Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l'aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
Fӧrster transfert d'énergie par résonance (FRET) à base d'études ont de plus en plus courante dans l'enquête de la signalisation GPCR. Notre groupe de recherche a développé un capteur de FRET intra-moléculaire pour détecter l'interaction entre les sous-unités et les GPCR dans des cellules vivantes après stimulation agoniste Ga. Ici, nous détaillons le protocole pour la détection des changements dans le FRET entre le β 2 adrénergiques et l'extrémité C-terminale Gas peptide lors d'un traitement avec du chlorhydrate d'isoprotérénol 100 uM comme précédemment caractérisé 1. Notre capteur de FRET est un polypeptide constitué en série d'un GPCR de longueur totale, un fluorophore accepteur de FRET (mCitrine), un ER / K SPASME (affinité de la protéine systématique force modulation) de liaison, un fluorophore FRET donneur (mCerulean), et une Ga C peptide -terminale. Ce protocole sera la préparation détaillée de la cellule, les conditions de transfection, la configuration de l'équipement, l'exécution de l'essai et l'analyse des données. Cette conception expérimentale détecte petite changes de FRET indiquant des interactions protéine-protéine et peut également être utilisé pour comparer la force de l'interaction entre les ligands et le GPCR-G paires de protéines. Pour améliorer le rapport signal-bruit dans nos mesures, ce protocole exige une précision accrue dans toutes les étapes, et est présenté ici pour permettre l'exécution reproductible.
Introduction
G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires. Le génome humain contient environ 800 seuls les gènes codant pour des GPCR, qui sont activés par une variété de ligands, y compris la lumière, des agents odorants, des hormones, des peptides, des médicaments et d'autres petites molécules. Près de 30% de tous les produits pharmaceutiques actuellement sur les RCPG cibles du marché , car ils jouent un rôle important dans de nombreux états pathologiques 2. Malgré des décennies de travail considérable effectué sur cette famille de récepteurs, il reste des questions en suspens importantes dans le domaine, en particulier en ce qui concerne les mécanismes moléculaires qui conduisent les interactions GPCR-effectrices. À ce jour, une seule structure cristalline à haute résolution a été publiée, donnant un aperçu de l'interaction entre le β 2 adrénergiques (β 2 -AR) et la protéine Gs 3. En collaboration avec des recherches approfondies au cours des trois dernières décennies, il réitère une composante structurelle spécifique qui est essentiel dans cel'interaction: la sous-unité Ga C-terminale. Cette structure est importante tant pour activation des protéines G par le GPCR 4 et G sélection de protéines 5-6. Par conséquent, le Ga C-terminale fournit un lien essentiel entre la stimulation du ligand de GPCR et l'activation de la protéine G sélective.
Recherche au cours de la dernière décennie suggère que les GPCR peuplent un vaste paysage conformationnel, avec la liaison ligand-stabilisation des sous-ensembles de conformations GPCR. Bien que plusieurs techniques, incluant la cristallographie, la RMN et la spectroscopie de fluorescence, la spectrométrie de masse sont disponibles pour examiner le paysage conformationnel GPCR, il existe peu d'approches pour élucider leur signification fonctionnelle dans le choix des effecteurs 7. Ici, nous décrivons un Fӧrster transfert d'énergie par résonance (FRET) approche à base de détecter G conformations GPCR protéine-sélective. FRET repose sur la proximité et de l'orientation parallèle de deux fluorophores avec chevauchement des émissions (donneur) ae excitation (accepteur) spectres 8. Étant donné que les fluorophores donneur et accepteur sont rapprochés à la suite de chaque changement conformationnel dans la protéine ou une interaction protéine-protéine, le FRET entre eux augmente, et peut être mesurée en utilisant une variété de méthodes 8. Biocapteurs FRET ont été utilisés largement dans le domaine GPCR 9. Ils ont été utilisés pour sonder des changements de conformation dans le GPCR en insérant le donneur et accepteur dans la troisième boucle intracellulaire et RCPG extrémité C-terminale; les capteurs sont conçus pour sonder le GPCR et les interactions effectrices par marquage séparément le GPCR et effecteur (G sous – unités protéiques / arrestine) avec une paire de FRET 10; certains capteurs détectent également les changements conformationnels dans la protéine G 11. Ces biocapteurs ont permis le terrain pour poser une multitude de questions en suspens , y compris des changements conformationnels dans le GPCR et effecteur, GPCR-effectrices cinétiques d'interaction, et les ligands allostériques 12. Notre groupea été particulièrement intéressé par la création d'un biocapteur capable de détecter G conformations GPCR spécifiques de la protéine dans des conditions conduit agoniste. Ce biocapteur repose sur une technologie développée récemment nommée SPASM (systématique force modulation des protéines d'affinité) 13. SPASM implique tethering interagissant domaines protéiques en utilisant un ER / K lieur, qui contrôle leurs concentrations efficaces. Débordement l'éditeur de liens avec une paire de fluorophores FRET crée un outil qui peut signaler l'état de l'interaction entre les protéines 12. Auparavant 1 le module SPASM a été utilisé pour attacher le Ga C-terminale à un GPCR et de surveiller leurs interactions avec les fluorophores FRET, mCitrine (appelé dans ce protocole par sa variante communément connu, Jaune Fluorescent Protein (YFP), excitation / pic d'émission à 490/525 nm) et mCerulean (dénommé dans le présent protocole par sa variante communément appelé Cyan fluorescent Protein (PCP), excitation / pic d'émission 430/475 nm). A partir de N- à C-terminale, tson polypeptide unique codé génétiquement contient: une pleine longueur GPCR, FRET accepteur (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, donneur de FRET (mCerulean / CFP), et le peptide Ga C-terminale. Dans cette étude, les capteurs sont abrégés comme agent de liaison de GPCR-longueur Ga peptide. Tous les composants sont séparés par un non structurée (Gly-Ser-Gly) 4 segment de liaison qui permet une rotation libre de chaque domaine. La caractérisation détaillée de ces capteurs a déjà été réalisée en utilisant deux GPCR prototypiques: β 2 -AR et opsin 1.
Ce capteur est transfecté de manière transitoire dans des cellules HEK-293T et en temps réel des expériences cellulaires mesure des spectres de fluorescence en fonction du fluorimètre, de la paire de FRET en unités arbitraires de coups par seconde (CPS) en présence ou en absence de ligand. Ces mesures sont utilisées pour calculer un ratio de FRET entre les fluorophores (YFP max / CFP max). Un changement de FRET (ΔFRET) est ensuite calculée en soustrayant le ratio moyen de FRETdes échantillons non traités à partir du rapport de FRET d'échantillons de ligand traitée. ΔFRET peut être comparé à travers des constructions (β 2 -AR-10 nm-peptide par rapport ß Gas 2 -AR-10 nm-no peptide). Ici, nous détaillons le protocole d'exprimer ces capteurs dans des cellules vivantes HEK-293T, surveiller leur expression, et la configuration, l'exécution et l'analyse des cellules vivantes à base fluoromètre-FRET mesure pour non traité contre les conditions traitées par le médicament. Alors que ce protocole est spécifique pour le capteur de peptide β nm Gas 2 -Ar-10 traitées avec 100 uM d' isoprotérénol bitartrate, elle peut être optimisée pour les différentes paires de GPCR-Ga et des ligands.
Protocol
Representative Results
Discussion
La gamme dynamique étroite de mesures FRET dans ce système renforce la nécessité d'un contrôle de qualité sensible à chaque étape de ce protocole. Les étapes les plus importantes pour assurer une expérience réussie FRET sont 1) la culture cellulaire, 2) la transfection 3) d'expression de protéines et 4), en temps opportun, une coordination précise lors de l'exécution du test.
la santé cellulaire et la qualité d'entretien / de placage peuvent avoir un impact si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RUM a été financée par l'American Heart Association Fellowship pré-doctoral (14PRE18560010). La recherche a été financée par le développement scientifique Grant American Heart Association (13SDG14270009) et le NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105646-01-A1) SS
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors – added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
