Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

موافقات لهذه العملية من G البروتين انتقائية تقاس باستخدام الحنق مجسات في لايف تعليق خلية التألق الفحص

Published: September 10, 2016 doi: 10.3791/54696
Automatic Translation
1, 2, 1
1Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

Abstract

Fӧrster نقل الطاقة الرنين (الحنق) المستندة أصبحت الدراسات شائعا بشكل متزايد في التحقيق في هذه العملية من الإشارات. وضعت مجموعة بحثنا جهاز استشعار الحنق داخل الجزيئية للكشف عن التفاعل بين مفارز Gα وGPCRs في الخلايا الحية بعد التحفيز ناهض. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للكشف عن تغيرات في الحنق بين مستقبلات الأدرينالية β 2 وGαs C-محطة الببتيد على العلاج مع 100 ميكرومتر ايزوبروتيرينول هيدروكلوريد كما تتميز سابقا 1. استشعار الحنق لدينا هو ببتيد واحد يتألف بشكل متسلسل لهذه العملية من طول كامل، fluorophore الحنق متقبل (mCitrine)، وهو ER / K نوبة (منهجية البروتين تقارب قوة التحوير) الربط، وهو fluorophore الحنق المانحة (mCerulean)، وGα C الببتيد -terminal. هذا البروتوكول سوف إعداد خلية التفاصيل والظروف ترنسفكأيشن، وإعداد المعدات، وتنفيذ فحص وتحليل البيانات. هذا التصميم التجريبي بالكشف عن الفصل صغيرفي نفس الفئة في الحنق يدل على تفاعلات البروتين البروتين، ويمكن أن تستخدم أيضا لمقارنة قوة التفاعل عبر بروابط وهذه العملية من الجميع حدودا البروتين. لتعزيز الإشارات إلى الضجيج في قياساتنا، هذا البروتوكول يتطلب الدقة المتزايدة في جميع الخطوات، ويرد هنا لتمكين تنفيذ استنساخه.

Introduction

مستقبلات جانب G-بروتين (GPCRs) هي مستقبلات سبعة الغشاء. الجينوم البشري يحتوي على وحده ما يقرب من 800 الجينات الترميز لGPCRs، والتي يتم تفعيلها من خلال مجموعة متنوعة من بروابط بما في ذلك الضوء، عطر، والهرمونات، والببتيدات، والمخدرات، وغيرها من الجزيئات الصغيرة. ما يقرب من 30٪ من جميع الأدوية الموجودة حاليا في GPCRs السوق المستهدفة لأنها تلعب دورا كبيرا في العديد من الحالات المرضية 2. وعلى الرغم من عقود من العمل المكثفة التي بذلت على هذه العائلة المستقبلة، لا تزال هناك أسئلة معلقة كبيرة في هذا المجال، خاصة فيما يتعلق الآليات الجزيئية التي تدفع التفاعلات النوع من الاختزال المستجيب. حتى الآن، تم نشر واحدة فقط التركيب البلوري عالية الدقة، وتوفير نظرة ثاقبة على التفاعل بين مستقبلات β 2 الأدرينالية (β 2 -AR) والبروتين غس 3. جنبا إلى جنب مع بحوث واسعة النطاق في العقود الثلاثة الأخيرة، وتكرر العنصر الهيكلي معين واحد هو أن حاسمة في هذاالتفاعل: وGα فرعية محطة سي. هذا الهيكل هو مهم لكلا تنشيط بروتين G من قبل هذه العملية من 4 و G اختيار البروتين 5-6. وبالتالي، توفر Gα سي صول رابط حيوي بين التحفيز يجند لهذه العملية من وانتقائية تنشيط بروتين G.

الأبحاث على مدى العقد الماضي تشير إلى أن GPCRs ملء المشهد بتكوين واسع، مع يجند ملزمة استقرار مجموعات فرعية من التشكل النوع من الاختزال. في حين أن العديد من التقنيات، بما في ذلك البلورات، NMR ومضان الطيفي، وقياس الطيف الكتلي المتاحة لدراسة المشهد بتكوين النوع من الاختزال، هناك قلة من النهج لتوضيح أهمية وظيفية في اختيار المستجيب 7. هنا، ونحن الخطوط العريضة لنهج المستندة Fӧrster نقل الطاقة الرنين (الحنق) للكشف عن G-بروتين انتقائية التشكل النوع من الاختزال. تعتمد الحنق على القرب والتوجه الموازي اثنين fluorophores مع تداخل الانبعاثات (المانحة) لالثانية الإثارة (متقبل) الأطياف 8. كما تأتي المانحة ومتقبل fluorophores أقرب معا نتيجة إما تغيير متعلق بتكوين في البروتين أو تفاعل البروتين البروتين، والحنق بينهما يزيد، ويمكن قياسها باستخدام مجموعة من الأساليب 8. وقد استخدمت أجهزة الاستشعار القائم على الحنق على نطاق واسع في مجال النوع من الاختزال 9. تم استخدامها لتحقيق التغييرات التشكل في هذه العملية من خلال إدخال المانحة ومتقبل في حلقة الخلايا الثالثة وهذه العملية من محطة سي. وقد تم تصميم أجهزة استشعار للتحقيق في هذه العملية من والتفاعلات المستجيب من وصفها بشكل منفصل النوع من الاختزال والمستجيب (بروتين G مفارز / arrestins) مع زوج الحنق 10؛ بعض أجهزة الاستشعار أيضا اكتشاف التغيرات متعلق بتكوين في بروتين G 11. وقد مكنت هذه الحساسات مجال لطرح العديد من الأسئلة العالقة بما في ذلك التغيرات متعلق بتكوين في هذه العملية من والمستجيب، هذه العملية من المستجيب حركية التفاعل، وبروابط تفارغي 12. مجموعتناكان مهتما بشكل خاص في خلق جهاز الاستشعار البيولوجي والتي قد كشف G-بروتين معين التشكل النوع من الاختزال في ظل ظروف يحركها ناهض. ويعتمد هذا جهاز الاستشعار البيولوجي على التكنولوجيا التي تم تطويرها مؤخرا اسمه نوبة (منهجية البروتين تقارب قوة التحوير) 13. ويشمل التشنج الربط التفاعل المجالات البروتين باستخدام ER / ك رابط، التي تسيطر على تركيزات على نحو فعال. المرافقة رابط مع زوج الحنق من fluorophores يخلق الأداة التي يمكن أن يقدم تقريرا عن حالة التفاعل بين البروتينات 12. قبل 1 تم استخدام وحدة التشنج إلى حبل على Gα C-محطة لالنوع من الاختزال ورصد تفاعلاتها مع fluorophores الحنق، mCitrine (المشار إليها في هذا البروتوكول من قبل البديل في المعروف، البروتين أصفر نيون (YFP)، الإثارة / ذروة الانبعاثات في 490/525 نانومتر) وmCerulean (المشار إليها في هذا البروتوكول من قبل والذي يعرف عادة البديل البروتين سماوي نيون (CFP)، الإثارة / ذروة الانبعاثات 430/475 نانومتر). من N- لمحطة سي، تيله المشفرة وراثيا ببتيد واحد يحتوي على: كامل طول النوع من الاختزال، الحنق متقبل (mCitrine / YFP)، و 10 نانومتر ER / ك رابط، الحنق المانحة (mCerulean / CFP)، والببتيد Gα محطة سي. في هذه الدراسة، ويختصر أجهزة الاستشعار التي النوع من الاختزال-رابط طول Gα الببتيد. يتم فصل جميع المكونات من قبل غير منظم (الغليسين-سر-الغليسين) 4 رابط والتي تمكن دوران حر من كل مجال. توصيف مفصل لهذه المجسات وقد سبق القيام بها باستخدام اثنين GPCRs نموذجية: β 2 -AR وأوبسين 1.

وtransfected هذا الاستشعار عابر في الخلايا كلوة-293T والقائم على التألق يعيش تجارب الخلايا قياس مضان أطياف الزوج الحنق في وحدات التعسفي من التهم في الثانية (CPS) في وجود أو عدم وجود يجند. وتستخدم هذه القياسات لحساب نسبة الحنق بين fluorophores (YFP ماكس / CFP كحد أقصى). ثم يتم احتساب أي تغيير في الحنق (ΔFRET) بطرح متوسط ​​نسبة الحنقالعينات غير المعالجة من نسبة الحنق من عينات يجند المعالجة. ΔFRET يمكن مقارنتها عبر بنيات (β 2 -AR 10 نانومتر Gαs الببتيد مقابل بيتا 2 -AR 10 نانومتر أي الببتيد). هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتعبير عن هذه المجسات في الخلايا كلوة-293T الحية، ورصد التعبير عنها، وإعداد وتنفيذ وتحليل الخلية الحية القائمة على التألق الحنق قياس دون علاج مقابل شروط المخدرات المعالجة. في حين أن هذا البروتوكول هو محدد لنانومتر Gαs استشعار الببتيد β 2 -AR 10 تعامل مع 100 بيطرطرات ميكرومتر ايزوبروتيرينول، فإنه يمكن أن يكون الأمثل لمختلف أزواج النوع من الاختزال-Gα وبروابط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحمض النووي

  1. استشعار تصميم يبني باستخدام نظام الاستنساخ وحدات. يرجى الرجوع إلى β 2 -AR تصميم أجهزة الاستشعار مفصل من قبل 1.
  2. تحضير الحمض النووي وفقا لبروتوكول تجاري عدة miniprep وأزل في 2 حل ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8، في ≥ تركيز 750 نانوغرام / ميكرولتر، A 260/280 من 1،7-1،9، A 260/230 من 2،0 حتي 2،29.

2. خلية التحضير الثقافة

  1. ثقافة الخلايا كلوة-293T-FLP ن في DMEM تحتوي على 4.5 غرام / لتر مد الجلوكوز، على أن تستكمل مع 10٪ FBS (المعطل الحرارة) (ت / ت)، 1٪، الجلوتامين ملحق، 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5 في 37 ° مئوية في جو مرطب على 5٪ CO 2. التعامل مع الخلايا في غطاء السلامة البيولوجية لخطوات لاحقة.
  2. تسمح للخلايا أن تنمو إلى أحادي الطبقة متموجة قبل الركض في أطباق ستة جيدا. الوقت لتحقيق confluency يعتمد على كثافة الطلاء الأولي. استخدام لوحات التيتأتي إلى confluency ضمن 1-2 أيام من الطلاء لمدة ستة جيدا الطلاء. طبق تعامل ثقافة متكدسة 10 سم الأنسجة لديها كثافة الخلايا ما يقرب من 4 × 10 6 خلية / مل. انظر الشكل رقم 1 لصورة نمو ثقافة الخلية.
  3. غسل الخلايا مع 10 مل في برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين مع التربسين 0.25٪ (انظر مناقشة، الفقرة 2). لوحة 8 × 5 10 خلايا / جيد في 2 مل من وسائل الاعلام في زراعة الأنسجة المعاملة ستة أطباق جيدا، والسماح لتنضم ل16-20 ساعة.

3. شروط ترنسفكأيشن

  1. ارباك تعداء للبنيات التي قد تتطلب كميات مختلفة من الوقت لتحقيق أقصى قدر من التعبير (بين 20 - 36 ساعة). مزامنة الظروف لفترة تجربة موحد. لدينا أيضا السيطرة untransfected جيدا في كثافة الخلايا تعادل لاستخدامها الضوضاء في الخلفية والطرح تشتت أثناء التحليل.
  2. جلب الكواشف ترنسفكأيشن إلى درجة حرارة الغرفة: انخفاض وسائل الإعلام في الدم، الحمض النووي، وترنسفكأيشن الكاشف.
  3. فيغطاء السلامة البيولوجية الجمع بين الكواشف في أنبوب microcentrifuge العقيمة في الترتيب التالي: مزيج 2 ميكروغرام الحمض النووي مع 100 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل. ارتفاع 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى مزيج سائل الإعلام / الحمض النووي دون لمس سطح خليط أو الجانب من الأنبوب. إعداد رد فعل ترنسفكأيشن واحد لكل بئر. شروط ترنسفكأيشن يمكن أن يكون الأمثل (1-4 ميكروغرام من الحمض النووي، 3-6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن) لتحقيق مستويات التعبير متسقة. انظر الجدول رقم 1 لنسب أكثر الأمثل.
  4. احتضان الخليط في RT في غطاء السلامة البيولوجية ل15-30 دقيقة. لا تستخدم رد فعل إذا ما تركت لاحتضان لمدة أكثر من 30 دقيقة.
  5. إضافة رد الفعل إلى الخلايا بطريقة قطرة من الحكمة كذلك عبر ويهز بلطف ستة جيدا لضمان خلط دقيق. إضافة رد فعل واحد لكل بئر.
  6. بعد 20 ساعة من التعبير، ورصد مضان باستخدام زراعة الأنسجة مضان المجهر. تقييم التعبير السكان مع 10X توطين موضوعي والبروتين في الخلية في 40X. طب التوليدerve للتعبير البروتين في غشاء البلازما (بعد الظهر). إذا لاحظت استيعاب كبير، ومراقبة ترنسفكأيشن حتى يتم الكشف عن التعبير كبيرا في PM.

4. الكاشف وإعداد المعدات

  1. إعداد 100 سهم المخدرات ملم ومخزن في -80 ° C: بيطرطرات ايزوبروتيرينول (100 ملم في DH 2 O يحتوي على 300 ملي حمض الاسكوربيك). جعل على الجليد / في غرفة باردة، وفلاش للتجمد فورا. قسامات يمكن إجراء وتستخدم ما يصل الى سنة واحدة.
  2. إعداد العازلة الخليوي (~ 2 مل / حالة) وتخزينها في 37 درجة مئوية الماء الحمام. جعل الطازجة كل يوم. إشارة الجدول رقم 2 للخلية مكونات العازلة.
  3. إعداد العازلة المخدرات (10 مل)، وتخزين في درجة حرارة الغرفة. إشارة الجدول رقم 2 للمكونات العازلة المخدرات.
  4. حامض يغسل cuvettes باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز. تحييد مع قاعدة ضعيفة (1 M KOH)، ويغسل جيدا cuvettes مع DH 2 O.
  5. إعداد محطة عمل حول التألق مع عدةصناديق من 10، 200، و 1،000 نصائح ميكرولتر ماصة، الموقت مع مجموعة العد التنازلي 10 دقيقة، وهو خط فراغ يمكن الوصول إليها مع نصائح لتنظيف كفيت، وتقضي مهمة حساسة، وزجاجة بخ مع عالى النقاء H 2 O.
  6. تسخين ماء الحمام الخارجي لالتألق والحرارة كتلة إلى 37 درجة مئوية.
  7. بدوره على التألق. وضع برنامج لجمع مضان لجمع CFP إلى الإثارة 430 نانومتر، ممر الموجة 8 نانومتر. مجموعة انبعاث 450 نانومتر - 600 نانومتر، ممر الموجة 4 نانومتر. لجمع YFP فقط عن مراقبة أجهزة الاستشعار (انظر مناقشة) مجموعة الإثارة إلى 490 نانومتر، ممر الموجة 8 نانومتر، ومجموعة الانبعاثات 500-600 نانومتر، ممر الموجة 4 نانومتر. وسوف تستخدم إعدادات جمع CFP للحصول على الطيف الحنق في هذه التجربة.
  8. وضع اثني عشر 1.5 مل أنابيب microcentrifuge في كتلة الحرارة كما هو مبين في الشكل 2 أدناه. هذه الأنابيب هي أصحاب الأنابيب خلية قسامة (500 ميكرولتر أنابيب microcentrifuge.) ضع قطعة صغيرة من الأنسجة في أصحاب 1 و 7 لتخفيف cuvettes وضعها هنا.
    ملاحظة: استخدام cuvettes منفصلة عن حالة غير المعالجة وحالة المخدرات لمنع انتقال التلوث.

الشكل 2
الشكل 2. microcentrifuge لأنبوب إعداد والمرجعي الوظيفة في حرارة كتلة كوفيت للعينات غير المعالجة في الموضع 1؛ أنابيب الخلايا قسامة هي في مناصب 2 - 6. كوفيت لعينات المخدرات المعالجة هي في موقف 7؛ أنابيب الخلايا قسامة هي في مواقف 8 - 12. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. ملء أصحاب 2-6 و8-12 مع ~ 750 ميكرولتر من الماء لخلق مصغرة 37 ° C حمام الماء.
  2. وضع 500 عشرة أنابيب microcentrifuge ميكرولتر لقسامات الخلية إلى حمامات المياه مصغرة (أصحاب 2-6، 8-12). وسيكون لكل أنبوب يكون تكرار الفردي للحالة (5 untreateد، 5 المخدرات المعالجة).
  3. مراقبة الخلايا للتعبير (راجع الخطوة 3.6).

5. تجربة وجمع البيانات

الشكل (3)
الشكل 3. التجريبية التخطيطي. دليل مفصل خطوة حكيمة لالتجريبية إعداد والتنفيذ. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إشارة الشكل 3 لالتخطيطي التجريبية. عندما الخلايا جاهزة للحصاد، على أساس التعبير البروتين الكشف مع المجهر مضان (انظر مناقشة، الفقرة 4): في غطاء السلامة البيولوجية، وإزالة بلطف ~ 1 مل من وسائل الاعلام، وخلايا resuspend في ثقافتهم مع P1،000 ونقل إعادة تعليق في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    ملاحظة: تجنب استخدام التربسين لأنها قد هضم N-محطة و/أو جيب من أجهزة الاستشعار لهذه العملية من ملزمة.
  2. عد الخلايا لضمان كثافة الخلايا السليمة في إعادة تعليق. تحسين حجم إعادة تعليق لمدة 4 × 10 6 خلية / مل.
  3. تدور الخلايا في الدلو المتأرجح أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 290 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف بعد الطرد المركزي.
  4. و resuspend بلطف الخلايا في 1 مل العازلة الخليوي (المخزنة عند 37 درجة مئوية) وكرر الخطوة 5.3. خلال تدور الثاني، وجمع 100 ملم قسامة الأسهم المخدرات من -80 درجة مئوية. جعل 1: 100 التخفيف في مخزن المخدرات عن 1 ملم الأسهم العمل والحفاظ على RT.
  5. بعد الطرد المركزي الثاني، وإزالة وطاف Resuspend الخلايا برفق في 1 مل من الاحتياطي الخليوي (4 × 10 6 خلية / مل). قياس OD 600 من العينة في معمل باستخدام 1 مل من الخلايا و1 مل من الاحتياطي خلية كما فارغة. الاستغناء الخلايا في كوفيت البلاستيك القابل للتصرف ونقل مرة أخرى إلى أنبوب microcentrifuge مباشرة بعد الطيفي.
  6. من أجل السيطرة على سل untransfectedl حالة الطيف، و resuspend بلطف خلايا untransfected في الواق 1 مل الخليوي مع P1،000 الماصة، إضافة 90 ميكرولتر من الخلايا لكفيت والحصول على الطيف الحنق في الإثارة 430 نانومتر، ممر الموجة 8 نانومتر، والانبعاثات 450-600 نانومتر، ممر الموجة 4 نانومتر. جمع 3-5 تكرار الأطياف مع الطازجة 90 ميكرولتر من الخلايا. الحفاظ على المخزون من الخلايا عند 37 درجة مئوية بين المواصفات، و resuspend بلطف مع P1،000 بين كل قسامة عينة، وشطف كفيت مع عالى النقاء H 2 O بين العينات.
  7. لظروف تجريبية، قسامة 90 ميكرولتر من خلايا transfected إلى كل من 500 أنابيب ميكرولتر في أصحاب 2-6، 8-12 في كتلة الحرارة. و resuspend بلطف الأسهم من الخلايا مع الماصة P1،000 بين كل قسامة.
  8. بعد aliquoted الخلايا، إضافة 10 ميكرولتر من الاحتياطي المخدرات لأنابيب 2-6 للعينات حالة غير المعالجة.
  9. تبدأ التجربة من خلال إضافة 10 ميكرولتر من 1 ملم حل المخدرات في أنبوب 8، بدء موقت العد التنازلي من 10 دقيقة، وبلطف مزيج أنبوب مع P200 الماصة. أنبوب الوثيق والعودة إلى 37° C كتلة الحرارة.
  10. اختيار فورا أنبوب 2، المزيج بلطف مع P200 (استخدام معلومات جديدة)، إضافة 90 ميكرولتر من التعليق الخلية إلى حالة غير المعالجة كفيت، ومكانها في التألق.
  11. الحصول على الطيف الحنق في الإثارة 430 نانومتر، ممر الموجة 8 نانومتر، والانبعاثات 450-600 نانومتر، ممر الموجة 4 نانومتر.
  12. في 9 دقيقة - 10 ثانية، وارتفاع أنبوب 9 مع 10 ميكرولتر من 1 ملم حل المخدرات، بلطف مزيج مع P200 (استخدام معلومات جديدة)، والعودة أنبوب للحرارة كتلة.
  13. كرر الخطوات 5،10-5،11 مع أنبوب 3 و 5.12 مع أنبوب 10.
  14. كرر الخطوات 5،10-5،13 في 1 فترات دقيقة (08:10، 07:10، الخ) حتى يتم جمع الأطياف لجميع العينات حالة غير المعالجة، وتمت إضافة دواء لجميع العينات حالة المخدرات. استخدام معلومات سرية جديدة كل خطوة الماصة لمنع انتقال التلوث.
  15. في 5 دقائق - 10 ثانية، ويبدأ خلط أنبوب 8 (حالة المخدرات) بلطف مع P200 الماصة، إضافة 90 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كوفيت منفصلة لعينة المخدرات المعالجة ومكان في التألق.
  16. الحصول Fالطيف RET (راجع الخطوة 5.11 لإعدادات).
  17. كرر الخطوات 5،15-5،16 في 1 فترات دقيقة (04:10، 03:10، الخ) لالمتبقية عينات حالة المخدرات (أنابيب 9-12).
  18. بعد انتهاء التجربة، وحفظ ملفات المشاريع، اغسل cuvettes مع عالى النقاء H 2 O، وإعادة الأوراق المالية أنابيب للحالة القادمة. الحرص على منع انتقال التلوث في الخطوة غسل. تغيير تلميح على زجاجة O H 2، وكذلك على خط فراغ بين يغسل.

تحليل 6. البيانات

  1. حفظ الملفات وتصدير البيانات في شكل SPC لاستخدامها في التحليل. غير متوفرة للتنزيل من نشر موقع سيفاراماكريشنان مختبر برامج التحليل.
  2. إنشاء ملفات مسار برامج التحليل والتي تشمل برامج التحليل (V9، V15)، ملفات عينات untransfected (راجع الخطوة 5.6 لجمع خلية الطيف untransfected)، ملف بيانات الناتج، والقيم مفصولة بفواصل ملفات (CSV) لإدخال البيانات.
  3. أدخل المعلومات التاليةفي ملف CSV (انظر العينة في الجدول 3) وتعيين الشروط الخاصة بكل عينة، بما في ذلك:
    اسم الملف - الفردية الملفات الرسم البياني SPC
    مستقبلات - تم اختبار المكلف الذي بناء النوع من الاختزال (على سبيل المثال، Β2)
    بيندر - المكلف الذي تم اختباره الببتيد البديل للبناء (على سبيل المثال، S)
    ناهض - تعيين دون علاج (N) أو (D) شروط المخدرات المعالجة
    الدليل - المجلد المسار الذي يتم حفظ ملفات SPC، التي نظمتها التاريخ عادة
    OD - سجلت كثافة ضوئية من عينة من معمل
  4. أدخل أسماء الملفات لعينات untransfected (الخطوة 5.6) إلى طرح العازلة ونثر الضوضاء من العينات.
  5. أدخل شروط في برنامج التحليل.
  6. برامج تشغيل لتحليل العينات في غضون الظروف الفردية (V9) وعبر الشروط (V15).
  7. استبعاد ملفات العينة التي هي القيم المتطرفة واضحة في مجموعة البيانات، أو ضبط الطرح عن طريق زيادة أو خفض قيمة OD من indiviالملفات المزدوجة.
  8. تصدير البيانات إلى ملف الإخراج للوصول إلى حساب الحنق نسب (525 نانومتر / 475 نانومتر).
  9. حساب ΔFRET بطرح متوسط ​​نسبة الحنق لحالة غير المعالجة من نسب الحنق الفردية للتعامل (المخدرات) الظروف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التخطيطي المعمم من التجربة انشاء ومفصلة التنفيذ في الشكل (3).

من أجل الكشف عن تغيير الحنق في النطاق الديناميكي الضيق من أجهزة الاستشعار، فمن الأهمية بمكان أن تلتزم الفروق الدقيقة في النظام يجب الالتزام بها. جودة خلية أمر حتمي لتعبير البروتين وكذلك الاتساق في أخذ العينات الشكل 1 ملامح الصور من الخلايا المستزرعة تنمو في أحادي الطبقة متناسقة (10X) التي هي الأمثل لتصفيح ستة جيدا وترنسفكأيشن الشكل 1 (أ) والخلايا نموا في أنماط تجمعت التي تؤدي إلى الأشكال الجذعية الشكل 1 (ب) التي لا ينصح لطلاء ثابت. ويمكن أيضا أن يكون الأمثل الظروف ترنسفكأيشن من أجل تحقيق التكاثر. وقد تم تحسين العديد من الشروط للكاشف ترنسفكأيشن أوصى المستخدمة هنا. الجدول 1 تفاصيل هذه الشروط لخفض وسائل الاعلام المصل. الحمض النووي، وترنسفكأيشن الجرميةنسب جنت.

مرة واحدة وقد تم جمع كافة البيانات وإدخال البيانات في ملف CSV للتحليل (انظر العينة في الجدول 3)، والنتائج التي سوف تشبه البيانات أطياف الخام الحنق هو مبين في الشكل (4) (أ) وتطبيع، يعني الحنق الأطياف هو مبين في الشكل 4 (ب). في الشكل 4 الأطياف الحمراء هي عينات غير المعالجة والأزرق هي عينات المخدرات المعالجة. جميع الأطياف الخام الحنق في الشكل 4 (أ) لديها ما يكفي من مجموعة الإشارة إلى الضوضاء لتحليل البيانات ثابت (أي، CPS في 450 نانومتر مقارنة CPS في 475 نانومتر). مع هذا النطاق، أطياف أكثر سلاسة وذروة المياه من عينة (رامان الذروة هو 500 نانومتر) هو أيضا الحد الأدنى. مستويات التعبير منخفضة تؤدي إلى ذروة المياه بارزة الذي يتداخل مع تحليل البيانات. وتطبيع البيانات في 475 نانومتر، ووضع النيابة العامة من هذه القيمة إلى 1.0 (الشكل 4 (ب)). في هذه المجموعة البيانات ل-AR β 2-10 نانومتر Gαs استشعار الببتيد، هناك تغيير كبير في نانومتر 525 قراءة ما بين غير المعالجة (الحمراء)، والتعامل مع (الأزرق) العينات. ويتم احتساب تغيير ΔFRET من نسب الحنق (525 نانومتر / 475 نانومتر) من هذه مجموعات البيانات ويمكن الوصول إليها من خلال ملف الإخراج.

إذا تعبير البروتين منخفضة، هناك ضعف كفاءة ترنسفكأيشن، أو منخفضة الكثافة خلية في كفيت للقراءة مضان، قد تظهر أطياف نويصر، كما هو مبين في الشكل (5). وبالمقارنة مع الشكل 4 (أ) نطاق الإشارة إلى الضوضاء لهذا مجموعة البيانات ليست مثالية، ففي حوالي 1.0 - 1.6، مع حد أقصى CPS من 4 × 10 5 هذا مستوى التعبير منخفضة يساهم في أطياف خشنة ينظر في الشكل البيانات الخام 5 (أ)، ولكن البيانات هو ضيق وقادرة على أن تكون تطبيع الشكل 5 (ب). على الرغم من أن القمم المياه (~ 500 نانومتر) لا يصطف تماما بين مجموعات البيانات الشكل 5 (ب) هذه السابقملصقة لا تزال صالحة للاستعمال لتحليل الشكل 6 هو ممثل التجربة التي هي غير كافية للتحليل. في حين أن الإشارات إلى الضجيج من العينة حوالي 2-3 للتعامل (الأزرق) و (الحمراء) غير المعالجة عينات، كثافة خلية في كفيت عبر عينات منخفضة جدا (450 قيمة نانومتر 1 × 10 5) الشكل 6 ( أ). وهذا يخلق مشكلة في خلفية الطرح والتطبيع الشكل 6 (ب) وأطياف لا محاذاة. يمكن تعديل الطرح للعينات عن طريق زيادة أو خفض OD في الجدول 3. ولكن، حتى مع كثافة الخلايا منخفضة، ذروة المياه (~ 500 نانومتر) لتصبح أكبر من ذلك بكثير وضجيج الشكل 6 (ج) ويمنع هذه البيانات مجموعة من مزيد من التحليل.

شكل 1
الشكل 1. مثال على نمو الخلايا مثقف. الخلايا تنمو في أحادي الطبقة (أ) تعتبر مثالية لطلاء ثابت وترنسفكأيشن. الخلايا التي يبدو أن تنمو في كتل أو مع أنماط شجيري (ب) لا يجوز لوحة وباستمرار في ست آبار، قد عرض ضعف كفاءة ترنسفكأيشن، ويمكن أن تخلق تناقضات في اتساع الطيف الحنق. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. تحليل البيانات الممثل لβ 2 -AR 10 نانومتر Gαs الببتيد ± المخدرات. صورة الممثل من البيانات الخام (أ) وتطبيع، وبلغ متوسط ​​البيانات (ب) التي تم جمعها مع β 2 -AR 10 نانومتر Gαs الببتيد الاستشعار مع (أحمر) غير المعالجة عينات والمعالجة (الأزرق) ق amples بعد حضانة لمدة 5 دقائق مع 100 ميكرومتر ايزوبروتيرينول بيطرطرات. ماكس CFP الانبعاثات في 475 نانومتر، YFP الانبعاثات كحد أقصى في 525 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. تحليل التعبير بروتين الفقراء مع الخام والبيانات تطبيع. صاخبة الخام أطياف البيانات (أ) هي نتيجة لانخفاض مستويات التعبير، وانخفاض كثافة الخلية لكل عينة، و / أو ضعف كفاءة ترنسفكأيشن من بناء. هذه مجموعة البيانات لا تزال للتفسير كما تطبيع (ب)، على الرغم من أنها ليست مثالية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

= "1"> الشكل (6)
الشكل 6. تحليل منخفضة الكثافة خلية في التألق كوفيت مع الخام والبيانات تطبيع مجموعات، وانخفاض كثافة الخلية لكل عينة، وينظر في البيانات الخام (أ) يعقد المياه / الطرح الخلفية (ب، ج)، ويجعل هذا مجموعة البيانات uninterpretable. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

شرط 0.5X 0.7X 1X 2X 2X *
الحمض النووي 1 ميكروغرام 1.4 ميكروغرام 2 ميكروغرام 4 ميكروغرام 4 ميكروغرام
وسائل الاعلام المصل انخفاض 100 ميكرولتر 70 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 200 ميكرولتر
ترنسفكأيشن الكاشف 3 ميكرولتر 4.2 ميكرولتر 6 ميكرولتر 6 ميكرولتر 12 ميكرولتر
* ملاحظة: أوصت لبناء صعبة للغاية. يجب اتخاذ الحذر، ويستحث هذا الشرط عالية موت الخلايا.

الجدول 1. شروط ترنسفكأيشن. ويشمل هذا الجدول الظروف الأمثل من الكواشف لتعداء إلى 2 مل الآبار من خلايا كلوة-293T باستخدام كاشف ترنسفكأيشن الموصى بها.

العازلة خلية
الصوت كاشف تعليقات
9 مل عالى النقاء الدناز / ريبونوكلياز المياه مجانا
1 مل مسح ميزانية الأسرة (10X)، ودرجة الحموضة 7.4، مخزن في 4 درجات مئوية:
200 ملي HEPES
50 ملي بوكل
450 مم كلوريد الصوديوم
20 ملي CaCl 2 - H 2 O
10 ملي MgCl 2 - H 2 O
100 ميكرولتر 20٪ D-الجلوكوز
15 ميكرولتر أبروتينين (1 ملغ / مل في DH 2 O) منع تدهور
15 ميكرولتر leupeptin (1 ملغ / مل في DH 2 O) منع تدهور
100 ميكرولتر حمض الاسكوربيك (100 ملم في DH 2 O) * استقرار ناهض
* إضافة فورا قبل البدء في فحص
مخزن المخدرات
الصوت كاشف تعليقات
9 مل عالى النقاء الدناز / ريبونوكلياز المياه مجانا
1 مل مسح ميزانية الأسرة (10X)، ودرجة الحموضة 7.4، مخزن في 4 درجات مئوية:
200 ملي HEPES
50 ملي بوكل
450 مم كلوريد الصوديوم
20 ملي CaCl 2 - H 2 O
10 ملي MgCl <فرعية> 2 - H 2 O
100 ميكرولتر حمض الاسكوربيك (100 ملم في DH 2 O) * استقرار ناهض
* إضافة فورا قبل البدء في فحص

الجدول 2. مكونات العازلة. تفاصيل هذا الجدول الكواشف المستخدمة لجعل كل خلية الواق الواق والدواء للاستخدام في التجربة. جعل كل مخازن جديدة كل يوم من التجربة. مخزن مخزن خلية عند 37 درجة مئوية، ومخزن المخدرات في درجة حرارة الغرفة.

الجدول 3

الجدول 3. عينة من ملف CSV للتحليل. ويبرز هذا ملف بيانات عينة دخول تعيين بعد تجربة واحدة. تجارب متعددة يمكن إدخالها في نفس الملف CSV ويمكن تمييزها تحت عمود "جمعي" إذا لزم الأمر. كليجب ملء الصفوف بها مع المعلومات التالية:
اسم الملف - الفردية SPC ملفات الرسم البياني مستقبلات - المكلف الذي تم اختبار هذه العملية من بناء (على سبيل المثال، Β2)
بيندر - المكلف الذي تم اختباره الببتيد البديل للبناء (على سبيل المثال، S)
ناهض - تعيين دون علاج (N) أو (D) شروط المخدرات المعالجة
الدليل - المجلد المسار الذي يتم حفظ ملفات SPC، التي نظمتها التاريخ عادة
OD - سجلت كثافة ضوئية من العينة في معمل
الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النطاق الديناميكي ضيق قياسات الحنق في هذا النظام يعزز ضرورة مراقبة الجودة الحساسة في كل خطوة من هذا البروتوكول. أهم الخطوات لضمان تجربة الحنق الناجحة هي 1) خلية زراعة، 2) ترنسفكأيشن 3) التعبير بروتين و 4) في الوقت المناسب، والتنسيق الدقيق أثناء تنفيذ الفحص.

صحة الخلايا وجودة الصيانة / الطلاء يمكن أن يكون لها تأثير كبير على الضوضاء إشارة إلى النظام التجريبي واعتلال الصحة خلية يمكن أن تجعل من المستحيل للكشف عن أي تغيير المستمر في الحنق. متحفظ، الخلايا هي أصح ما يقرب من 20 الممرات، على الرغم من أن هذا قد تختلف بناء على خط الخلية، والمناولة، والظروف والثقافة. مرة واحدة لديها خلايا صعوبة تنمو كما أحادي الطبقة متموجة، أو تبدأ المتزايد باستمرار في أكثر أنماط شجيري (انظر الشكل 1 (ب))، والضوضاء الخلفية التجريبي سوف تتأثر سلبا. صيانة الخلية دقيق، بما في ذلك ميدي الروتينيالتغييرات وبانتظام إزالة الخلايا غير ملتصقة والحطام من لوحات الصيانة، وتحسين نوعية الخلايا للتصفيح ستة جيدا وتعداء. كتل الخلايا، والتي تؤثر سلبا على كفاءة ترنسفكأيشن، يمكن فصلها بشكل فعال في الخلايا الفردية من قبل trypsinization لوحات الصيانة: علاج 10 سم أطباق متموجة مع 10 مل من 0.25٪ التربسين لمدة 30 ثانية، وإزالة التربسين ولكن ترك ما يقرب من 200 ميكرولتر، مكان طبق في 37 ° C حاضنة لل2-3 دقيقة. وخلايا تؤتي ثمارها طبق بسهولة جدا وأقل عرضة للتكتل.

فمن الأهمية بمكان لتحسين الخطوة ترنسفكأيشن لهذه التجربة. يجب أن يكون ستة آبار مثالي 60-80٪ متموجة لترنسفكأيشن كفاءة والتعبير الأمثل. إذا انضمت خلايا قليلة جدا (<60٪)، وانتظر ما يقرب من 2-6 ساعة ل transfect، أو حتى يتم الالتزام لا يقل عن 70٪ من الخلايا. سوف ست سنوات الآبار التي هي أكثر من متكدسة (> 80٪) أيضا تقليل كفاءة ترنسفكأيشن. Transfecting في أقلconfluency خلية يزيد معدل موت الخلايا. تركيز الحمض النووي والنقاء هي أيضا حرجة (انظر الخطوة 1.2). باستخدام تركيز منخفض و / أو ضعف الاستعدادات الحمض النووي الجودة تؤثر سلبا على كفاءة ترنسفكأيشن يمكن تعديل الشروط ترنسفكأيشن في بناء، والرجوع إلى الجدول رقم 1 لمزيد من المعلومات.

رصد دقيق وثابت من التعبير البروتين باستخدام مضان المجهر الأنسجة الثقافة هو خطوة حاسمة أخرى في هذه العملية. على الرغم من هذه الخطوة تخضع لحكم الفرد، فمن الممكن استخدام تقنيات أخرى، مثل المجهر، لمراقبة التعبير على مر الزمن من الناحية الكمية، على الرغم من أنها ليست مفصلة هنا. ليبني لدينا اختبرت بنجاح في نظامنا، والتعبير يستغرق حوالي 18-36 ساعة للوصول إلى التعبير الأمثل. في تجربتنا، ويبني أن عرض الفقراء التعبير خلال هذه النافذة الوقت نادرا ما تتحسن بعد 40 ساعة. يبني نشرنا مع لم تظهر علامات degradatioن، ولكن هذا قد يكون مشكلة بالنسبة لبعض GPCRs. لدينا في المقايسات، وتدهور استشعار من الممكن في بعض الأحيان ترنسفكأيشن أكثر من 30 ساعة. ويمكن اختبار سلامة استشعار باستخدام نسب YFP / CFP: 525 نانومتر قراءة من (490 نانومتر) الطيف YFP متحمس، و 475 نانومتر القراءة من CFP متحمس (430 نانومتر) الطيف. لالإعدادات، راجع الخطوة 4.6. الموصى بها نسب YFP / الحراجية المعتمدة هي في نطاق 1،7-2،0، مع نسبة مثالية من 1.8. هذه القيمة تعتمد على سطوع أكبر تقريبية شقين من YFP نسبة إلى CFP14. لذا فإن جهاز استشعار لا يتجزأ مع الحد الأدنى من تدهور يحتوي كلا fluorophores ويكون YFP: نسبة CFP ما يقرب من 2: 1. بعد تأكيد جودة أجهزة الاستشعار من المهم تأكيد توطين البروتين والتعبير في غشاء البلازما. هام التعبير داخل الخلايا يمكن أن تكون نتيجة أي من تدهور البروتين، واستيعاب، أو الاتجار المستمر من البروتين. رصد يبني على مر الزمن لمعرفة ما إذا كان تعزيز التعبير في غشاء البلازما. والحرجة المقبلالتحدي كال في التعبير هو الكفاءة ترنسفكأيشن. ما يقرب من 70٪ من الكفاءة + ترنسفكأيشن ضروري لكاف كشف الإشارة إلى الضوضاء في هذا النظام التألق. إذا و transfected أقل من الخلايا، قد يكون المبلغ من إشارة إلى الضجيج لا يزال اكتشافها ولكن لن يكون أقل اتساقا بكثير بين العينات في التجربة الحنق واحد. وهذا يعوق تحليل البيانات دقيقة ضمن النطاق الديناميكي الضيق للنظام. يقدم مستويات التعبير أيضا عقبة كبيرة لتحقيق وافرة إشارة إلى الضجيج أثناء التجربة. مستويات التعبير اكتشافها من قبل التألق، نسبة إشارة بين 475 نانومتر و 450 نانومتر (نثر الخلية) من 1.5 كافية للكشف عن تغيير في الحنق، والتعبير لكن الأمثل لديهم نسبة حوالي 2.0+. للإشارة، يتم جمع البيانات β2-AR في مجموعة الإشارة إلى الضوضاء من 4 × 10 5 CPS (450 نانومتر) إلى 1 × 10 6 CPS (475 نانومتر)، نسبة الإشارة إلى الضوضاء من 2.5. وهذه النسبة يساعد على التقليل من كمية variabiعنه lity بين العينات، التي يمكن أن تؤثر أيضا تحليل البيانات. هذه المستويات التعبير تخضع أيضا لحساسية والمواءمة المثلى للبصريات التألق. قد تتطلب أنظمة أخرى معلمات مختلفة للكاف الأمثل إشارة إلى الضوضاء.

خلايا حساسة للغاية الوقت ودرجة الحرارة. بمجرد بدء إجراء التجارب، التعامل مع لطيف ضروري لتجنب موت الخلايا. ويمكن اتخاذ تدابير لوجستية محددة لتسريع هذه العملية وتجنب الأخطاء في الوقت المناسب بما في ذلك إعداد محطة العمل، والتأكد من جميع المعدات تعمل بشكل صحيح، وتخطط من أهداف التجربة مسبقا. وهو مثالي لاستخدام الخلايا خلال 30 دقيقة من الحصاد، وفي نظامنا، يتم تنفيذ هذا البروتوكول في غضون 20 دقيقة. بمجرد يتقن هذه التقنية، وعلى وجه التحديد الأمثل ترنسفكأيشن والبراعة اليدوية من العملية في حد ذاتها، هذه التجربة يمكن استخدامها لمقارنة مختلف بنيات ضد بعضها البعض، وتوليد جرعة إعادةاالستجابة المنحنيات، وجهاز استشعار يمكن توسيعها إلى بروتين G كامل طول.

على الرغم من أن أجهزة الاستشعار الحنق المستخدم هنا هو تطور فريد من نوعه في أجهزة الاستشعار هذه العملية من الحنق، وتفصيل هذا الإعداد التجريبية محدد كما فحص تتميز جيدا لتنفيذ أجهزة الاستشعار. يسمح الفحص القائمة على التألق عدد كبير من الخلايا التي سيتم تقييمها في كل تجربة ولا تعتمد على البروتين أو الغشاء محضرات النقاء، وبالتالي الحفاظ على البيئة في الجسم الحي. كما تم تحسين هذا التصميم التجريبي للكشف عن تغيرات صغيرة جدا يرى في النظام على التحفيز ناهض من هذه العملية من.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

Acknowledgments

وقد تم تمويل رم من قبل زمالة الجمعية الأمريكية للقلب ما قبل الدكتوراه (14PRE18560010). وقد تم تمويل البحث من قبل جمعية القلب الأمريكية للتنمية عالم غرانت (13SDG14270009) والمعاهد الوطنية للصحة (1DP2 CA186752-01 و1-R01-GM-105646-01-A1) إلى SS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor Addgene 47438 https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Fermentas/Fisher Sci FERK0503 Elute in 2 mM Tris elution buffer
HEK-293T-Flp-n cells Life Technologies R78007
Trypsin (0.25%) Life Technologies 25200056
DMEM- high glucose Life Technologies 11960-044 Warm in  37 °C water bath before use
FBS, certified, Heat inactivated, US origin Life Technologies 10082147
Glutamax I 100x Life Technologies 35050061
HEPES Corning MT25060CL
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media; Bring to RT before use
XtremeGene HP transfection reagenet Roche 6366236001 Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use
FluoroMax 4 Horiba Use with FluorEssence V3.8 software
3-mm path length quartz cuvette Starna NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna
Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump Fisher Scientific 13-874-826 Warm to 37 °C before use
Thermomixer Heat Block Eppendorf 22670000 Warm to 37 °C before use
Ultrapure DNA/RNAse free water Life Technologies 10977015 Use at RT
D(+)-glucose, anhydrous Sigma G5767
aprotinin from bovine lung Sigma A1153
leupeptin hemisulfate EMD 10-897
L-ascorbic acid, reagent grade Sigma A0278
(-)-isoproterenol (+)-bitartrate Sigma I2760 Use fresh aliquot each experiment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
  2. Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
  3. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  4. Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
  5. Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
  6. Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
  7. Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
  8. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  9. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  10. Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
  11. Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
  12. Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
  13. Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 115، لهذه العملية من الإشارات، الحنق، كلوة-293، الخلية الحية، ER / K نوبة رابط، mCerulean، mCitrine، مما يشير يحركها ناهض
موافقات لهذه العملية من G البروتين انتقائية تقاس باستخدام الحنق مجسات في لايف تعليق خلية التألق الفحص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Semack, A., Malik, R. U.,… More

Semack, A., Malik, R. U., Sivaramakrishnan, S. G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay. J. Vis. Exp. (115), e54696, doi:10.3791/54696 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter