernen Sie die Haut an beiden Hinterbeinen, die Lymphe Kanäle zu belichten bis in die Kniekehlen-Lymphknoten.
- Stellen Sie den Erwerb wie in Schritt 3.4 beschrieben.
- Entfernen Sie die poplitealen Lymphknoten von beiden Hinterbeinen, schneiden sie in zwei Hälften, und sprühen sie mit Oxidationsmittel auf einer Petrischale, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.5.3), zum Zwecke der Quantifizierung.
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Representative Results
Der Vernebler in Protokoll Abschnitt 1 kann aus leicht erhältlichen Materialien zu geringen Kosten konstruiert werden. Es ist beabsichtigt , der Reduktions- / Oxidationsmittel in einem Biolumineszenz - Lesegerät (1) ein Einsatz für Fern ausgelöst werden Aufsprühen. Unser Design ermöglicht den sicheren Betrieb des Zerstäubers innerhalb des Biolumineszenz-Lesegerät bei einem 14 cm Abstand von der Linse. Kein Beschlagen oder Verschwimmen der Linse wurde während der Operation beobachtet. Wir wählten das im Handel erhältliche chemilumineszierende Mittel [Ru (bpy) 3] Cl 2 für die Entwicklung unserer Methode basiert auf seinen niedrigen Preis, Stabilität in wässriger Lösung, gut beschriebene Redox - Verhalten und chemolumineszenten Eigenschaften (Abbildung 2) 19. Der minimal detektierbare Signal kann in Protokollabschnitt 2 durch Oxidieren eines Tropfens [Ru (bpy) 3] Cl 2 (100 & mgr; l, 6,9 pmol- 34 beschrieben , bestimmt werden ,7 nmol in H 2 O) mit (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 (100 & mgr; l, 25 mM) auf einem Mikroskop - Objektträger. Dann wird durch den Zerstäuber und Aufsprühen einer Lösung von Triethylamin (1: 3 in Wasser / Ethanol) wird das chemilumineszente Signal ausgelöst. In unserem Fall wurde die minimal detektierbare Signal ermittelt 6,9 pmol / cm 2 (Figur 3) sein. Es ist denkbar, aber, dass die Reaktionsbedingungen optimiert, Kameraempfindlichkeit, Belichtungszeiten, Volumina und Reagenzienkonzentrationen auf noch niedrigere Nachweisgrenzen führen könnten. Diese Reaktionsbedingungen können auch für die Erforschung und Erprobung der Chemilumineszenz eines beliebigen Kombination von Metallkomplexen, Oxidationsmittel und Reduktionsmittel verwendet werden.
Der Umzug in die in - vivo - Experimente in Protokoll Abschnitte 3 und 4 wurden weibliche Akt (Auszucht) Mäuse 5-6 Wochen alt und NU / J männlichen Mäusen 6-8 Wochen alt verwendet. Für die intravenöse Injektionen, beträgt der8-33 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 in 100 & mgr; l PBS pro - Maus (n = 5) wurden ausgewählt. Die Tiere wurden 10 min nach der Injektion getötet und die Bauchhöhle ausgesetzt war. Die Mäuse wurden in der Biolumineszenz - Leser mit dem Vernebler zeigt auf das Gewebe von Interesse (Abbildung 4) gelegt. Für die Bildgebung mit intravenös injizierten [Ru (bpy) 3] Cl 2 wurde das chemilumineszente Signal vorwiegend in der Niere detektiert, stark renale Elimination des hydrophilen kleinen Moleküls (Figur 5) hindeutet. Signal-zu-Rausch - Verhältnisse für Mäuse injiziert [Ru (bpy) 3] Cl 2 im Vergleich zu PBS waren 27/1 für die Niere und 21/1 für die Leber. Für Lymphknotenbildgebung, 80 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 in 10 & mgr; l PBS wurden subkutan in die hinteren Fußballen von Mäusen injiziert (n = 5). Die Mäuse wurden 15 Minuten nach der Injektion von CO 2 Ersticken getötet. Die Haut, die sowohl die innere Hinterbeine was entfernt, um die Muskeln, Lymphknoten und Lymphgefäße zu belichten. Anschließende chemilumineszierende Visualisierung der poplitealen Lymphknoten zur Beobachtung geführt , die Lymphknoten , die [Ru (bpy) 3] 2+ zeigen eine 10 ± 4,3-fach höheren Leuchtkraft als unbehandelten (167.000 p / (s × cm 2 · sr) , und 17.000 p / (s × cm 2 · sr), p <0,028) (Figur 6).
Abbildung 1: Foto des Vernebler. Verwendete Teile: Holzstrukturteile (A, B, C), Sprühflasche (D), gebogenen Stahlstange (E), Klebeband (F), Kunststoff-Kabelbinder (G), 011 Servoanschlussteil (H), Servomotor (I), Bleistift ( J) durch gebogene Büroklammer (K gehalten), überdachte Kunststoffdraht Bindebänder (L) w1 Draht-Anschluss (M) und Lautsprecherkabel (N) an der Batterie führt. Diese Zahl basiert auf Forschung ursprünglich in ref veröffentlichtrenz 19. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Eigenschaften von [Ru (bpy) 3] 2+. Struktur (A) und die Anregungs- und Emissionsspektren (B) von [Ru (bpy) 3] 2+. Die Oxidations- / Reduktions - basierten chemolumineszenten Katalysezyklus (C). Diese Zahl beruht auf Forschung , die ursprünglich in Bezug veröffentlicht am 19.. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Nachweisgrenze von [Ru (bpy) 3] 2+. Repräsentative Signalintensitäten bei unterschiedlichen Konzentrationen von [Ru (bpy) 3] 2+ auf einen Objektträger (A). Imaging Signal Quantifizierung mit Detektionsschwelle (rot gestrichelte Linie) und Hintergrund (schwarz gestrichelte Linie) (B). Diese Zahl beruht auf Forschung , die ursprünglich in Bezug veröffentlicht am 19.. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Chemilumineszenz Imaging. Schematische Darstellung einer Maus und einem Vernebler in die Biolumineszenz reader positioniert (A g>) und eine schematische Zeichnung (B) des Zerstäubers auf einer Maus Aufsprühen. Diese Zahl beruht auf Forschung , die ursprünglich in Bezug veröffentlicht am 19.. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5: Nachweis von [Ru (bpy) 3] 2+ nach systemischer Verabreichung. Weißes Licht, Chemilumineszenz und Overlay (von links nach rechts). Bilder einer Maus Körperhöhle , die mit 33 nmol [Ru (bpy) 3] 2+ und versprüht mit (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 injiziert wurde. Der weiße Pfeil zeigt in Richtung der rechten Niere. Diese Zahl beruht auf Forschung , die ursprünglich in Bezug veröffentlicht am 19..ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Nachweis von [Ru (bpy) 3] 2+ nach Subdermal Verwaltung. Popliteal Lymphknoten Bildgebung weißes Licht, Chemilumineszenz und Composite - Bilder für Mäuse injiziert mit [Ru (bpy) 3] 2+ (oben) und PBS (unten) in den hinteren Gliedmaßen zeigt; 80 nmol in 10 ul PBS, abzubildenden 15 min nach der Injektion (A). Weißes Licht und zusammengesetzte Bilder für [Ru (bpy) 3] 2+ (oben) und PBS (unten) -behandelten Popliteallymphknoten (B) ausgeschnitten. Quantifizierung der Chemilumineszenz - Signale für PBS und [Ru (bpy) 3] 2+ -behandelten Lymphknoten (C) .Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD. Diese Zahl basiert auf Forschung ursprünglichveröffentlicht inreference 19. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier haben wir eine Technik vorgestellt, die optisch der Lage ist, durch einen chemolumineszierenden Reporter erstellt Gewebe über die Emission von Photonen abzugrenzen. Im Gegensatz zu anderen, etabliert, Technologien 4, 5, 6, 7, 8, 9, dieses chemilumineszierende Reportersystem verwendet eine Abbildungssonde , die nicht-radioaktiv ist und erleichtert den Nachweis bei sehr hohen Empfindlichkeitspegel. Vielleicht noch wichtiger ist , dass Chemilumineszenz - Bildgebung nicht einen einfallenden Lichtquelle erfordern (wie in der optischen Fluoreszenzbildgebung) 20, eine Eigenschaft , die Autofluoreszenz und drastisch reduziert Hintergrundsignale minimiert.
Der Ruthenium reporter [Ru (bpy) 3] Cl 2 weist eine in vivo Toxizität erträglich für Abbildungszwecke (intraperitoneal Maus LD 50: 20 mg / kg) 21, ist wasserlöslich (bis zu 8 mm) und ist in den Blutkreislauf stabil. Die physikochemischen Eigenschaften des Metallkomplexes sind gut charakterisiert und bereits für die photodynamische Therapie von Krebs 22, 23 untersucht worden. Das Oxidationsmittel (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 wurde berichtet, eine sehr geringe Toxizität aufweisen (oral Ratte LD 50: 1600-3200 mg / kg) 24 und in Wasser löslich ist in Konzentrationen von bis bei 20 bis 2,57 m ° C 25. In diesem Artikel wird eine visuelle Demonstration sowie textbasierte Führung für den Bau eines fernbetätigten Vernebelungsvorrichtung vorgestellt. Darüber hinaus bieten wir robuste Protokolle für die Chemilumineszenz-Bildgebung in einem Standard-Biolumineszenz-Bildgebung Gerät durchführen. Wir veranschaulichen die Verwendung von [Ru (bpy) 3] Cl 2 für die visualizatiauf der Gewebe nach intravenöser und subdermaler Injektionen bei Mäusen.
Jedoch, wie bei jedem anderen naszierenden Bildgebungstechnologie, gibt es Raum für Verbesserung unserer Protokolle. Wir glauben, dass dieser Proof-of-Principle-Studie die Entwicklung von mehreren Chemilumineszenzanwendungen für lebende Systeme antreiben könnte. Die folgenden Punkte könnten angesprochen werden, die Technologie weiter zu verbessern und ihren Umfang erweitern.
Eine kleinere zweite Generation von Ferne ausgelöst Sprühvorrichtungen erlauben würde, die Probe auf die Kamera näher zu sein, damit die räumliche Auflösung zu verbessern. Verbesserte optische Geräte könnten weiter die Nachweisgrenzen des Verfahrens zu verbessern. Das Protokoll könnte auch lebende Tiere Abbilden erweitert werden. Exakte Steuerung des Drehmoments (von Strom und Spannung) würde eine genauere Steuerung des Volumens des Reagens mit jedem Spritz freigesetzt ermöglichen. Es ist wichtig, den Vernebler zu halten gut gepflegt werden. Nicht Spülen des Zerstäubers zerstören kann die nozzle. Eine neue Batterie ist von entscheidender Bedeutung für die ordnungsgemäße Erfüllung des Zerstäubers. Jedoch alle Materialien für Vernebler verwendet werden, sind kostengünstig und leicht im Handel erhältlich. Folgenden etablierten Syntheseprotokolle die [Ru (bpy) 3] 2+ Komplex kann leicht mit verschiedenen Linkern modifiziert werden, einschließlich Maleimiden 26, Amine 27 und NHS - Ester 28, 29. Dies würde es ermöglichen Biokonjugation für kleine Moleküle, Peptide oder Antikörper, und würden somit spezifische erleichtern molekulare Targeting 30, 31, 32, 33. Letztendlich könnten gezielte Sonde Lieferung Chirurgen ermöglichen, kleine Läsionen zu identifizieren und genau mit sehr hoher Spezifität operativen Margen im OP beschreiben. Auch ist die Verkapselung des stark wasserlöslichen [Ru (bpy) 3] 2+ in Nanomaterialien sowohl gezielte und ungezielte-kann für die Visualisierung von Läsionen auch ermöglichen , während sie chirurgisch sind 34, 35, 36 entfernt werden. Schließlich Modifizierung der Koordinationssphäre des Metallkomplex - Reporter und / oder Ändern der Übergang selbst Metallzentrum attraktive Routen darstellen zu modulieren und die Feinabstimmung der Emissionswellenlängen im sichtbaren und NIR - Bereich 37, 38.
Intraoperative Bildgebung Chemilumineszenz braucht eine chemilumineszierende Reporter und, in unserem Fall ein Oxidationsmittel, das nur innerhalb der Grenzen ihrer Toxizität und Löslichkeit verwendet werden können. Gewebemembranen kann eine Barriere für die Diffusion des Oxidationsmittels in das Gewebe darstellen und daher die Signalerzeugung. Da die chemolumineszierende Reporter nur ein Photon pro Zyklus zu erzeugen, ist das erzeugte Signal eher schwach.Das Umgebungslicht in den Operationssaal werden daher von Eingabe der Kamera verhindert werden müssen, während die Technik, die in Gebrauch ist. Dies führt möglicherweise dazu, ICI besonders interessant für die Entwicklung der laparoskopischen Anwendungen, bei denen das Umgebungslicht natürlich ausgeschlossen.
Wir hoffen, dass diese Methode zu einem wertvollen Werkzeug für Chirurgen im Operationssaal drehen kann. Die Abwesenheit von Radioaktivität ist vorteilhaft für den Patienten und Operationsteam gleich und macht weniger Sicherheitsvorkehrungen erforderlich, die möglicherweise diese Technik zu einer attraktiveren Alternative macht.
Der reibungslose Betrieb des Zerstäubers und seine Positionierung eine entscheidende Rolle spielen gute Ergebnisse zu erzielen. Suboptimale Winkeln und Flächen beitragen kann Varianz zu signalisieren. Das Steuerkabel muss durch die Tür mit Vorsicht eingesetzt werden, und genug Kabel hat im Inneren des Biolumineszenz-Leser zu bleiben, so dass es nicht beengt oder abgerissen ist.
Letztlich chemilumineszenz Bildgebung ist ein äußerst attraktives neues Konzept für die molekulare Bildgebung. Es basiert auf einer Grundlage von gut etablierten Chemie verwendet preiswerte und leicht verfügbare Materialien und vermeidet sowohl Strahlung und Anregungslichtquellen. Als Ergebnis sind wir beide hoffnungsvoll und zuversichtlich, dass in der Zukunft, Chemilumineszenz-Bildgebung eine tiefe Wirkung auf die chirurgische Behandlung von Krankheiten haben könnte.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4 × 25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3 oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 - 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
References
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