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Biology

जी प्रोटीन चयनात्मक GPCR रचना एक जीवित कोशिका सस्पेंशन fluorometer परख में झल्लाहट सेंसर का उपयोग करके मापा

Published: September 10, 2016 doi: 10.3791/54696
Automatic Translation
1, 2, 1
1Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

Abstract

Fӧrster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित अध्ययनों GPCR संकेतन की जांच में तेजी से सामान्य हो गए हैं। हमारे शोध समूह Gα सब यूनिटों और एगोनिस्ट उत्तेजना के बाद जीवित कोशिकाओं में GPCRs के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए एक अंतर-आणविक झल्लाहट सेंसर विकसित किया है। यहाँ, हम विस्तार परिवर्तन 100 माइक्रोन के isoproterenol हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज पर β 2 -adrenergic रिसेप्टर और Gαs सी टर्मिनस के बीच पेप्टाइड झल्लाहट में पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल पहले से 1 की विशेषता के रूप में। हमारे झल्लाहट सेंसर एक एकल एक पूरी लंबाई की GPCR, एक झल्लाहट स्वीकर्ता fluorophore (mCitrine) के क्रमानुसार मिलकर पॉलीपेप्टाइड है, एक ईआर / कश्मीर ऐंठन (व्यवस्थित प्रोटीन आकर्षण शक्ति मॉडुलन) लिंकर, एक झल्लाहट दाता fluorophore (mCerulean), और एक Gα सी -terminal पेप्टाइड। इस प्रोटोकॉल विस्तार होगा सेल तैयारी, अभिकर्मक शर्तों, उपकरण सेटअप, परख निष्पादन, और डेटा विश्लेषण। इस प्रयोगात्मक डिजाइन छोटे CH का पता लगाता हैAnges झल्लाहट में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का संकेत है, और भी ligands और GPCR-जी प्रोटीन pairings भर में बातचीत की ताकत की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। संकेत करने वाली शोर हमारे माप में वृद्धि करने के लिए, इस प्रोटोकॉल सभी चरणों में बढ़ परिशुद्धता की आवश्यकता है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्पादन सक्षम करने के लिए यहां प्रस्तुत किया है।

Introduction

जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) सात transmembrane रिसेप्टर्स हैं। अकेले मानव जीनोम लगभग 800 GPCRs, जो प्रकाश, odorants, हार्मोन, पेप्टाइड्स, दवाओं और अन्य छोटे अणुओं सहित ligands की एक किस्म से सक्रिय कर रहे हैं के लिए कोडिंग जीन होता है। बाजार लक्ष्य GPCRs पर वर्तमान में सभी दवाइयों का लगभग 30% है क्योंकि वे कई रोग राज्यों 2 में एक बड़ी भूमिका निभाते हैं। व्यापक काम इस रिसेप्टर परिवार पर किया दशकों के बावजूद, वहाँ विशेष रूप से आणविक तंत्र है कि ड्राइव GPCR-प्रेरक बातचीत के संबंध के साथ क्षेत्र में महत्वपूर्ण बकाया सवाल बने हुए हैं। तिथि करने के लिए, केवल एक उच्च संकल्प क्रिस्टल संरचना प्रकाशित किया गया है, β 2 -adrenergic रिसेप्टर (β 2 -ar) और जी एस प्रोटीन 3 के बीच बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। साथ में पिछले तीन दशकों में व्यापक अनुसंधान के साथ, यह एक विशिष्ट संरचनात्मक घटक है कि इस में महत्वपूर्ण है दोहरातीबातचीत: Gα सबयूनिट सी टर्मिनस। इस संरचना GPCR 4 और जी प्रोटीन चयन 5-6 से दोनों जी प्रोटीन सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, Gα सी टर्मिनस GPCR के ligand उत्तेजना और चयनात्मक जी प्रोटीन सक्रियण के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी प्रदान करता है।

पिछले एक दशक में अनुसंधान से पता चलता है कि GPCRs GPCR रचना के सबसेट स्थिर ligand बाध्यकारी के साथ एक व्यापक परिदृश्य गठनात्मक आबाद। जबकि क्रि, एनएमआर और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित कई तकनीकों, GPCR गठनात्मक परिदृश्य की जांच करने के लिए उपलब्ध हैं, वहाँ दृष्टिकोण की एक कमी प्रेरक चयन 7 में उनके कार्यात्मक महत्व को स्पष्ट करने के लिए है। यहाँ, हम जी प्रोटीन चयनात्मक GPCR रचना पता लगाने के लिए एक Fӧrster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित दृष्टिकोण की रूपरेखा। झल्लाहट ओवरलैपिंग उत्सर्जन (दाता) एक साथ निकटता और दो fluorophores के समानांतर रुख पर निर्भर करता हैएन डी उत्तेजना (स्वीकर्ता) स्पेक्ट्रा 8। के रूप में दाता और स्वीकर्ता fluorophores करीब एक साथ आने के प्रोटीन में या तो गठनात्मक परिवर्तन या एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक परिणाम के रूप में, उन दोनों के बीच झल्लाहट बढ़ जाती है, और तरीकों 8 की एक सीमा का उपयोग करके मापा जा सकता है। झल्लाहट आधारित biosensors GPCR क्षेत्र 9 में बड़े पैमाने पर नियोजित किया गया है। वे तीसरे intracellular पाश और GPCR सी टर्मिनस में दाता और स्वीकर्ता डालने से GPCR में रचना परिवर्तन की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है; सेंसर अलग से एक झल्लाहट जोड़ी 10 के साथ GPCR और प्रेरक (जी प्रोटीन सब यूनिटों / arrestins) लेबल करके GPCR और प्रेरक बातचीत की जांच के लिए डिजाइन किया गया है; कुछ सेंसर भी जी प्रोटीन 11 में गठनात्मक परिवर्तन का पता लगाने। ये biosensors क्षेत्र सक्षम है GPCR में गठनात्मक परिवर्तन और प्रेरक, प्रेरक GPCR-बातचीत के कैनेटीक्स, और allosteric ligands के 12 सहित बकाया सवालों की एक भीड़ पूछने के लिए। हमारा समूहविशेष रूप से एक biosensor कि एगोनिस्ट संचालित की शर्तों के तहत जी प्रोटीन विशिष्ट GPCR रचना पता लगा सकता है बनाने में दिलचस्पी थी। इस biosensor ऐंठन (व्यवस्थित प्रोटीन आकर्षण शक्ति मॉडुलन) 13 नाम के एक हाल ही में विकसित तकनीक पर निर्भर करता है। ऐंठन टेदरिंग बातचीत एक ईआर / कश्मीर लिंकर, जो उनके प्रभावी नियंत्रण का उपयोग कर सांद्रता प्रोटीन डोमेन शामिल है। Fluorophores की एक जोड़ी के साथ झल्लाहट लिंकर flanking एक उपकरण है जो प्रोटीन 12 के बीच बातचीत की स्थिति की रिपोर्ट कर सकते हैं बनाता है। इससे पहले 1 ऐंठन मॉड्यूल एक GPCR को Gα सी टर्मिनस तार और झल्लाहट fluorophores के साथ उनकी बातचीत पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था, mCitrine (करने के लिए इस प्रोटोकॉल में अपनी सामान्यतः ज्ञात संस्करण, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP), उत्तेजना / उत्सर्जन में चोटी द्वारा भेजा 490/525 एनएम) और mCerulean, उत्तेजना / उत्सर्जन चोटी 430/475 एनएम) (अपने सामान्यतः ज्ञात संस्करण सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी द्वारा इस प्रोटोकॉल में कहा गया है)। एन से सी टर्मिनस के लिए, टीउसकी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग एकल पॉलीपेप्टाइड शामिल हैं: एक पूरी लंबाई की GPCR, स्वीकर्ता (mCitrine / YFP) झल्लाहट, 10 एनएम ईआर / कश्मीर लिंकर, झल्लाहट दाता (mCerulean / सीएफपी), और Gα सी टर्मिनस पेप्टाइड। इस अध्ययन में, सेंसर GPCR-लिंकर लंबाई-Gα पेप्टाइड के रूप में संक्षिप्त कर रहे हैं। सभी घटकों एक असंरचित (Gly-SER-Gly) 4 लिंकर जो प्रत्येक डोमेन से मुक्त रोटेशन सक्षम बनाता से अलग होती है। इस तरह के सेंसर का विस्तृत लक्षण वर्णन पहले दो प्रोटोटाइप GPCRs उपयोग किया गया था: 2 -ar और opsin 1 β।

यह सेंसर क्षणिक HEK-293T कोशिकाओं और fluorometer आधारित जीवित कोशिका के प्रयोगों उपस्थिति या ligand के अभाव में प्रति सेकंड (सीपीएस) की गिनती के मनमाना इकाइयों में झल्लाहट जोड़ी के उपाय प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में ट्रांसफ़ेक्ट है। इन मापों fluorophores (YFP अधिकतम / सीएफपी मैक्स) के बीच एक झल्लाहट अनुपात की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। झल्लाहट (ΔFRET) में बदलाव तो औसत झल्लाहट अनुपात घटाकर की जाती हैligand इलाज के नमूने की झल्लाहट अनुपात से की इलाज के नमूने। ΔFRET (β 2 -ar-10 एनएम Gαs पेप्टाइड 2 -ar-10 एनएम कोई पेप्टाइड बीटा बनाम) निर्माणों भर में तुलना की जा सकती। यहाँ, हम विस्तार प्रोटोकॉल लाइव HEK-293T कोशिकाओं में इन सेंसरों व्यक्त करने के लिए, उनकी अभिव्यक्ति की निगरानी, ​​और सेटअप, निष्पादन, और fluorometer आधारित जीवित कोशिका का विश्लेषण बनाम दवा इलाज किया शर्तों इलाज के लिए माप झल्लाहट। हालांकि इस प्रोटोकॉल β 2 -ar-10 एनएम Gαs पेप्टाइड सेंसर 100 माइक्रोन के isoproterenol bitartrate के साथ इलाज के लिए विशिष्ट है, यह अलग-GPCR Gα जोड़े और ligands के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. डीएनए की तैयारी

  1. डिजाइन सेंसर एक मॉड्यूलर क्लोनिंग योजना का उपयोग कर निर्माण करती है। Β 2 -ar सेंसर डिजाइन पहले से 1 विस्तृत संदर्भ करें।
  2. वाणिज्यिक miniprep किट प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए को तैयार है और 2 मिमी Tris एचसीएल समाधान, पीएच 8 में elute, एकाग्रता ≥ पर 750 एनजी / μl, ए 260 / 1.7 280 - 1.9, एक 260 / 2.0 की एक 230 - 2.29।

2. सेल संस्कृति तैयारी

  1. DMEM में संस्कृति HEK-293T-FLP-एन कोशिकाओं 4.5 छ / एल डी ग्लूकोज, साथ पूरक युक्त 10% FBS (गर्मी निष्क्रिय) (वी / वी), 1% एल glutamine पूरक, 20 मिमी HEPES, 7.5 पीएच 37 पर 5% सीओ 2 humidified वातावरण में सी °। बाद के चरणों के लिए जैविक सुरक्षा हुड में कोशिकाओं को संभाल लेना।
  2. कोशिकाओं छह अच्छी तरह से बर्तन में passaging से पहले एक मिला हुआ monolayer को विकसित करने के लिए अनुमति दें। confluency प्राप्त करने के लिए समय प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व पर निर्भर करता है। उपयोग प्लेटें कि1 के भीतर confluency करने के लिए आते हैं - के लिए चढ़ाना के 2 दिनों के छह अच्छी तरह चढ़ाना। एक मिला हुआ 10 सेमी टिशू कल्चर का इलाज पकवान लगभग 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व है। सेल संस्कृति के विकास की छवि के लिए चित्रा 1 देखें।
  3. 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें, और 0.25% trypsin के साथ trypsinize (चर्चा, पैरा 2 देखें)। प्लेट 8 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से ऊतकों में मीडिया के 2 मिलीलीटर में छह अच्छी तरह व्यंजन संस्कृति का इलाज और 16 के लिए पालन करने की अनुमति - 20 घंटा।

3. अभिकर्मक शर्तों

  1. (- 36 घंटा 20 के बीच) निर्माणों उस समय के विभिन्न मात्रा इष्टतम अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए आवश्यकता हो सकती है transfections डगमगाते। एक एकीकृत प्रयोग समय के लिए शर्तों को सिंक्रनाइज़ करें। इसके अलावा एक untransfected अच्छी तरह से नियंत्रण बराबर सेल घनत्व विश्लेषण के दौरान पृष्ठभूमि शोर और बिखरने घटाव के लिए इस्तेमाल किया जाना है।
  2. कमरे के तापमान को अभिकर्मक अभिकर्मकों लाओ: कम सीरम मीडिया, डीएनए, अभिकर्मक अभिकर्मक।
  3. मेंजैविक सुरक्षा हुड निम्न क्रम में एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में अभिकर्मकों गठबंधन: मिश्रण 100 μl को कम सीरम मीडिया के साथ 2 माइक्रोग्राम डीएनए। मिश्रण की सतह या ट्यूब के पक्ष को छूने के बिना मीडिया / डीएनए मिश्रण में अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μl स्पाइक। अच्छी तरह से प्रति एक अभिकर्मक प्रतिक्रिया सेट करें। अभिकर्मक शर्तों अनुकूलित किया जा सकता है (1 - 4 डीएनए के माइक्रोग्राम, 3 - अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μl) सुसंगत अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए। अधिक अनुकूलित अनुपात के लिए 1 टेबल देखें।
  4. 30 मिनट - 15 के लिए जैविक सुरक्षा हुड में आरटी पर मिश्रण सेते हैं। प्रतिक्रिया का उपयोग करता है, तो अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए सेते के लिए नहीं छोड़ा है।
  5. एक बूंद के लिहाज तरीके से कोशिकाओं की प्रतिक्रिया भर में अच्छी तरह से जोड़ें और धीरे छह अच्छी तरह हिला पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए। अच्छी तरह से प्रति एक प्रतिक्रिया जोड़ें।
  6. अभिव्यक्ति के 20 घंटे के बाद, मॉनिटर प्रतिदीप्ति टिशू कल्चर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग। 40X पर एक सेल में 10X उद्देश्य और प्रोटीन स्थानीयकरण के साथ जनसंख्या अभिव्यक्ति का आकलन करें। ओ बीएसप्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए erve। पर्याप्त internalization का उल्लेख किया जाता है, अभिकर्मक पर नजर रखने के लिए जब तक महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति PM पर पता चला है।

4. अभिकर्मक और उपकरण तैयारी

  1. (में DH 2 300 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड युक्त हे 100 मिमी) isoproterenol bitartrate: -80 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिमी दवा कंपनियों के शेयरों और दुकान तैयार करें। तुरंत ठंडे कमरे, और फ्लैश फ्रीज में बर्फ पर बनाओ /। Aliquots बना दिया है और एक वर्ष के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. सेल बफर तैयार (~ 2 मिलीग्राम / हालत) और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्टोर। प्रत्येक दिन ताजा बनाओ। सेल बफर घटक के लिए संदर्भ तालिका 2।
  3. ड्रग बफर (10 मिलीलीटर) को तैयार है और कमरे के तापमान पर स्टोर। ड्रग बफर घटक के लिए संदर्भ तालिका 2।
  4. एसिड केंद्रित एचसीएल का उपयोग कर cuvettes धो लें। एक कमजोर आधार (1 एम KOH) के साथ बेअसर, और अच्छी तरह DH 2 ओ के साथ cuvettes धोने
  5. कई के साथ fluorometer आसपास काम स्टेशन तैयार10, 200, और 1000 μl पिपेट टिप्स, एक टाइमर एक 10 मिनट की उलटी गिनती, क्युवेट सफाई के लिए टिप्स, नाजुक कार्य पोंछे के साथ एक सुलभ शून्य रेखा, और ultrapure एच 2 ओ के साथ धार की बोतल के साथ सेट के बक्से
  6. fluorometer और गर्मी ब्लॉक करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए बाहरी पानी से स्नान गर्मी।
  7. fluorometer पर बारी; 430 एनएम, bandpass 8 एनएम उत्तेजना को सीएफपी संग्रह के लिए निर्धारित प्रतिदीप्ति संग्रह कार्यक्रम; उत्सर्जन रेंज 450 एनएम - 600 एनएम, bandpass 4 एनएम। 600 एनएम, bandpass 4 एनएम - केवल सेंसर नियंत्रण के रूप में YFP संग्रह के लिए 490 एनएम, bandpass 8 एनएम, उत्सर्जन सीमा से 500 सेट उत्तेजना (चर्चा देखने के लिए)। सीएफपी संग्रह सेटिंग्स इस प्रयोग में एक झल्लाहट स्पेक्ट्रम हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  8. गर्मी ब्लॉक में बारह 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों की जगह के रूप में नीचे चित्रा 2 में दिखाया गया है। इन ट्यूबों सेल विभाज्य ट्यूबों के लिए धारक हैं (500 μl microcentrifuge ट्यूब।) Cuvettes यहाँ रखा तकिया धारकों 1 और 7 में ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा रखें।
    नोट: अनुपचारित हालत और दवा हालत पार प्रदूषण को रोकने के लिए अलग से cuvettes का प्रयोग करें।

चित्र 2
चित्रा 2. microcentrifuge ट्यूब सेट अप और इलाज के नमूने के लिए गर्मी ब्लॉक क्युवेट में स्थिति संदर्भ स्थिति 1 में है। सेल विभाज्य नलियों पदों 2 में हैं - 6. दवा इलाज के नमूने के लिए क्युवेट स्थिति 7 में है; सेल विभाज्य नलियों स्थिति में हैं 8 - 12. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. 6 और 8 - - 12 एक मिनी 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान बनाने के लिए पानी की ~ 750 μl के साथ धारकों 2 भरें।
  2. दस 500 सेल aliquots के लिए μl microcentrifuge ट्यूबों मिनी जल स्नान (- 6, 8 - 12 धारकों 2) में रखें। प्रत्येक ट्यूब हालत के एक व्यक्ति को दोहराने की होगी (5 untreateडी, 5 दवा इलाज)।
  3. अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं मॉनिटर (3.6 कदम देखें)।

5. प्रयोग और डेटा संग्रह

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रायोगिक योजनाबद्ध। प्रयोगात्मक के लिए एक विस्तृत कदम के लिहाज से सेट अप गाइड और निष्पादन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. प्रयोगात्मक योजनाबद्ध के लिए संदर्भ चित्रा 3। जब कोशिकाओं, काटा जा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ पाया प्रोटीन अभिव्यक्ति के आधार पर तैयार कर रहे हैं (चर्चा, पैरा 4 देखें): जैविक सुरक्षा हुड में, धीरे से एक P1,000 साथ ~ 1 उनकी संस्कृति में resuspend कोशिकाओं मीडिया की मिलीलीटर, हटाने और मेजबान हस्तांतरण एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में।
    नोट: trypsin का उपयोग के रूप में यह एन टर्मिनस पचाने और हो सकता से बचने /या GPCR सेंसर की जेब से बाध्यकारी।
  2. कोशिकाओं की गणना मेजबान में उचित सेल घनत्व सुनिश्चित करने के लिए। 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए मेजबान मात्रा का अनुकूलन।
  3. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर झूल बाल्टी अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं स्पिन, 290 XG। centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  4. धीरे 1 मिलीलीटर सेल बफर (37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) में कोशिकाओं resuspend और कदम 5.3 दोहराएँ। दूसरी स्पिन के दौरान, डिग्री सेल्सियस -80 से 100 मिमी दवा शेयर विभाज्य इकट्ठा होते हैं। 1 मिमी काम स्टॉक के लिए नशीली दवाओं के बफर में 100 कमजोर पड़ने और आरटी पर रख: 1 बनाओ।
  5. दूसरे centrifugation के बाद, सेल बफर (4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और धीरे resuspend कोशिकाओं को हटा दें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर एक खाली के रूप में सेल बफर के 1 मिलीलीटर 1 कोशिकाओं की मिलीग्राम और प्रयोग करने में नमूने के उपाय आयुध डिपो के 600। एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक क्युवेट में कोशिकाओं को बांटना और तुरंत spectrophotometry के बाद एक microcentrifuge ट्यूब पर वापस हस्तांतरण।
  6. एक नियंत्रण untransfected सेल के लिएएल हालत स्पेक्ट्रम, धीरे, P1,000 pipet के साथ 1 मिलीलीटर सेल बफर में untransfected कोशिकाओं resuspend क्युवेट और उत्तेजना 430 एनएम पर झल्लाहट स्पेक्ट्रम हासिल करने के लिए कोशिकाओं के 90 μl जोड़ने के लिए, bandpass 8 एनएम, उत्सर्जन 450 - 600 एनएम, bandpass 4 एनएम। कोशिकाओं के ताजा 90 μl के साथ 5 दोहराने स्पेक्ट्रा - 3 लीजिए। कोशिकाओं के शेयर ultrapure एच 2 ओ नमूनों के बीच के साथ, चश्मे के बीच 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें प्रत्येक नमूना विभाज्य के बीच P1,000 के साथ धीरे resuspend, और कुल्ला क्युवेट।
  7. 6, 8 - - 12 गर्मी ब्लॉक में प्रयोगात्मक शर्तों, विभाज्य धारकों 2 में 500 μl नलियों से प्रत्येक के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के 90 μl के लिए। धीरे प्रत्येक विभाज्य के बीच P1,000 pipet के साथ कोशिकाओं के शेयर resuspend।
  8. 6 अनुपचारित हालत नमूने के लिए - कोशिकाओं aliquoted कर रहे हैं के बाद, 2 ट्यूबों को नशीली दवाओं के बफर के 10 μl जोड़ें।
  9. ट्यूब 8 में 1 मिमी दवा समाधान के 10 μl जोड़कर प्रयोग शुरू, टाइमर 10 मिनट से उलटी गिनती, और धीरे P200 pipet के साथ ट्यूब मिश्रण करने के लिए शुरू करते हैं। बंद ट्यूब और 37 को वापसीसी गर्मी ब्लॉक °।
  10. इसके तत्काल बाद, ट्यूब 2 ऊपर उठाओ, P200 के साथ धीरे मिश्रण (एक नई टिप का उपयोग करें) अनुपचारित हालत क्युवेट सेल निलंबन के 90 μl जोड़ने के लिए, और fluorometer में जगह है।
  11. 600 एनएम, bandpass 4 एनएम - उत्तेजना 430 एनएम, bandpass 8 एनएम, उत्सर्जन 450 पर झल्लाहट स्पेक्ट्रम मोल।
  12. 9 मिनट पर - 10 सेकंड, 1 मिमी दवा समाधान के 10 μl के साथ ट्यूब 9 स्पाइक, धीरे से एक P200 (नई टिप का उपयोग) के साथ मिश्रण है, और लौटने के ब्लॉक करने के लिए गर्मी ट्यूब।
  13. दोहराएँ 5.10 कदम - 5.11 ट्यूब 3 और 5.12 ट्यूब 10 के साथ साथ।
  14. दोहराएँ 5.10 कदम - 5.13 1 मिनट के अंतराल (08:10, 07:10, आदि) जब तक स्पेक्ट्रा सभी अनुपचारित हालत नमूने के लिए एकत्र कर रहे हैं, और नशीली दवाओं के सभी दवा हालत नमूनों में जोड़ दिया गया है। पार प्रदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक pipet कदम के लिए एक ताजा टिप का उपयोग करें।
  15. 5 मिनट में - 10 सेकंड, 8 (दवा हालत) मिश्रण ट्यूब धीरे P200 pipet के साथ शुरू दवा इलाज नमूना और fluorometer में जगह के लिए अलग क्युवेट सेल निलंबन के 90 μl जोड़ें।
  16. मोल एफरेत स्पेक्ट्रम (सेटिंग्स के लिए कदम 5.11 देखें)।
  17. दोहराएँ 5.15 कदम - 5.16 शेष दवा हालत नमूने (- 12 नलियों 9) के लिए 1 मिनट के अंतराल (04:10, 03:10, आदि) पर।
  18. प्रयोग समाप्त करने के बाद, परियोजना फ़ाइलों को बचाने के लिए, अच्छी तरह से ultrapure एच 2 ओ के साथ cuvettes धोने, और अगले हालत के लिए फिर से शेयर ट्यूबों। धोने कदम में पार प्रदूषण को रोकने के लिए ध्यान रखना। एच 2 ओ बोतल पर और साथ ही washes के बीच में शून्य रेखा पर टिप बदलें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. सहेजें और छठे वेतन आयोग में निर्यात डेटा फ़ाइलों को विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्रारूप। विश्लेषण कार्यक्रमों शिवरामकृष्णन लैब प्रकाशन वेबसाइट से डाउनलोड के लिए उपलब्ध हैं।
  2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए पथ फ़ाइलें जो विश्लेषण प्रोग्राम (V9, V15), untransfected नमूने फ़ाइलें (untransfected सेल स्पेक्ट्रम संग्रह के लिए कदम 5.6 देखें), उत्पादन डेटा फ़ाइल, और अल्पविराम से अलग मान (CSV) डेटा प्रविष्टि के लिए फ़ाइलों में शामिल बनाएँ।
  3. निम्न जानकारी दर्ज करेंसीएसवी फ़ाइल में प्रत्येक नमूना के लिए (3 टेबल में नमूना देखें) और नामित संबंधित स्थिति, जिनमें शामिल हैं:
    फ़ाइल का नाम - व्यक्तिगत छठे वेतन आयोग ग्राफ फ़ाइलें
    रिसेप्टर - मनोनीत जो GPCR निर्माण परीक्षण किया गया था (जैसे, Β2)
    बांधने की मशीन - मनोनीत जो निर्माण के पेप्टाइड संस्करण का परीक्षण किया गया था (जैसे, एस)
    एगोनिस्ट - इलाज नामित (एन) या दवा इलाज (डी) की स्थिति
    निर्देशिका - जिसमें छठे वेतन आयोग फ़ाइलें सहेज कर रहे हैं, आम तौर पर तिथि द्वारा आयोजित पथ फ़ोल्डर
    आयुध डिपो - स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से नमूने की दर्ज की ऑप्टिकल घनत्व
  4. नमूनों से बफर और बिखरने शोर घटाना untransfected नमूने (5.6 कदम) के लिए फ़ाइल नाम दर्ज करें।
  5. विश्लेषण कार्यक्रम में शर्तों दर्ज करें।
  6. कार्यक्रम चलाने व्यक्ति की स्थिति (v9) के भीतर और पार की स्थिति (V15) नमूनों का विश्लेषण करने के लिए।
  7. नमूना फ़ाइलें जो डेटा सेट में स्पष्ट outliers हैं बाहर करते हैं, या बढ़ाने या व्यक्तिगत के आयुध डिपो मूल्य को कम करके घटाव के लिए समायोजितदोहरी फ़ाइलें।
  8. उपयोग के लिए गणना करने के लिए उत्पादन फ़ाइल में निर्यात डेटा अनुपात (525 एनएम / 475 एनएम) झल्लाहट।
  9. इलाज (दवा) की स्थिति के लिए व्यक्तिगत झल्लाहट अनुपातों से अनुपचारित हालत के लिए औसत झल्लाहट अनुपात घटा कर ΔFRET की गणना।

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Representative Results

प्रयोग की एक सामान्यीकृत योजनाबद्ध की स्थापना की और निष्पादन चित्रा 3 में विस्तृत है।

आदेश सेंसर की संकीर्ण गतिशील रेंज में एक झल्लाहट परिवर्तन का पता लगाने के लिए, यह सिस्टम की बारीकियों का पालन किया जाना का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल गुणवत्ता के नमूने में प्रोटीन अभिव्यक्ति के रूप में अच्छी तरह से स्थिरता के लिए जरूरी है। चित्रा सुसंस्कृत एक सुसंगत monolayer (10X) है कि इष्टतम है में बढ़ कोशिकाओं के 1 सुविधाओं छवियों छह अच्छी तरह चढ़ाना और अभिकर्मक चित्रा 1 (क) और clumped पैटर्न में बढ़ कोशिकाओं वृक्ष के समान आकार के लिए कि नेतृत्व चित्रा 1 (ख) जो लगातार चढ़ाना के लिए अनुशंसित नहीं है। अभिकर्मक की स्थिति भी आदेश प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कई स्थितियों यहां इस्तेमाल की सिफारिश की अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए अनुकूलित किया गया है। तालिका 1 जानकारी के लिए कम सीरम मीडिया के लिए इन शर्तों। डीएनए, और अभिकर्मक वजहसज्जन अनुपात।

एक बार सभी डेटा एकत्र किया गया है और डेटा विश्लेषण (3 टेबल में नमूना देखें) के लिए सीएसवी फ़ाइल में प्रवेश किया, उत्पन्न परिणामों कच्चे झल्लाहट स्पेक्ट्रा चित्रा 4 में दिखाया गया डेटा समान होगा (क) और सामान्यीकृत, मतलब झल्लाहट स्पेक्ट्रा चित्र में दिखाया गया 4 (ख)। चित्रा 4 में लाल स्पेक्ट्रा इलाज के नमूने और नीले रंग की दवा इलाज के नमूने कर रहे हैं। चित्रा 4 (क) में कच्चे झल्लाहट स्पेक्ट्रा के सभी सुसंगत डेटा विश्लेषण के लिए (यानी।, 475 एनएम पर सीपीएस की तुलना में 450 एनएम पर सीपीएस) पर्याप्त संकेत करने वाली शोर श्रृंखला है। इस श्रृंखला के साथ, स्पेक्ट्रा चिकनी कर रहे हैं और नमूना से पानी शिखर (रमन शिखर 500 एनएम पर है) भी बहुत कम है। कम अभिव्यक्ति के स्तर के एक प्रमुख पानी पीक कि डेटा विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप में परिणाम। डेटा 475 एनएम पर सामान्यीकृत है, 1.0 के लिए इस मान के सीपीएस की स्थापना (चित्रा 4 (बी))। Β 2 -ar के लिए इस डेटा सेट में-10 एनएम Gαs पेप्टाइड सेंसर, वहाँ 525 एनएम इलाज (लाल) और इलाज (नीला) के नमूनों के बीच पढ़ने में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन है। ΔFRET परिवर्तन इन डेटा सेट की झल्लाहट अनुपात (525 एनएम / 475 एनएम) से गणना की और आउटपुट फ़ाइल के माध्यम से पहुंच रहे हैं।

तो प्रोटीन अभिव्यक्ति कम है, वहां गरीब अभिकर्मक दक्षता, या प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए क्युवेट में कम सेल घनत्व है, स्पेक्ट्रा noisier, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है प्रकट हो सकता है। चित्रा 4 (क) इस के लिए संकेत करने वाली शोर रेंज तुलना डेटा सेट नहीं आदर्श है, पर लगभग 1.0 है -। 1.6, 4 x 10 5 के सीपीएस अधिकतम के साथ यह कम अभिव्यक्ति के स्तर दांतेदार स्पेक्ट्रा कच्चे डेटा चित्रा में देखा करने के लिए योगदान 5 (क), तथापि डेटा तंग और होना करने में सक्षम है सामान्यीकृत चित्रा 5 (ख)। हालांकि पानी चोटियों (~ 500 एनएम) अप लाइन नहीं है पूरी तरह से बीच डेटा सेट चित्रा 5 (ख) इस पूर्वperiment अभी भी विश्लेषण के लिए प्रयोग करने योग्य है। चित्रा 6 एक प्रयोग है कि विश्लेषण के लिए अपर्याप्त है का प्रतिनिधि है। संकेत करने वाली शोर नमूने के लगभग 2 है जबकि - 3 इलाज (नीला) और इलाज (लाल) के नमूने, नमूने भर में क्युवेट में सेल घनत्व बहुत कम है चित्रा 6 (1 x 10 5 के 450 एनएम मूल्य) (के लिए क)। इस पृष्ठभूमि घटाव और सामान्य चित्रा 6 (ख) और स्पेक्ट्रा संरेखित नहीं है में एक मुद्दा बनाता है। घटाव बढ़ाने या तालिका 3 में आयुध डिपो कम से नमूने के लिए समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, यहां तक कम सेल घनत्व के साथ, पानी शिखर (~ 500 एनएम) बहुत बड़ा और noisier चित्रा 6 (ग) हो जाता है और आगे के विश्लेषण से इस डेटा सेट को रोकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. संवर्धित सेल के विकास का उदाहरण है। एक monolayer में बढ़ कोशिकाओं (एक) लगातार चढ़ाना और अभिकर्मक के लिए आदर्श होते हैं। कोशिकाओं है कि गुच्छों में या वृक्ष के समान पैटर्न (ख) छह कुओं में लगातार थाली नहीं हो सकता है के साथ विकसित करने के लिए दिखाई देते हैं, गरीब अभिकर्मक दक्षता प्रदर्शित कर सकता है, और झल्लाहट स्पेक्ट्रम के आयाम में विसंगतियां पैदा हो सकती है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि डेटा विश्लेषण β 2 -ar-10 एनएम Gαs पेप्टाइड ± दवा के लिए। कच्चे डेटा के प्रतिनिधि छवि (क) और सामान्यीकृत, औसतन डेटा (ख) अनुपचारित (लाल) नमूने और इलाज (नीला) के साथ β 2 -ar-10 एनएम Gαs पेप्टाइड संवेदक के साथ एकत्र रों100 माइक्रोन के isoproterenol bitartrate के साथ 5 मिनट ऊष्मायन के बाद amples। 475 एनएम, 525 एनएम पर YFP अधिकतम उत्सर्जन में सीएफपी अधिकतम उत्सर्जन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. कच्चे और सामान्यीकृत डेटा के साथ गरीब प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण। कोलाहलपूर्ण कच्चे डेटा स्पेक्ट्रा (क) कम अभिव्यक्ति के स्तर, नमूना प्रति कम सेल घनत्व, और / या निर्माण के गरीब अभिकर्मक दक्षता का परिणाम होते हैं। यह डेटा सेट हालांकि यह आदर्श नहीं है, के रूप में सामान्यीकृत (ख) व्याख्या अब भी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 6 कच्चा साथ fluorometer क्युवेट में कम सेल घनत्व का विश्लेषण और सामान्यीकृत डेटा सेट करता है। नमूना प्रति कम सेल घनत्व, कच्चे डेटा में देखा (क) पेचीदा पानी / पृष्ठभूमि घटाव (बी, सी) और इस डेटा uninterpretable सेट बनाता है। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

शर्त 0.5x 0.7x 1x 2x 2x *
डीएनए 1 माइक्रोग्राम 1.4 माइक्रोग्राम 2 माइक्रोग्राम 4 माइक्रोग्राम 4 माइक्रोग्राम
कम सीरम मीडिया 100 μl 70 μl 100 μl 100 μl 200 μl
अभिकर्मक अभिकर्मक 3 μl 4.2 μl 6 μl 6 μl 12 μl
* ध्यान दें: असाधारण मुश्किल निर्माण के लिए अनुशंसित। सावधानी, लिया जाना चाहिए के रूप में इस हालत उच्च कोशिका मृत्यु लाती है।

तालिका 1 अभिकर्मक शर्तों। इस तालिका सिफारिश अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग HEK-293T कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर कुओं में transfections के लिए अभिकर्मकों के अनुकूलित शर्तें शामिल हैं।

सेल बफर
आयतन अभिकर्मक टिप्पणियाँ
9 मिलीलीटर ultrapure DNase / RNase मुक्त पानी
1 मिलीलीटर HBS (10x), पीएच 7.4, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान:
200 मिमी HEPES
50 मिमी KCl
450 मिमी NaCl
20 मिमी 2 CaCl - एच 2 ओ
10 मिमी 2 MgCl - एच 2 ओ
100 μl 20% डी ग्लूकोज
15 μl aprotinin (1 मिलीग्राम / में DH 2 हे एमएल) गिरावट को रोकने के
15 μl leupeptin (1 मिलीग्राम / में DH 2 हे एमएल) गिरावट को रोकने के
100 μl एस्कॉर्बिक एसिड (DH 2 हे में 100 मिमी) * एगोनिस्ट स्थिर
* परख की शुरुआत से पहले तुरंत जोड़ने
ड्रग बफर
आयतन अभिकर्मक टिप्पणियाँ
9 मिलीलीटर ultrapure DNase / RNase मुक्त पानी
1 मिलीलीटर HBS (10x), पीएच 7.4, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान:
200 मिमी HEPES
50 मिमी KCl
450 मिमी NaCl
20 मिमी 2 CaCl - एच 2 ओ
10 मिमी MgCl <उप> 2 - एच 2 ओ
100 μl एस्कॉर्बिक एसिड (DH 2 हे में 100 मिमी) * एगोनिस्ट स्थिर
* परख की शुरुआत से पहले तुरंत जोड़ने

तालिका 2 बफर घटक। इस तालिका में प्रयोग में इस्तेमाल के लिए दोनों सेल बफर एवं औषधि बफर बनाने के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों का विवरण। दोनों बफ़र्स ताजा प्रयोग के प्रत्येक दिन बनाओ; 37 डिग्री सेल्सियस पर दुकान सेल बफर, और नशीली दवाओं बफर कमरे के तापमान पर।

टेबल तीन

विश्लेषण के लिए तालिका 3. नमूना CSV फ़ाइल। यह नमूना डेटा फ़ाइल प्रविष्टि एक प्रयोग के बाद सेट पर प्रकाश डाला गया। कई प्रयोगों में एक ही सीएसवी फ़ाइल में प्रवेश किया जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो 'Additive' कॉलम के तहत पहचाना जा सकता है। से प्रत्येकपंक्ति निम्नलिखित जानकारी के साथ भरा जाना चाहिए:
फ़ाइल का नाम - व्यक्तिगत छठे वेतन आयोग ग्राफ फ़ाइलों रिसेप्टर - मनोनीत जो GPCR निर्माण परीक्षण किया गया था (जैसे, Β2)
बांधने की मशीन - मनोनीत जो निर्माण के पेप्टाइड संस्करण का परीक्षण किया गया था (जैसे, एस)
एगोनिस्ट - इलाज नामित (एन) या दवा इलाज (डी) की स्थिति
निर्देशिका - जिसमें छठे वेतन आयोग फ़ाइलें सहेज कर रहे हैं, आम तौर पर तिथि द्वारा आयोजित पथ फ़ोल्डर
आयुध डिपो - स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में नमूने की दर्ज की ऑप्टिकल घनत्व
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Discussion

इस प्रणाली में झल्लाहट माप की तंग गतिशील रेंज इस प्रोटोकॉल के हर कदम में संवेदनशील गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता पुष्ट। एक सफल झल्लाहट प्रयोग सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम 1) सेल संवर्धन, 2) अभिकर्मक 3) प्रोटीन अभिव्यक्ति और परख निष्पादन के दौरान 4) समय पर, सटीक समन्वय कर रहे हैं।

सेल स्वास्थ्य और रखरखाव / चढ़ाना गुणवत्ता के लिए यह असंभव झल्लाहट में किसी भी लगातार परिवर्तन का पता लगाने के लिए कर सकते प्रायोगिक प्रणाली और गरीब सेल स्वास्थ्य का संकेत करने वाली शोर पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। परंपरागत ढंग से, कोशिकाओं, हालांकि इस सेल लाइन, हैंडलिंग, और संस्कृति की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं लगभग 20 मार्ग के लिए स्वास्थ्यप्रद हैं। एक बार कोशिकाओं है कठिनाई मिला हुआ monolayer के रूप में बढ़ रहा है, या एक से अधिक वृक्ष के समान पैटर्न, प्रयोगात्मक पृष्ठभूमि शोर पर प्रतिकूल असर पड़ेगा (चित्रा 1 (ख) देखें) में लगातार बढ़ रही शुरू करते हैं। दिनचर्या दवा सहित सावधान सेल रखरखाव,एक परिवर्तन और नियमित रूप से रखरखाव प्लेटों से गैर पक्षपाती कोशिकाओं और मलबे को हटाने, छह अच्छी तरह चढ़ाना और transfections के लिए कोशिकाओं की गुणवत्ता में वृद्धि होगी। सेल clumps, जो प्रतिकूल अभिकर्मक क्षमता को प्रभावित, प्रभावी ढंग से रखरखाव प्लेटों के trypsinization द्वारा व्यक्ति की कोशिकाओं में विभाजित किया जा सकता: 10 सेमी मिला हुआ व्यंजन 37 में, 30 सेकंड के लिए 10 0.25 मिलीलीटर% trypsin के साथ इलाज trypsin हटाने लेकिन लगभग 200 μl छोड़ देते हैं, जगह पकवान 3 मिनट - 2 के लिए सी इनक्यूबेटर °। कोशिकाओं को बहुत आसानी से पकवान से आते हैं और कम clumping लिए अतिसंवेदनशील होते हैं जाएगा।

यह इस प्रयोग के लिए अभिकर्मक कदम अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुशल अभिकर्मक इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए 80% मिला हुआ - छह कुओं आदर्श 60 होना चाहिए। transfect करने के लिए 6 घंटा, या जब तक कोशिकाओं के कम से कम 70% पालन कर रहे हैं - बहुत कुछ कोशिकाओं पालन किया है तो (<60%), लगभग 2 प्रतीक्षा करें। छह कुओं कि अधिक मिला हुआ (> 80%) कर रहे हैं भी अभिकर्मक दक्षता कम हो जाएगा। कम से कम Transfectingसेल confluency कोशिका मृत्यु दर बढ़ जाती है। डीएनए एकाग्रता और पवित्रता भी महत्वपूर्ण हैं (1.2 चरण देखें)। कम एकाग्रता और / या गरीब गुणवत्ता डीएनए तैयारी का उपयोग नकारात्मक, अभिकर्मक क्षमता को प्रभावित अभिकर्मक शर्तों निर्माण प्रति समायोजित किया जा सकता है और अधिक जानकारी के लिए 1 टेबल को देखें।

एक ऊतक संस्कृति प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति की सटीक और लगातार निगरानी इस प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि इस कदम व्यक्तिगत निर्णय के अधीन है, यह इस तरह के माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य तकनीकों के उपयोग करने के लिए, मात्रात्मक समय के साथ अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए, हालांकि वे यहाँ विस्तृत नहीं कर रहे हैं संभव है। निर्माणों हम अपने सिस्टम में सफलतापूर्वक परीक्षण किया है, अभिव्यक्ति इष्टतम अभिव्यक्ति तक पहुंचने के लिए लगभग 18-36 मानव संसाधन लेता है। हमारे अनुभव में, constructs इस समय खिड़की के दौरान कहा कि प्रदर्शन गरीब अभिव्यक्ति शायद ही कभी 40 घंटे के बाद सुधार होगा। निर्माणों हम साथ degradatio के संकेत नहीं दिखाई है प्रकाशित किया हैn, हालांकि यह कुछ GPCRs के लिए एक मुद्दा हो सकता है। हमारे assays में, सेंसर गिरावट 30 घंटा से अधिक अभिकर्मक समय पर संभव है। सेंसर अखंडता YFP / CFP अनुपात का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है: 525 एनएम YFP उत्साहित (490 एनएम) स्पेक्ट्रम से पढ़ने, और 475 एनएम सीएफपी उत्साहित (430 एनएम) स्पेक्ट्रम से पढ़ रहे हैं। सेटिंग्स के लिए, 4.6 कदम को देखते हैं। 1.8 का एक आदर्श अनुपात के साथ, 2.0 - YFP / CFP अनुशंसित अनुपात में 1.7 की रेंज में हैं। यह मान CFP14 को YFP रिश्तेदार की अनुमानित दो गुना अधिक से अधिक चमक पर निर्भर है। कम से कम गिरावट के साथ एक अभिन्न सेंसर इसलिए दोनों fluorophores में शामिल होंगे और YFP है: लगभग 2 के सीएफपी अनुपात: 1। बाद सेंसर गुणवत्ता की पुष्टि की गई है कि वह प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। उल्लेखनीय intracellular अभिव्यक्ति या तो प्रोटीन गिरावट, internalization, या प्रोटीन के चल रहे अवैध व्यापार का एक परिणाम हो सकता है। मॉनिटर समय के साथ का निर्माण करता है, तो अभिव्यक्ति प्लाज्मा झिल्ली में बढ़ाया है देखने के लिए। अगले critअभिव्यक्ति में राजनैतिक चुनौती अभिकर्मक दक्षता है। लगभग 70% + अभिकर्मक दक्षता इस fluorometer प्रणाली में पर्याप्त संकेत करने वाली शोर का पता लगाने के लिए आवश्यक है। कम कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट रहे हैं, तो संकेत करने वाली शोर की मात्रा अभी भी पता लगाने योग्य हो सकता है लेकिन बहुत कम एक झल्लाहट प्रयोग में नमूने के बीच लगातार हो जाएगा। इस प्रणाली की संकीर्ण गतिशील रेंज के भीतर सटीक डाटा विश्लेषण में बाधा होगी। अभिव्यक्ति के स्तर भी प्रयोग के दौरान पर्याप्त संकेत करने वाली शोर को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा उपस्थित थे। अभिव्यक्ति fluorometer द्वारा detectable स्तर के लिए, 1.5 की 475 एनएम और 450 एनएम (सेल बिखरने) के बीच सिग्नल के अनुपात झल्लाहट में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त है, हालांकि इष्टतम अभिव्यक्ति लगभग 2.0+ का अनुपात होगा। संदर्भ के लिए, β2-एआर डेटा 4 एक्स 10 5 सीपीएस (450 एनएम) 1 एक्स 10 6 सीपीएस (475 एनएम), संकेत करने वाली शोर 2.5 के अनुपात के एक संकेत करने वाली शोर रेंज में एकत्र किया जाता है। इस अनुपात में मदद मिलेगी variabi की मात्रा को कमनमूने, जो भी डेटा विश्लेषण प्रभावित कर सकते हैं के बीच lity। ये अभिव्यक्ति के स्तर भी संवेदनशीलता और fluorometer प्रकाशिकी का इष्टतम संरेखण के अधीन हैं; अन्य प्रणालियों के पर्याप्त संकेत करने वाली शोर अनुकूलन के लिए विभिन्न मापदंडों की आवश्यकता हो सकती है।

कोशिकाओं समय और तापमान के प्रति बेहद संवेदनशील हैं। एक बार जब प्रयोगात्मक प्रक्रिया शुरू हो गया है, कोमल हैंडलिंग कोशिका मृत्यु से बचने के लिए आवश्यक है। विशिष्ट साजो उपायों प्रक्रिया में तेजी लाने और काम स्टेशन तैयारी सहित समय पर गलतियों, सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण ठीक से कार्य कर रहा है, और पहले से प्रयोग के लक्ष्यों को बाहर की योजना बना करने से बचने के लिए लिया जा सकता है। यह कटाई के 30 मिनट के भीतर कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए आदर्श है, और हमारी प्रणाली में, इस प्रोटोकॉल 20 मिनट के भीतर मार डाला है। एक बार जब तकनीक में महारत हासिल है, विशेष रूप से अभिकर्मक अनुकूलन और व्यायाम के ही मैनुअल निपुणता, इस प्रयोग एक दूसरे के खिलाफ विभिन्न निर्माणों तुलना करने के लिए, खुराक फिर से उत्पन्न किया जा सकता हैघटता प्रायोजक, और सेंसर पूर्ण लंबाई जी प्रोटीन के लिए विस्तारित किया जा सकता है।

हालांकि झल्लाहट यहां इस्तेमाल सेंसर GPCR झल्लाहट सेंसर में एक अद्वितीय विकास है, इस विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थापना सेंसर के कार्यान्वयन के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता परख के रूप में विस्तृत है। Fluorometer आधारित परख कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी प्रत्येक प्रयोग में मूल्यांकन किया जाना है और शुद्ध प्रोटीन या झिल्ली preps पर भरोसा नहीं करता, इसलिए एक विवो पर्यावरण को बनाए रखने की अनुमति देता है। इस प्रयोगात्मक डिजाइन भी बहुत छोटा GPCR की एगोनिस्ट उत्तेजना पर प्रणाली में देखा परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनकी कोई प्रतियोगी रुचि नहीं है।

Acknowledgments

रम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप (14PRE18560010) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। अनुसंधान अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के वैज्ञानिक विकास अनुदान (13SDG14270009) और एनआईएच (1DP2 CA186752-01 और 1-R01 जीएम- 105646-01-A1) एस एस द्वारा वित्त पोषित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor Addgene 47438 https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Fermentas/Fisher Sci FERK0503 Elute in 2 mM Tris elution buffer
HEK-293T-Flp-n cells Life Technologies R78007
Trypsin (0.25%) Life Technologies 25200056
DMEM- high glucose Life Technologies 11960-044 Warm in  37 °C water bath before use
FBS, certified, Heat inactivated, US origin Life Technologies 10082147
Glutamax I 100x Life Technologies 35050061
HEPES Corning MT25060CL
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media; Bring to RT before use
XtremeGene HP transfection reagenet Roche 6366236001 Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use
FluoroMax 4 Horiba Use with FluorEssence V3.8 software
3-mm path length quartz cuvette Starna NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna
Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump Fisher Scientific 13-874-826 Warm to 37 °C before use
Thermomixer Heat Block Eppendorf 22670000 Warm to 37 °C before use
Ultrapure DNA/RNAse free water Life Technologies 10977015 Use at RT
D(+)-glucose, anhydrous Sigma G5767
aprotinin from bovine lung Sigma A1153
leupeptin hemisulfate EMD 10-897
L-ascorbic acid, reagent grade Sigma A0278
(-)-isoproterenol (+)-bitartrate Sigma I2760 Use fresh aliquot each experiment

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References

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Semack, A., Malik, R. U., Sivaramakrishnan, S. G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay. J. Vis. Exp. (115), e54696, doi:10.3791/54696 (2016).

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