Abstract
Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) çalışmaları GPCR sinyalizasyon soruşturma giderek daha yaygın hale gelmiştir tabanlı. Araştırma grubumuz Gα alt birimlerinin ve agonist stimülasyon takip eden canlı hücrelerde GPCRs arasındaki etkileşimi tespit etmek için bir intra-moleküler FRET sensörü geliştirdi. Burada, ayrıntılı 100 uM izoproterenol hidroklorür ile işlenmesi üzerine β 2-adrenerjik reseptörü ve Gαs C-terminali peptid arasında FRET değişiklikleri tespit etmek için protokol daha önce 1 karakterize edilen. Bizim FRET sensörü, tam uzunlukta bir GPCR, FRET akseptör-floroforu (mCitrine) seri olarak aşağıdakilerden oluşan tek bir polipeptid olup, bir ER / K SPASM (sistematik proteinin afinite gücü modülasyonu) bağlayıcı olarak, bir FRET verici florofor (mCerulean) ve Gα Cı terminal peptid. Bu protokol olacak detay hücre hazırlama, transfeksiyon koşulları, ekipman kurulumu, tahlil yürütme ve veri analizi. Bu deney tasarımı, küçük ch algılarAnges'a FRET protein-protein etkileşimleri göstermektedir ve ayrıca ligandları ve GPCR G proteini eşleşmeleri arasında etkileşim gücünü karşılaştırmak için kullanılabilir. sinyal-gürültü bizim ölçümlerde geliştirmek için, bu protokol her adımda artan hassasiyet gerektirir ve tekrarlanabilir yürütülmesini sağlamak için sunulmuştur.
Introduction
G-proteinine kenetlenmiş reseptörlerin (GPCR'ler) yedi transmembran reseptörlerdir. İnsan genomu tek ışık, koku, hormonlar, peptitler, ilaçlar ve diğer küçük moleküller de dahil olmak üzere, çeşitli ligandlı ile aktive olan GPCR, kodlayan yaklaşık 800 gen içermektedir. Piyasa hedef GPCRs şu anda tüm ilaçların yaklaşık% 30 birçok hastalık durumlarında 2 büyük bir rol oynamaktadır çünkü. Bu reseptör ailesinin üzerinde yapılan kapsamlı çalışmaların yıllardır rağmen, özellikle GPCR-efektör etkileşimleri sürücü moleküler mekanizmaları açısından, alanında önemli seçkin soruları orada kalır. Bugüne kadar, sadece bir yüksek çözünürlüklü kristal yapı β 2 adrenerjik reseptör (β 2-AR) ve Gs proteini 3 arasındaki etkileşim içgörü sağlayarak, yayımlandı. Birlikte son üç yıl içinde kapsamlı bir araştırma ile, bu çok önemlidir belirli bir yapısal bileşen yineledietkileşim: Gα alt birim C-terminali. Bu yapı, GPCR 4 G protein seçiminde 5-6 her iki G protein aktivasyonu için önemlidir. Bu nedenle, Gα C-terminali GPCR ligand uyarılması ve seçici G protein aktivasyonu arasındaki önemli bir bağlantı sağlar.
son on yılda Araştırma GPCR'ler GPCR yapılardan alt kümelerini stabilize ligand bağlama ile, geniş bir yapısal peyzaj doldurmak olduğunu göstermektedir. Kristalografisi, NMR ve floresan spektroskopisi, ve kütle spektrometresi dahil olmak üzere birçok teknik, GPCR yapısal peyzaj incelemek için mevcut iken, efektör seçimi 7 fonksiyonel önemini açıklamak için yaklaşımlar azdır. Burada, G protein seçici GPCR konformasyonlar tespit etmek için bir Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı bir yaklaşım özetlemektedir. FRET emisyon (donör) a örtüşen iki fluorophores yakınlığı ve paralel yönde dayanırve tahrik (akseptör) spektrumları 8. Verici ve alıcı floroforlar konformasyonel protein değişikliği veya bir protein-protein etkileşimini bir sonucu olarak daha yakın bir araya geldiğinde, bunlar arasında FRET arttırır ve yöntem 8 bir dizi kullanarak ölçülebilir. FRET tabanlı biyosensörler GPCR alanda 9 yaygın istihdam edilmiştir. Üçüncü hücre döngüsü ve GPCR Cı-terminalindeki verici ve alıcı ekleyerek GPCR konformasyon değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır; Sensör ayrı FRET çifti 10, GPCR ve efektör (G protein alt-birimleri / arrestins) etiketleyerek GPCR ve efektör etkileşimlerini incelemek için dizayn edilmiştir; Bazı sensörler ayrıca G-proteinine 11 yapısal değişiklikleri algılar. Bu biyosensörler yapısal GPCR değişiklikler ve efektör, GPCR-efektör etkileşim kinetik ve allosterik ligandlar 12 olmak üzere seçkin sorular çok sayıda sormak alanını sağlamıştır. Bizim grubumuzagonist odaklı koşullar altında G-protein spesifik GPCR konformasyonlar tespit olabilecek bir biyosensör oluştururken özellikle ilgi oldu. Bu biyosensör (sistematik protein afinite gücü modülasyon) 13 SPASM adında bir süre önce geliştirilen teknoloji dayanmaktadır. SPASM etkin konsantrasyonlarını kontrol eden bir ER / K linker kullanılarak bağlama etkileşimli protein alanları içerir. Fluorophores bir FRET çifti ile linker sınırdaş proteinler 12 arasındaki etkileşimin durumunu rapor bir araç oluşturur. Daha önce 1 SPASM modülü GPCR için Gα C-ucunu halata ve FRET fluorophores ile etkileşimlerini izlemek için kullanılan, mCitrine (onun bilinen varyant, Sarı Floresan Protein (YFP), uyarma / emisyon zirve de bu protokolde atıfta bulunulan , uyarma / emisyon zirve 430/475 nm) (onun yaygın olarak bilinen varyant Mavi Floresan Protein (OBP bu protokolde atıfta bulunulan) 490/525 nm) ve mCerulean. N- Cı-terminaline, tonun genetik olarak kodlanmış bir polipeptidi içerir: tam uzunlukta bir GPCR, Alıcı (mCitrine / YFP) FRET, 10 nm ER / K bağlayıcı, FRET verici (mCerulean / CFP) ve Gα C-terminali peptid. Bu çalışmada, sensörler GPCR-bağlayıcı uzunluğu Gα peptidi olarak kısaltılmıştır. Bütün bileşenler her bir alan serbest dönmesine olanak sağlayan bir yapısal olmayan (Gly-Ser-Gly) 4 bağlayıcı ile ayrılır. Sensörler ayrıntılı özellikleri daha önce iki prototipik GPCR'ler kullanılarak gerçekleştirilmiştir: 2-Ar ve opsin 1 β.
Bu sensör geçici HEK-293T hücreleri ve varlığı ya da ligandın yokluğunda saniye (cps) başına keyfi birimler FRET çiftinin florimetre bazlı canlı hücre deneyleri ölçer floresans spektrumları transfekte edilir. Bu ölçümler fluorophores (YFP max / OBP en yüksek) arasında bir FRET oranını hesaplamak için kullanılır. FRET (ΔFRET) bir değişiklik daha sonra ortalama FRET oranının çıkarılmasıyla hesaplanırLigand muamele edilmiş numunelerin FRET oranından işlem görmemiş örnekler. ΔFRET (β 2-AR-10 nm-Gαs peptid 2-AR-10 nm-hayır peptid p olan karşı) yapıları arasında mukayese edilebilir. Burada, detay protokol, canlı HEK-293T hücrelerinde bu sensörleri ifade ifadesini izlemek ve florimetre tabanlı canlı hücrenin kurulumu, yürütme ve analiz ilaç tedavi koşulları karşısında işlenmemiş için ölçüm FRET için. Bu protokol, 100 uM izoproterenol bitartarat ile muamele β 2-AR-10 nm Gαs peptid sensör için özel olsa farklı GPCR Gα çiftleri ve ligandlar için optimize edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA hazırlama
- Tasarım sensörü modüler klonlama şemasını kullanarak oluşturur. Daha önce 1 ayrıntılı β 2 -AR sensör tasarımı başvurun.
- 1.9, 260 / 2.0 bir 230 - - 2.29, 260 / 1.7 280 ticari bir miniprep kiti protokolüne göre DNA hazırlamak ve konsantrasyon ≥ de, 2 mM Tris-HCI çözeltisi pH 8, 750 ng / | il elüte.
2. Hücre kültürü preparasyonu
- ile takviye edilmiş 4.5 g / L D-glikoz, ihtiva eden DMEM içinde kültür HEK-293T-Flp n hücreleri% 10 FBS (ısıyla aktifliği giderilmiş) (hac / hac),% 1 L-glutamin ek, 20 mM HEPES, pH 7.5, 37 ° C'de % 5 CO2 de nemli bir atmosferde ° C. sonraki adımlar için biyolojik güvenlik kabini hücreleri anlaştım.
- Hücreler altı kuyu yemekleri içine Pasajlanması önce konfluent tek tabaka büyümeye izin verin. confluency ulaşmak için zaman ilk kaplama yoğunluğuna bağlıdır. Kullanım plakaları1 içinde birleştirilmek üzere gelecek - için kaplama 2 gün altı-iyi kaplama. Bir birleşik, 10 cm doku kültürü ile muamele edilmiş çanak yaklaşık 4 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğuna sahiptir. Hücre kültürü büyüme görüntü için Bkz: Şekil 1.
- 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın ve% 0.25 tripsin ile trypsinize (Tartışma, paragraf 2'ye bakınız). Levha 8 x 10 5 hücre / göz dokusu ortam 2 ml altı iyi yemekler kültürü ile işlenmiş ve 16 yapışmaya izin - 20 saat süredir.
3. Transfeksiyon koşulları
- (- 36 saat 20 arasında) optimal ekspresyonu başarmak üzere farklı süreler gerektirir yapıları için transfections yerleştiriniz. birleşik deney süresi şartları senkronize. Ayrıca bir untransfected kontrol de eşdeğer hücre yoğunluğu analizi sırasında arka plan gürültü ve saçılma çıkarma için kullanılmalıdır.
- Oda sıcaklığına transfeksiyon reaktifleri getirmek: düşük serum ortamı, DNA transfeksiyon reaktifi.
- İçindebiyolojik güvenlik kapağı aşağıdaki sırada steril mikrosantrifüj tüpü içinde reaktif birleştirir: 100 ul düşük serum ortamında 2 ug DNA karıştırın. Karışımın yüzey veya tüp yan dokunmadan medya / DNA karışımı içine transfeksiyon reaktif 6 ul Spike. kuyu başına bir transfeksiyon reaksiyonu ayarlayın. Tutarlı ekspresyon seviyelerini elde etmek için (transfeksiyon reaktifi 6 ul - 3 - DNA 4 ug 1) Transfeksiyon koşulları optimize edilebilir. Daha fazla optimize edilmiş oranları için Tablo 1'e bakınız.
- 30 dakika - 15 biyolojik güvenlik kabini, oda sıcaklığında inkübe karışımı. 30 dakika boyunca inkübasyona bırakıldı halinde reaksiyon kullanmayın.
- karşısında iyi damla damla bir şekilde hücrelere reaksiyonu ekleyin ve hafifçe iyice karışmasını sağlamak için altı-iyi sallayın. oyuk başına bir reaksiyon ekleyin.
- İfade, 20 saat sonra monitör floresans doku kültür floresan mikroskop kullanılarak. 40X bir hücrede 10X objektif ve protein lokalizasyonu ile nüfus ifadesini değerlendirmek. obsplazma zarı (PM) protein ekspresyonu için erve. önemli içselleştirilmesi kaydetti edilirse önemli ifade PM tespit edilinceye kadar, transfeksiyon monitör.
4. Reaktif ve Ekipmanları Hazırlık
- -80 ° C de 100 mM ilaç stokları ve mağaza hazırlayın: isoproterenol bitartarat (100 mM, 300 mM askorbik asit ihtiva eden dH 2 O). hemen soğuk oda ve flaş dondurucuda / buz üzerinde yapın. Alikot yapılmış ve bir yıla kadar kullanılabilmektedir.
- Celi tamponu hazırlayın (~ 2 mL / durumu), bir 37 ° C su banyosu içinde saklayın. Her gün taze olun. Hücre Tampon bileşenleri için referans Tablo 2.
- İlaç tamponu (10 mi) Hazırlama ve oda sıcaklığında saklayın. İlaç Tampon bileşenleri için referans Tablo 2.
- Asit, konsantre HCI kullanılarak küvetler yıkayın. Zayıf bir baz (1 M KOH) ile nötralize ve iyice DH 2 O. ile küvetler yıkayın
- Birkaç ile florometre etrafında iş istasyonu hazırlayın10, 200 ve 1000 ul pipet uçları, ultra saf H 2 O ile 10 dk geri sayım, küvet temizliği için ipuçları, narin görev mendil ile erişilebilir bir vakum hattına ve fışkırtma şişesi ile ayarlanmış bir zamanlayıcı kutu
- florimetre ve ısı bloğu ile 37 ° C için harici su banyosu ısıtın.
- Florometre açın; 430 nm, bant geçiren 8 nm eksitasyon için OBP toplama floresan toplama programını ayarlamak; emisyon aralığı 450 nm - 600 nm, bant geçiren 4 nm. 600 nm, bant geçiren 4 nm - sadece sensör kontrolü gibi YFP koleksiyonu için 490 nm, bandpass 8 nm, emisyon aralığında 500 set uyarma (Tartışma bakınız). CFP toplama ayarları Bu deneyde, bir FRET spektrumu elde etmek için kullanılır.
- Şekil 2'de gösterildiği gibi, ısı bloğu on 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. Bu tüpler hücre kısım tüpleri için sahibidir (500 ul mikrosantrifüj tüpler.) Burada yer küvetler minder sahipleri 1 ve 7 doku küçük bir parça yerleştirin.
Not: Tedavi edilmemiş durumda ve çapraz bulaşmayı önlemek için ilaç durum için ayrı küvetler kullanın.
Şekil 2. Mikrosantrifüj Tüp Kurma ve işlenmemiş numuneler için ısı Blok Cuvette pozisyon Referans 1 konumunda olduğunu.; Hücre kısım tüpleri 2 konumlarında - ilaç verilen örnekler için 6. Küvet konum 7'de olduğu; Hücre kısım tüpleri pozisyonlarda 8 - 12. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- mini 37 ° C su banyosu oluşturmak için su ~ 750 ul 12 - 6 ve 8 - tutucuları 2 doldurun.
- mini su banyoları (- 6, 8-12 sahipleri 2) içine hücre alikotları on 500 ul mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. Her tüp (untreate 5 durumun bireysel tekrar olacakD, tedavi edilen 5 ilaç).
- İfade hücreleri Monitör (adım 3.6).
5. Deney ve Veri Toplama
Şekil 3. Deneysel şematik. Deneysel için ayrıntılı adım adım rehber yukarı ve yürütme ayarlayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Deneysel şematik için referans Şekil 3. Hücreler floresan mikroskop ile tespit protein ifadesine dayalı, hasat için hazır olduğunuzda (Tartışma, paragraf 4): biyolojik güvenlik kabini, hafifçe bir P1,000 ile kültüründe ~ 1 medyanın ml, tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak ve tabanda transferi 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine.
Not: N-ucunu sindirmek ve olabilir tripsin kullanmaktan kaçının /ya GPCR sensörünün bağlayıcı cebinde. - yeniden süspansiyon uygun hücre yoğunluğu sağlamak için hücre sayımı. 4 x 10 6 hücre / ml tabanda hacmi optimize edin.
- 3 dakika boyunca, oda sıcaklığında, 290 xg sallanan kovalı bir santrifüj hücreleri dönerler. santrifüj sonra süpernatantı.
- Yavaşça (37 ° C'de saklanan), 1 ml hücre tamponu içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve adım 5.3 tekrarlayın. İkinci spin sırasında, -80 ° C ila 100 mM ilaç stok kısım toplamak. 1 mM çalışma hisse senedi için İlaç Tampon 100 seyreltme ve oda sıcaklığında tutmak: 1 olun.
- İkinci santrifüj işleminden sonra hücre tamponu (4 x 10 6 hücre / mL), 1 ml supernatant ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak. Hücre 1 ml ve boş olarak hücre 1 ml tampon ile spektrofotometre örnek Ölçü OD 600. Bir tek kullanımlık plastik küvete hücreleri koyun ve hemen spektrofotometri ardından mikrosantrifüj tüp geri aktarın.
- Bir kontrol edilmemiş Cep telefonl koşulu spektrumu, nazikçe, P1,000 pipet ile 1 ml Hücre Tampon untransfected hücrelerin tekrar süspansiyon küvete ve uyarma 430 nm FRET spektrumunu elde etmek için hücrelerin 90 ul ekleyin, bant geçiren 8 nm, emisyon 450-600 nm, bant geçiren 4 nm. Hücrelerin taze 90 ul 5 tekrar spektrumları - 3 toplayın. Örnekler arasında ultra saf H2O ile küvet, özellikleri arasında, 37 ° C'de hücre stok tutmak her bir örnek kısım arasında P1,000 nazikçe tekrar süspansiyon ve çalkalayın.
- 6, 8 - - ısı bloğu 12 deneysel koşullar, kısım 90 tutucular 2 500 ul tüplerin her birine transfekte edilmiş hücrelerin uL. Yavaşça her kısım arasındaki P1,000 pipet ile hücrelerin stok tekrar süspansiyon.
- tedavisiz örnekleri için 6 - hücreleri aliquoted sonra, 2 tüpler için İlaç Tampon 10 ul ekleyin.
- boru 8 içine doğru 1 mM ilaç çözeltisinin 10 ul ekleyerek deney başlar, 10 dakika geri sayım ve yavaşça P200 pipetiyle tüp karıştırmak için zamanlayıcıyı başlatın. Yakın tüp ve 37 dönüşC ısıtma bloğu °.
- Hemen (yeni bir uç kullanın) P200 ile hafifçe karıştırın, tüp 2 pick up tedavisiz küvete hücre süspansiyonu 90 ul ekleyin ve florometre yer.
- 600 nm, bant geçiren 4 nm - uyarma 430 nm, bant geçiren 8 nm, emisyon 450 FRET spektrum kazanır.
- 9 dk - 10 saniye, yavaşça, 1 mM ilaç çözeltisinin 10 ul tüp 9 spike P200 (yeni uç kullanın) ile karıştırmak ve blok ısı tüp döner.
- tüp 10 ile tüp 3 ve 5.12 ile 5.11 - 5.10 tekrarlayın adımları.
- Spektrumları tüm tedavisiz örnekleri için toplanır ve ilaç tüm uyuşturucu koşulu numunelere ilave edilene kadar 1 dakika aralıklarla (08:10, 07:10, vs.) 5.13 - Tekrar 5.10 adımları. çapraz bulaşmayı önlemek için her pipet adımı için yeni bir ucu kullanın.
- 5 dk - 10 saniye, yavaşça P200 pipetiyle boru 8 (ilaç durum) karıştırılması başlar florometre ilaç ile muamele edilen numune ve yeri için ayrı küvete hücre süspansiyonu 90 ul ekle.
- F edinmeRET spektrumu (ayarları için adım 5.11 bakınız).
- Kalan ilaç durum örneklerinin (- 12 tüpler 9) için 1 dakika aralıklarla (04:10, 03:10, vs.) 5.16 - Tekrar 5.15 adımları.
- Deney bittikten sonra, iyice ultra saf H2O ile küvetleri yıkayın, proje dosyalarını kaydetmek ve bir sonraki durum için tüpler re-stock. yıkama aşamasında çapraz bulaşmayı önlemek için özen gösterin. H2O şişe hem de yıkama arasında vakum hattında uç değiştirme.
6. Veri Analizi
- Kaydet ve KÜB'de ihracat veri dosyaları analiz için kullanılacak biçimlendirmek. Analiz programları Sivaramakrishnan Lab yayın web sitesinden yüklenebilir.
- analiz programları (v9, v15), untransfected örnekleri dosyaları (untransfected hücre spektrum toplama adım 5.6) veri girişi için, ÇIKIŞ veri dosyasını ve virgülle ayrılmış değerler (CSV) dosyaları içerir analiz yazılımı için yol dosyaları oluşturun.
- Aşağıdaki bilgileri girinCSV dosyası içine dahil, her bir örnek için ilgili koşullar (Tablo 3'te örneğe bakın) ve tayin:
Dosya adı - bireysel SPC grafik dosyaları
Reseptör - hangi GPCR yapı adayı test edilmiştir (örneğin, Β2)
Bağlayıcı - adayı olan yapının peptit varyantı test edilmiştir (örneğin, S)
Agonist - (N) muamele edilmemiş belirlemek ya da ilaç ile muamele edilmiş (D) koşullar
Directory - SPC dosyaları genellikle, kaydedilmiş tarihe göre organize edildiği yolu klasör
OD - spektrofotometreden numunenin kaydedilen optik yoğunluk - örneklerden tampon ve saçılma gürültü çıkarmak için untransfected numuneler (adım 5.6) için dosya adlarını girin.
- analiz programı içine koşullarını girin.
- Programları çalıştırma bireysel koşullarına (v9) içinde ve koşullar (v15) karşısında örnekleri analiz etmek.
- veri kümesinde belirgin aykırı olan örnek dosyaları dışlamak veya artan ya Indivi OD değerini düşürerek çıkartma için ayarlamakİkili dosyaları.
- erişmek için hesaplanan için ÇIKIŞ dosyasına İhracat verileri oranları (525 nm / 475 nm) FRET.
- tedavi (ilaç) koşulları için bireysel FRET oranlarından işlenmemiş durum için ortalama FRET oranının çıkarılmasıyla elde ΔFRET hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneyin bir genelleştirilmiş şematik kurmak ve yürütme Şekil 3'te ayrıntılı olarak verilmiştir.
Sensörün dar dinamik aralığındaki bir FRET değişikliği tespit etmek amacıyla, yapıştınlabilir sistemin nüansları uyması önemlidir. Hücre kalitesi örnekleme protein ekspresyonu ve tutarlılık için zorunludur. Optimal tutarlı bir tek tabaka (10X) büyüyen kültürlenmiş hücreler 1 özellikleri görüntüleri Şekil altı oyuklu ve kaplama için transfeksiyon Şekil 1 (a) ve topaklaşan desen büyüyen hücreler dendritik şekiller o kurşun tutarlı kaplama için tavsiye edilmez 1 (b) Şekil. Transfeksiyon koşulları da yeniden üretilebilir ifade elde etmek için optimize edilebilir. Çeşitli koşullar Burada kullanılan önerilen transfeksiyon reaktif için optimize edilmiştir. Tablo 1 detaylarını düşük serum ortamında bu koşullar. DNA ve transfeksiyon reaGent oranları.
Tüm veriler toplanmış ve veri analizi (Tablo 3'te örneğe bakın) için CSV dosyası girmiştir, Şekil 4'te gösterildiği Ham FRET spektrumları verilerini benzeyecek oluşturulan sonuçlar (a) ve normalize ortalama FRET spektrumları Şekil gösterilen 4 (b). Şekil 4'te kırmızı spektrumlan görmemiş örnekler ve mavi ilaç ile muamele edilmiş örnekler vardır bulunmaktadır. Şekil, (a) 4 Ham FRET spektrumları bütün (yani., 450 nm'de CPS 475 nm'de CPS ile karşılaştırıldığında) tutarlı veri analiz için yeterli bir sinyal-gürültü aralığı vardır. Bu aralığı ile spektrumları yumuşak ve numune su tepe (Raman tepe 500 nm'de) aynı zamanda az. Düşük ifade seviyeleri veri analizi müdahale önemli bir su zirvesi ile sonuçlanır. Veri 1.0 Bu değer CPS ayarlama 475 nm'de normalleştirilir (Şekil 4 (b)). Β 2 -ar için bu veri setinde-10 Nm-Gαs peptid sensörü, işlenmemiş (kırmızı) ve işlenmiş (mavi) örnekler arasında okuma 525 nm'de önemli bir değişiklik yoktur. ΔFRET değişikliği bu veri setlerinin FRET oranları (525 nm / 475 nm) hesaplanır ve ÇIKIŞ dosyası aracılığıyla erişilebilir olduğunu.
Protein ekspresyonu düşükse, Şekil 5'te gösterildiği gibi, spektrumu, gürültüsü görünebilir. Bunun için Şekil 4 (a) bir sinyal-gürültü aralığı Şekil karşılaştırıldığında düşük transfeksiyon verimi veya floresans okuma küvet içinde düşük hücre yoğunluğu vardır veri kümesi yaklaşık 1.0 ideal değildir -. 4 x 10 5 CPS max, 1.6 Bu düşük ekspresyon seviyesi ham veriler Şekil görülen pürüzlü spektrumları katkıda 5 (a), ancak veri sıkı ve olmak mümkün normalize Şekil 5 (b). Su zirveleri (~ 500 nm) rağmen veri setleri 5 (b) Bu eski Şekil tamamen arasında hizaya gelmezperiment hala analiz için kullanılabilir. 6 analiz için yetersiz bir deney temsilcisi Şekil. Sinyal-gürültü numunenin yaklaşık 2 iken - 3 ile muamele edilmiş (mavi) ve işlenmemiş (kırmızı) örnekleri, örneklerde arasında küvet içinde hücre yoğunluğu çok düşük olan Şekil 6 (1 x 10 5, 450 nm değer) (üzere a). Bu arka plan çıkarma ve normalleşme Şekil 6 (b) ve hizalama yok spektrumları bir sorunu yaratır. Çıkarma artan ya da Tablo 3'de OD azaltarak örnekleri için ayarlanabilir. Bununla birlikte, daha düşük bir hücre yoğunluğu ile, su zirvesi (~ 500 nm) çok daha büyük ve gürültüsü Şekil 6 (c) haline gelir ve daha fazla analiz bu veri setini inhibe eder.
Kültürlenmiş hücre büyüme Şekil 1. Örnek. Bir tek tabaka içinde büyüyen hücreler (a) Tutarlı bir kaplama ve transfeksiyon için idealdir. Yığınlarda veya dendritik desenler, (b) altı kuyularda sürekli plaka olmayabilir ile büyümeye görünen Hücreler, kötü transfeksiyon etkinliğini gösterebilir ve FRET spektrumunun genlik tutarsızlıkları yaratabilir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Temsilcisi Veri Analizi β 2-AR-10 nm-Gαs Peptit ± Uyuşturucu. Ham veri Temsilcisi görüntü (a) ve normalleştirilmiş, ortalama verileri (b) muamele edilmemiş (kırmızı) örnekleri ve işlenmiş (mavi) ile β 2-AR-10 nm Gαs peptid sensörü ile toplanır s100 uM izoproterenol bitartarat, 5 dakika inkübasyondan sonra amples. 475 nm, 525 nm YFP maksimum emisyon de OBP maksimum emisyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ham ve normalleştirilmiş verileri ile birlikte kötü Protein Ekspresyonu Şekil 5. analizi. Gürültülü ham veri spektrumları (a) düşük sentezleme seviyeleri, numune başına düşük hücre yoğunluğunda ve / veya yapının kötü transfeksiyon verimliliği bir sonucudur. Ideal olmasa da, bu veri seti, hala normalize (b) olarak yorumlanabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Raw ile Fluorometre Cuvette Düşük Hücre Yoğunluğu Şekil 6. Analiz ve Normalize Verileri. Ham verilerde görülen numune başına düşük hücre yoğunluğu, Setleri (a) su / arka plan çıkarma (b, c) komplike ve uninterpretable set bu verileri yapar. Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| Şart | 0.5x | 0.7x | 1x | 2 kere | 2 kere* |
| DNA | 1 ug | 1.4 ug | 2 ug | 4 ug | 4 ug |
| Düşük serum ortamında | 100 ul | 70 ul | 100 ul | 100 ul | 200 ul |
| Transfeksiyon reaktif | 3 ul | 4.2 ul | 6 ul | 6 ul | 12 ul |
| * Not: Son derece zor bir yapı için önerilir. Bu durum, yüksek hücre ölümünü indükleyen olarak Dikkat alınmalıdır. | |||||
Tablo 1. Transfeksiyon Koşulları. Bu tabloda, önerilen transfeksiyon reaktifi kullanılarak, HEK-293T hücreleri 2 ml kuyu içine Transfeksiyonlar için reaktifler optimize koşullar dahildir.
| Celi Tampon | ||
| hacim | reaktif | Yorumlar |
| 9 mi | ultra saf DNaz / RNaz ücretsiz su | |
| 1 mi | HBS (10x), pH 7.4, 4 ° C'de mağaza: | |
| 200 mM HEPES | ||
| 50 mM KCI | ||
| 450 mM NaCl | ||
| 20 mM CaCl2 - H2O | ||
| 10 mM MgCl2 - H2O | ||
| 100 ul | % 20 D-glikoz | |
| 15 ul | aprotinin (dH 2 O 1 mg / ml) | bozulmasını önlemek |
| 15 ul | löpeptin (dH 2 O 1 mg / ml) | bozulmasını önlemek |
| 100 ul | askorbik asit (dH 2 O 100 mM) * | agonist stabilize |
| * Tahlil başlamadan hemen önce ekleyin | ||
| ilaç Tampon | ||
| hacim | reaktif | Yorumlar |
| 9 mi | ultra saf DNaz / RNaz ücretsiz su | |
| 1 mi | HBS (10x), pH 7.4, 4 ° C'de mağaza: | |
| 200 mM HEPES | ||
| 50 mM KCI | ||
| 450 mM NaCl | ||
| 20 mM CaCl2 - H2O | ||
| 10 mM MgC <sub> 2 - H2O | ||
| 100 ul | askorbik asit (dH 2 O 100 mM) * | agonist stabilize |
| * Tahlil başlamadan hemen önce ekleyin | ||
Tablo 2. Tampon bileşenleri. Bu tablo bir deneyde kullanım için her iki hücre tamponu ve İlaç Tampon yapmak için kullanılan reaktifler göstermektedir. taze hem tamponları deney her gün yapmak; Oda sıcaklığında 37 ° C'de saklayın hücre tamponu ve İlaç Tamponu.
Analiz için Tablo 3. Örnek CSV Dosya. Bu örnek veri dosyası bir deney sonra set kaydını işaretler. Birden fazla deneyler aynı CSV dosyası olarak girilebilir ve gerekirse 'Katkı' sütunu altında ayırt edilebilir. HerSatır aşağıdaki bilgilerle doldurulması gerekmektedir:
Dosya adı - bireysel SPC grafik dosyaları Reseptör - adayı GPCR yapı test edilmiştir (örneğin, Β2)
Bağlayıcı - adayı olan yapının peptit varyantı test edilmiştir (örneğin, S)
Agonist - (N) muamele edilmemiş belirlemek ya da ilaç ile muamele edilmiş (D) koşullar
Directory - SPC dosyaları genellikle, kaydedilmiş tarihe göre organize edildiği yolu klasör
OD - spektrofotometre örnek kaydedilen optik yoğunluk
Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sistemde FRET ölçümlerinin sıkı dinamik aralık Bu protokolün her aşamasında hassas kalite kontrol gerekliliğini güçlendirmektedir. Başarılı bir FRET deneyi sağlamak için en önemli adımlar tahlil yürütülmesi sırasında 1) hücre kültürü, 2) transfeksiyon 3) protein ekspresyon ve 4) zamanında, hassas koordinasyon vardır.
Hücre sağlık ve bakım / kaplama kalitesi imkansız FRET herhangi tutarlı bir değişiklik tespit yapabilirsiniz deneysel sistem ve kötü hücre sağlığı sinyal-gürültü üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bu hücre hattı, taşıma ve kültür koşullarına göre değişebilir olsa konservatif, hücreler, yaklaşık 20 pasajlar için sağlıklı bulunmaktadır. Hücreler var bir kere zorluk konfluent tek tabaka olarak büyüyen, ya da daha fazla dendritik desenler, deneysel arka plan gürültü olumsuz etkilenecektir (Şekil 1 (b) 'bakınız) sürekli büyüyen başlar. Rutin medi dahil Dikkatli hücre bakım,Bakım plakalarından yıkanarak yapışmayan hücreler ve kalıntıları çıkarma değişiklik ve düzenli altı oyuklu kaplama ve Transfeksiyonlar için hücreleri kalitesini arttıracaktır. ters transfeksiyon verimini etkiler, hücre yığınları, etkili bir şekilde bakım plakaları tripsinizasyon ile tek tek hücreler içine ayrılabilir: 37 içinde yer çanağı, 30 saniye için 10 mi, 0.25% 'si tripsin ile 10 cm konfluent yemekler tedavi tripsin kaldırmak, ancak yaklaşık 200 ul terk 3 dakika - 2 C inkübatör °. Hücreler çok kolay çanak dökülmek ve topaklanma daha az duyarlı olacaktır.
Deney için transfeksiyon adımını optimize önemlidir. Verimli Transfeksiyonu ve optimal ekspresyon için% 80 konfluent - altı kuyu ideal 60 olmalıdır. transfekte etmek 6 saat veya hücrelerin en az% 70, yapıştırılmış kadar - çok az sayıda hücre yapışmış varsa (<% 60), yaklaşık olarak 2 bekleyin. aşırı konfluent (>% 80) altı-kuyuları da transfeksiyon etkinliğini azaltacaktır. düşük transfectingHücre confluency hücre ölümü oranını artırır. DNA konsantrasyonu ve saflık (adım 1.2) de kritiktir. Düşük konsantrasyon ve / veya kalitesiz DNA hazırlıklarını kullanarak olumsuz Transfeksiyon koşulları yapı başına ayarlanabilir transfeksiyon verimliliği etkileyen Daha fazla bilgi için bakınız Tablo 1.
Bir doku kültürü floresan mikroskop kullanılarak protein ekspresyonu doğru ve tutarlı izleme bu süreçte başka önemli bir adımdır. Bu adım, tek tek yargısına bağlıdır olmasına rağmen, burada ayrıntılı olarak değil de, nicel olarak, zaman içinde ifade izlemek için, örneğin mikroskopi gibi diğer teknikler kullanmak mümkündür. Bizim sistemde başarıyla test etmiş yapılar için, ifade optimum ifade ulaşmak için yaklaşık 18-36 saat sürer. Bizim tecrübelerimize göre, bu zaman penceresi sırasında ekran fakir ifade nadiren 40 saat sonra geliştirmek oluşturur. yapıları biz degradatio belirtileri göstermemiştir ile yayınladıkn, ancak bu bazı GPCRs için bir sorun olabilir. Analizlerde, sensör bozulması 30 saat boyunca transfeksiyon zamanlarda mümkündür. Sensör bütünlüğü YFP / OBP oranları kullanılarak test edilebilir: 525 nm YFP heyecanlı (490 nm) spektrumda okuma ve 475 nm CFP-heyecanlı (430 nm) spektrumda okuma. ayarları için, adım 4.6 bkz. 1.8 ideal oranı, 2.0 - Tavsiye edilen YFP / CFP oranları 1.7 aralığındadır. Bu değer, CFP14 için YFP nisbetle yaklaşık iki kat daha büyük bir parlaklık bağlıdır. minimum zarar ayrılmaz bir sensör bu nedenle, her iki florofor içeren ve YFP olacaktır: yaklaşık 2 CFP oranı: 1 arasındadır. Sensör kalitesi onaylandıktan sonra plazma membranında protein lokalizasyonu ve ifade onaylamak için önemlidir. Önemli hücre içi ifade, protein yıkımı, içselleştirme, ya da proteinin sürekli kaçakçılığı ya bir sonucu olabilir. Monitör ifade plazma membranında geliştirilmiş olup olmadığını görmek için zamanla oluşturur. Bir sonraki critifadesinde ical meydan transfeksiyon verimliliktir. Yaklaşık% 70 + transfeksiyon verimi, bu florimetre sisteminde yeterli bir sinyal-gürültü tespiti için gereklidir. daha az hücre transfekte edilir, sinyal-gürültü miktarı yine tespit edilebilir ancak bir FRET deneyinde örnekleri arasında daha az tutarlı olacaktır. Bu sistemin dar dinamik aralığında doğru veri analizi engel olacaktır. İfade seviyeleri deney sırasında yeterli bir sinyal-gürültü elde etmek önemli bir engel teşkil. florometre ile tespit ifade seviyeleri için, 1.5 ve 475 nm ve 450 nm (hücre saçılması) arasındaki sinyal oranı FRET bir değişimi tespit etmek için yeterli olan, ancak uygun sentezleme yaklaşık 2.0 + oranına sahip olacaktır. Referans olarak, β2-AR veriler, 1 x 10 6 cps (475 nm), 2.5, sinyal-gürültü oranı 4 x 10 5 cps (450 nm), bir sinyal-gürültü aralığında toplanır. Bu oran variabi miktarını azaltmaya yardımcı olacaktırAyrıca, veri analizi etkileyebilir örnekleri arasında ğı. Bu ifade düzeyleri de duyarlılık ve florimetre optik optimal uyum tabidir; diğer sistemler Yeterli sinyal-gürültü optimizasyonu için farklı parametreler gerekebilir.
Hücreler zaman ve sıcaklığa karşı son derece duyarlıdır. deneysel prosedür başladıktan sonra, hassas taşıma hücre ölümünü önlemek için çok önemlidir. Spesifik lojistik tedbirler süreci hızlandırmak ve emin tüm ekipman düzgün çalışıp çalışmadığını ve önceden deney hedeflerini planlama yapma iş istasyonu hazırlamak da dahil olmak üzere zamanında hatalar önlemek için alınabilir. Hasat 30 dakika içinde hücrelerin kullanılması idealdir ve sistemimizde, bu protokol 20 dakika içinde yürütülür. teknik hakim sonra, özel olarak transfeksiyon optimizasyonu ve egzersiz kendisinin el becerisi, bu deney, birbirlerine karşı çeşitli yapıları karşılaştırın doz yeniden üretmek için kullanılabilireğrileri yanıtının ve sensör tam uzunlukta G proteinine genişletilebilir.
Burada kullanılan FRET sensörü GPCR FRET sensörler benzersiz bir gelişme olmasına rağmen, bu özel deney düzeneği sensörü uygulanması için bir iyi karakterize tahlil olarak ayrıntılı. Florimetre bazlı analiz hücrelerinin büyük bir nüfusun her deneyde değerlendirilebilir ve bu nedenle in vivo ortamda muhafaza saflaştırılmış protein veya zar preparatlarıyla dayanmaz sağlar. Bu deney tasarımı da GPCR agonist stimülasyonu üzerine sisteminde görülen çok küçük değişiklikleri tespit etmek için optimize edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
RUM Amerikan Kalp Derneği Öncesi doktora bursu (14PRE18560010) tarafından finanse edildi. Araştırma Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Grant (13SDG14270009) & SS NIH (1DP2 CA186752-01 ve 1-R01-GM-105646-01-A1) tarafından finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to RT before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at RT |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
