Summary
هنا نحن تصف طريقة رواية لتوليد مستقبلات الخلايا التائية مستضد معين (TCRs) من خلال إقران TCRα أو TCRβ من TCR القائمة، والتي تمتلك مستضد خصوصية الفائدة، مع hemichain مكملة للالمحيطي تي مستقبلات الخلية ذخيرة. دي نوفو TCRs لدت تحتفظ مستضد خصوصية مع اختلاف النسب.
Abstract
وتستخدم مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) سريريا لتوجيه خصوصية خلايا T لاستهداف الأورام كطريقة واعدة من العلاج المناعي. ولذلك، استنساخ TCRs محددة لمختلف المستضدات المرتبطة الورم كان هدف العديد من الدراسات. للحصول على استجابة فعالة الخلايا التائية، يجب أن TCR التعرف على المستضد الهدف مع تقارب الأمثل. ومع ذلك، فقد تم استنساخ هذه TCRs تحديا والعديد من TCRs متاح تمتلك تقارب دون المستوى الأمثل للمستضد وما شابه ذلك. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة استنساخ دي نوفو عالية تقارب TCRs مستضد معين باستخدام TCRs القائمة من خلال استغلال hemichain المركزية التي. ومن المعروف أن لبعض TCRs، كل TCRα أو TCRβ hemichain لا تساهم بنفس القدر على الاعتراف مستضد، ويشار إلى hemichain المهيمنة على أنها hemichain مركزية. لقد أظهرنا أنه من خلال إقران hemichain مركزية مع مكافحة سلاسل مختلفة من الأصلي مكافحة السلسلة، ونحن قادرون على الحفاظ على مستضد الصورةpecificity، في حين تحوير قوة تفاعلها للمستضد وما شابه ذلك. وهكذا، فإن الإمكانات العلاجية لTCR معين يمكن أن تتحسن عن طريق تحسين الاقتران بين مركزية ومكافحة hemichains.
Introduction
مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) هي heterodimeric مستقبلات المناعة التكيفية التي أعرب عنها الخلايا اللمفية تي، ويتألف من سلسلة TCRα وTCRβ. أنها ولدت عن طريق إعادة ترتيب الجسدية الخامس (D) J قطاعات الجينات التي تنتج ذخيرة متنوعة للغاية قادرة على الاعتراف تكوينات غير محدودة تقريبا من المجمعات HLA / الببتيد. سريريا، وقد أثبتت خلايا تي هندسيا للتعبير محددة TCRs clonotypic عن المستضدات المرتبطة ورم فعالية في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان 1. ومع ذلك، فإن العديد من TCRs المستنسخة لهذا الغرض تفتقر تقارب كاف للمستضد من الفائدة، التي تحد من تطبيقها العلاجي.
هنا، نحن تصف طريقة للتغلب على هذا القيد لTCRs القائمة من خلال استغلال سلسلة المركزية التي. وقد أفيد أن واحدا TCR hemichain يمكن أن تلعب دورا أكثر هيمنة في الاعتراف المستضد الهدف 2، ووصف هنا المركزية التي. وقد أظهرت التحليلات الكريستال الهيكلية التي تركز على واحدhemichain من TCR يمكن أن تشكل الغالبية العظمى من البصمة على MHC / الببتيد معقد 3،4. باستخدام هذا المفهوم، لقد أثبتنا سابقا أن SIG35α TCRα يمكن الزوج مع ذخيرة متنوعة من السلاسل TCRβ والحفاظ على التفاعل ضد الببتيد MART1 27-35 قدمها HLA-A2 5. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع TAK1 TCR، حيث TCRβ hemichain تتمحور يقترن سلاسل مختلفة TCRα والحفاظ على التفاعل لالببتيد WT1 235-243 قدمها HLA-A24 6. كلا MART1 وWT1 هي المستضدات المرتبطة الورم. تم تطبيق سلسلة المركزية التي أيضا لدراسة الاعتراف مستضد من TCRs ثابتة CD1d المقيدة القاتلة الطبيعية (iNKT)، عن طريق إقران ثابتة سلسلة Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα من TCRs iNKT الإنسان مع مختلف سلاسل Vβ11 TCRβ 7.
في جميع الحالات، وكنا قادرين على توليد دي نوفو مرجع TCRs التي كتبها العابرةducing وhemichain TCR مركزية لخلايا T الدم المحيطي، حيث hemichain قدم يقترن TCRα الذاتية أو TCRβ مكافحة السلاسل. في جوهرها، ويخدم hemichain تتمحور كطعم التي يمكن استخدامها لتحديد العداد سلاسل المناسبة، والتي عندما يقترن تشكل معا TCRs التي تحافظ على خصوصية المستضد من الفائدة، ولكن متفاوتة في النسب. من هذه ذخيرة جديدة، تمكنا من عزل TCRs clonotypic مع تحسين قوة تفاعل ضد مستضد الهدف مقارنة TCRs الموجودة مسبقا. ولذلك، فإننا نعتقد أن هذه طريقة تسريع خط أنابيب تحديد TCRs المثلى لتطبيق السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد فيروسات الرجعية بانشاء ترميز TCR Hemichain الاهتمام
- خطي ناقلات PMX للسماح لإدخال جين TCR في الخطوات اللاحقة. هضم البلازميد مع EcoRI ونوتي أنزيمات التقييد عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات (الجدول 1) 8.
- تنفيذ الكهربائي من البلازميد هضمها على 1.2٪ agarose هلام. المكوس الفرقة من حوالي 4500 زوج قاعدي (بت في الثانية)، وأزل في 30 ميكرولتر الماء المعقم باستخدام المتاحة تجاريا مجموعات استخراج الهلام 9.
- تصميم 5 "و 3" التمهيدي لجين TCR من الفائدة التي تكود أيضا 15-20 نقطة أساس تداخل الموقع الهضم EcoRI ونوتي ناقلات PMX على التوالي 8.
- تضخيم TCR الجينات مع الاشعال. تنفيذ الكهربائي من المنتج PCR والفرقة أزل ما يقرب من 1000 بت في الثانية كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- استنساخ TCR الجينات في ناقلات يهضم عن طريق الجمع بين كل جزء خطي مع البلازميد المتاحة تجارياسيد التجمع كاشف المزيج ويحتضنها عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى بروتوكول الشركة المصنعة لوحدات التخزين النسبية لكل عنصر. ويستند هذا الأسلوب التجمع على تقنية الموضحة في الأصل من قبل جيبسون وآخرون. 10. - (اختياري) الجين علامة TCR بمناسبة خلايا transduced مع شكل اقتطاع من العصبية البشرية عامل النمو مستقبلات (ΔNGFR، والأحماض الأمينية 1-277) 11 مفصولة فورين الموقع الانقسام، رابط، سيرين جليكاين، و2A تسلسل 12،13. الاشعال تصميم تسلسل ترميز تداخل نهايات جزء وتجميع البلازميد كما هو موضح في الخطوات 1،3-1،5.
ملاحظة: يمكن العثور على هذه المتتاليات في المراجع 11-13. - تحويل E. المختصة كيميائيا القولونية مع البلازميد تجميعها بعد بروتوكول الشركة المصنعة 14. البذور تتحول البكتيريا على لوحات أجار (20 ملغ / مل استذابة مرق (LB)، و 15 ملغ / مل أجار، و 1 ميكروغرام / مل الأمبيسلين)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. ثقافة مستعمرة بكتيريا واحدة في 50 مل من LB المتوسطة (20 ملغ / مل LB و 1 ميكروغرام / مل الأمبيسلين) لمدة 16 ساعة في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 200 طلقة في الدقيقة.
- تنقية البلازميدات باستخدام مجموعات midiprep المتاحة تجاريا بعد بروتوكول الشركة الصانعة. تمييع البلازميد تركيز حوالي 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
ملاحظة: يعتمد بروتوكول تنقية البلازميد على قلوية طريقة استخراج 15.
2. توليد مستقرة تغليف خط الخلية
ملاحظة: خلايا كل 293GPG وPG13 هي ملتصقة. خلايا الثقافة في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. ثقافة الخلايا 293GPG مع 1 ميكروغرام / مل التتراسيكلين قبل ترنسفكأيشن. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 بين جميع الخطوات.
- خلايا التعبئة والتغليف Transfect 293GPG 16 المستزرعة في قارورة T75 مع ناقلات hemichain ترميز حصلت عليه في الخطوة 1.9، باليودنانوغرام المتاحة تجاريا كاشف ترنسفكأيشن بعد بروتوكول الشركة المصنعة 1 7. ملاحظة: خلايا Transfect 293GPG في 50-60٪ confluency.
- نضح المتوسطة ل293GPG الخلايا وإضافة 10 مل من الطازجة DMEM المتوسطة 1 آخر يوم ترنسفكأيشن.
- إنتاج محصول عابر الفيروس من خلايا 293GPG transfected بعد 2 أيام خطوة 2.2 عن طريق نقل مستنبت إلى حقنة ومرورا 0.45 ميكرون فلتر.
ملاحظة: فيروس يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. - ثقافة 1 × 10 5 PG13 الخلايا في T25 القارورة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. بعد يوم واحد، مستنبت نضح وإضافة 1.5 مل من فيروس المستمدة 293GPG-من الخطوة 2.3 و 1.5 مل DMEM المتوسطة، جنبا إلى جنب مع 8 ميكروغرام / مل من polybrene.
- تغيير المتوسطة كما هو موضح في الخطوة 2.4 مرة واحدة يوميا لمدة 4 أيام، لإقامة مستقر خط PG13 خلية التعبئة والتغليف إنتاج الفيروس الارتجاعي ترميز hemichain TCR من الفائدة.
- نضح المتوسطة واستبدالمع المتوسطة DMEM جديدة للخطوط الخلايا PG13 24 ساعة بعد الإصابة الماضي لثقافة أخرى.
ملاحظة: تجميد أو ثقافة فرعية الخلايا عن طريق فصل مع 0.05٪ حل التربسين-EDTA. - لإنتاج الفيروس من خطوط الخلايا PG13 transduced والثقافة 2 × 10 6 الخلايا في T75 قارورة مع 10 مل DMEM المتوسطة، وفيروس الحصاد كما هو موضح في الخطوة 2.3 ثلاثة أيام بعد البذر الخلايا.
ملاحظة: فيروس هو الأفضل استخدامها على الفور ولكن يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
3. تفعيل وتنبيغ من خلايا T الإنسان
ملاحظة: يتم الحصول على عينات البشرية واستخدامها وفقا للبروتوكولات وافقت لجنة الأخلاقيات المؤسسية. الخلايا البشرية الثقافة الابتدائية في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) متوسطة تستكمل مع المصل البشري 10٪ بدلا من FCS و 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 بين جميع الخطوات.
- عزل الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى الإنسان (PBMC) من خلال الكثافةالفصل الانحدار بعد بروتوكول الشركة المصنعة 18.
- تنشيط خلايا T للحث على الانتشار اللازمة لعدوى فيروسات. ثقافة 2 × 10 7 PBMC طازجة أو إذابة لكل بئر في لوحة 6 جيدا، في 5 مل من المتوسط RPMI مع 100 وحدة دولية / مل المؤتلف الإنسان انترلوكين 2 (rhIL-2) و 50 نانوغرام / مل من مكافحة CD3 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (OKT3 استنساخ).
- ثلاثة أيام وظيفة في التحفيز، وجمع خلايا تي من قبل pipetting وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 4 دقائق. تجاهل طاف والبذور 0.5-1 × 10 6 خلايا تي لكل بئر في 24 لوحة جيدا معلق في 1 مل من فيروس PG13 من الخطوة 2.7 و 1 مل من المتوسط RPMI تستكمل مع 200 وحدة دولية / مل من rhIL-2. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج و 32 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- بعد 24 ساعة، وجمع خلايا تي من قبل pipetting وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 4 دقائق. تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 1 مل من فيروس PG13 من الخطوة 2.7 و 1 مل من المتوسط RPMI تستكمل مع 200 وحدة دولية / مل من rhIL-2. كرر هذه الخطوة ليصبح المجموع 6 تصيبالأيونات.
ملاحظة: يجب أن يكون الأمثل عدد من العدوى حسب عيار من الفيروسات التي تنتجها التعبئة والتغليف خط الخلية. إذا لزم الأمر، مرور الخلايا التائية عن طريق إزالة 20-30٪ من الخلايا كل يوم لمنع فرط. - 24 ساعة بعد الإصابة الماضي، وجمع خلايا تي من قبل pipetting وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 4 دقائق. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في المتوسط RPMI مع 100 وحدة دولية / مل من rhIL-2 لمزيد من الثقافة.
- بعد 2-3 أيام خطوة 3.5، خلايا وصمة عار T مع متعدد القسيمات HLA عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم CD3 المضادة البشرية ومستقبل مساعد الاجسام المضادة (MABS) في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تحليل التدفق الخلوي. استخدام متعدد القسيمات لا صلة لها بالموضوع و / أو خلايا untransduced والضوابط السلبية (الشكل 1-3) 19.
- إذا كان hemichain تتمحور قدم هو سلسلة TCRα وتحليل استخدام Vβ من دي نوفو متعدد القسيمات خلايا إيجابية باستخدام المتاحة تجاريا لوحة الأجسام المضادة Vβ محددة من قبل التدفق الخلوي 20.
4. الاستنساخ دي نوفو TCR مكافحة hemichains
- فرز دي نوفو متعدد القسيمات السكان الإيجابي في الخطوة 3.6 بواسطة بمساعدة تدفق فرز الخلايا.
- عزل الحمض النووي الريبي من خلايا تي فرز باستخدام حمض guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم استخراج طريقة 21،2 2.
ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية، ولكن ينبغي أن تستخدم لتوليد كدنا] في أقرب وقت ممكن. - تجميع مكتبة كدنا] من الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام المتاحة تجاريا عكس مجموعات الناسخ-PCR بعد بروتوكول الشركة المصنعة 23،24.
- إذا استنساخ TCRβ مكافحة السلاسل وتصميم Vβ الجينات وTCRβ المنطقة الثابتة الاشعال محددة، كما هو محدد في الخطوة 3.7، واستنساخ كامل طول TCRβ الجينات كما هو موضح في الخطوات 1،3-1،9. راجع الخطوة 4.5 إذا مكافحة السلسلة TCRα، ومواصلة ذلك إلى الخطوة 5.1.
- تجاريا والأجسام المضادة Vα محددة المتاحة محدودة، لا يمكن بالتالي Vα استخدام الجيناتيحددها التدفق الخلوي. استنساخ TCRα مكافحة سلاسل عبر التضخيم 5'-السريع لغايات كدنا] (سباق) 25، وذلك باستخدام المتاحة تجاريا 5 "مجموعات RACE 6.
- تجميع 5 "سباق كدنا] متوافق من الحمض النووي الريبي المستخرج في الخطوة 4.2 بعد بروتوكول الشركة الصانعة.
- أداء 1 ش جولة PCR كما هو موضح في الجدول رقم (2).
- تنفيذ الكهربائي من المنتج PCR وأزل عصابة من حوالي 1100 نقطة أساس، كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- أداء 2 الثانية PCR الجولة كما هو موضح في الجدول رقم 3، وذلك باستخدام 1 ش جولة المنتج PCR كقالب.
ملاحظة: تم تصميم تسلسل التمهيدي المبينة في الجدول 3 لاستنساخ في EcoRI ونوتي هضمها ناقلات PMX. - تنفيذ الكهربائي من المنتج PCR وأزل عصابة من حوالي 1000 نقطة أساس، كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- الجينات استنساخ TCRα إلى EcoRI ونوتي هضمها ناقلات PMX وبوريالبلازميدات السنة المالية كما هو موضح في الخطوات 1،5-1،9.
النسخ TCR 5. إعادة تشكيل رواية مستضد محددة
ملاحظة: الثقافة Jurkat 76 الخلايا وخطوط الخلايا اللاحقة في RPMI المتوسطة تستكمل مع 10٪ FCS و 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 بين جميع الخطوات.
- تنبيغ Jurkat 76 خلايا 26 (أو ما يعادلها TCR - / - البشري خط خلية T) مع hemichain TCR تركز على استخدام فيروس 293GPG المنتجة في الخطوة 2.3. لJurkat 76، البذور 5 × 10 4 خلايا لكل بئر في 24 لوحة جيدا مع 1 مل من الفيروسات و1 مل من RPMI المتوسطة. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج و 32 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- 24 ساعة بعد الإصابة، وجمع hemichain transduced Jurkat 76 خلايا من قبل pipetting وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 4 دقائق. تجاهل وطاف resuspend في المتوسط RPMI جديدة لمزيد من الثقافة.
- تنقية الخلايا transduced إذا كان hemichain هو جزيئيا الموسومة بعد 2-3 أيام خطوة 5.2، بواسطة وصمة عارجي مع fluorophore مترافق مكافحة NGFR ماب يليه تدفق المساعدة أو الخلايا المغناطيسية بمساعدة الفرز (اختياري) 27.
- الخطوات التالية 2،1-2،3، إنتاج 293GPG فيروس ترميز TCR مكافحة سلسلة مستنسخة من الخطوات 4.4 أو 4.5.
- لإعادة تماما TCR، تنبيغ خط الخلايا التائية معربا عن ستابلي hemichain TCR مركزية ولدت في الخطوات 5،1-5،3 باستخدام فيروس من الخطوة 5.4. أداء تنبيغ كما هو موضح في الخطوات 5،1-5،2.
- تنقية CD3 + transfectants استخدام الألغام المضادة للCD3 المغناطيسي بمساعدة فرز الخلايا بعد بروتوكول الشركة المصنعة، بعد 2-3 أيام خطوة 5.5 27.
- للتحقق من صحة مستضد خصوصية، وصمة عار على transfectants معربا عن TCRs clonotypic تتألف من hemichain TCR تتمحور إرفاقها مع مختلف مكافحة سلاسل، مع مكافحة CD3 و / أو MABS مستقبل مساعد، ومتعدد القسيمات HLA، 3-5 آخر أيام تنقية CD3. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 4-5) 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
دون معرفة مسبقة منها hemichain هو سلسلة مركزية، وسلسلة TCRα وTCRβ يجب المستنسخة على حدة وtransduced لخلايا الدم تي الطرفية، والذي تم القيام به في حالة HLA-A24 / WT1 رد الفعل TAK1 TCR (الشكل 1). تنبيغ TAK1β أسفرت عن ارتفاع وتيرة بشكل ملحوظ من خلايا تي مستضد معين. على العكس من ذلك، فإن تنبيغ من hemichain غير مركزية لم تسفر دي نوفو خلايا T متعدد القسيمات إيجابية، كما رأينا مع سلسلة TAK1α (الشكل 1). أثناء التحليل، بوابة على NGFR + الخلايا إذا تم وضع علامة الجين TCR لتحليل تحديدا الخلايا transduced (الشكل 1-2). من ناحية أخرى، فإن hemichain مركزية واحدة يمكن transduced إذا كان من المعروف أن تكون مهيمنة، على سبيل المثال SIG35α وثابتة سلاسل Vα24 TCRα (الشكل 2 و 3). خلايا تي محددة لCOGN منهاأكل مستضد زيادة في وتيرة بناء على التنبيغ من hemichain TCRα مركزية. (الشكل 2-3). معا، وهذه البيانات تظهر أن إدخال تتمحور TCRα أو TCRβ hemichain إلى خلايا T الدموية المحيطية يمكن أن تولد من جديد TCRs مع مستضد خصوصية الفائدة.
السكان محددة مستضد يمكن تصنيفها من قبل خلية بمساعدة تدفق الفرز ويمكن استنساخ hemichains TCR كما هو موضح في قسم البروتوكول 4. Clonotypic TCR مكافحة سلاسل يمكن إعادة تشكيل فردي على خط الخلايا التائية معربا عن ستابلي hemichain مركزية. Jurkat 76 transfectants، معربا عن استنساخ حديثا TCRs فريدة من TAK1β أو SIG35α تتمحور hemichain transduced خلايا T، يمتلك الطمع متفاوتة للمستضد وما شابه ذلك منها، على النحو الذي يحدده HLA / الببتيد متعدد القسيمات تلطيخ 5،6. على وجه التحديد، تمكنا من عزل دي نوفو TCRα مكافحة سلاسل ركانت ملطخة قبعة عندما يقترن TAK1β مع أي كثافة أقل أو أعلى من قبل مجمع مستضد WT1 من الاقتران TAK1αβ الوالدين (الشكل 4). وبالمثل، SIG35α يقترن فريدة من نوعها لمكافحة سلاسل المعترف بها HLA-A2 / MART1 مع معتدلة إلى الطمع عالية (الشكل 5). تم استنساخ SIG35α مستقل لمغاير TCRαβ 5، لذلك كان الاقتران الوالدين لهذا hemichain متاحة للمقارنة. الأهم من ذلك، تشير هذه البيانات التي من الممكن أن تعدل تقارب للمستضد الهدف عن طريق إقران hemichain مركزية مع مختلف مكافحة السلاسل.
الشكل 1: TAK1β كمثال على HLA المقيدة TCRβ تتمحور hemichain TCRα أو TCRβ hemichains من HLA-A24 / WT1 رد الفعل TAK1 TCR كانت المعلمة مع العصبية اقتطاع عامل النمو RECEptor (ΔNGFR)، وtransduced بشكل فردي لخلايا الدم تي الطرفية. كانت ملطخة Transfectants مع PC5 مترافق مكافحة CD8 (133X المخفف) وFITC، مترافق مكافحة NGFR (20x والمخفف) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS)، وأشار متعدد القسيمات HLA-A24 (5 ميكروغرام / مل)، وبعد مرتين مستضد محددة التحفيز. تم اختبار مجموعه 6 المانحين. تم بوابات كافة البيانات الموجودة على الخلايا NGFR +. الرقم بإذن من المرجع 6 المطبوعة من جديد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: SIG35α كمثال على HLA المقيدة TCRα تتمحور hemichain سلسلة SIG35α TCRα الكلمات الدلالية مع ΔNGFR، أو علامة وحده، transduced لخلايا الدم تي الطرفية. كانت ملطخة Transfectants مع PC5 المشتركnjugated مكافحة CD8 (133X المخفف) وFITC، مترافق مكافحة NGFR (20x والمخفف) MABS، وأشار إلى HLA-A2 متعدد القسيمات (8 ميكروغرام / مل). تم اختبار مجموعه 4 المانحين. تم بوابات كافة البيانات الموجودة على الخلايا NGFR +. الشكل إعادة طبع بإذن من المرجع 5 (حقوق الطبع والنشر عام 2015. والجمعية الأمريكية للمناعة، وشركة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم transduced ثابت من المستند القاتلة الطبيعية T (iNKT) مستقبلات الخلايا Vα24 (Vα24i) كمثال المقيدة CD1d TCRα تتمحور hemichain Vα24i TCRα سلسلة لخلايا الدم الطرفية T: الرقم 3. كانت ملطخة Transfectants مع FITC، مترافق مكافحة CD3 (20x والمخفف) ماب وأشار متعدد القسيمات CD1d (5 ميكروغرام / مل). تفريغ مو CD1dأنتجت lecules من خلايا HEK293 والحاضر الذاتية الدهون الذاتية مجهولة. ويعرف iNKT TCR قبل الاعتراف CD1d تقديم α-GalCer أو التناظرية PBS-57. تم اختبار مجموعه 4 المانحين. الرقم بإذن من المرجع 7 المطبوعة من جديد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الممثل TCRα مكافحة سلاسل المستنسخة من TAK1β transduced خلايا T TCRα استنساخ T262، A262، A186، A133، وكانت مستنسخة T4 من HLA-A24 / WT1 خلايا T الطرفية TAK1β transduced متعدد القسيمات إيجابية، وأعادت فردي على Jurkat 76 الخلايا. معربا عن CD8، جنبا إلى جنب مع سلسلة TAK1β. كانت ملطخة Transfectants مع PC5 مترافق مكافحة CD8 ماب (133X المخفف) وأشار HLA-A24متعدد القسيمات (5 ميكروغرام / مل). البيانات التمثيلية تجربتين مستقلة. وتشير أشرطة الخطأ النطاق. الرقم بإذن من المرجع 6 المطبوعة من جديد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: الممثل TCRβ مكافحة سلاسل المستنسخة من SIG35α transduced خلايا T TCRβ الحيوانات المستنسخة 413، 523، 788، 1086، 794، و 830 والمستنسخة من HLA-A2 / MART1 متعدد القسيمات SIG35α إيجابية transduced خلايا T الطرفية، وبشكل فردي تتشكل من جديد على Jurkat. 76 الخلايا معربا عن CD8، جنبا إلى جنب مع سلسلة SIG35α. كان DMF5 والمستنسخة سابقا TCR عالية تقارب الاعتراف HLA-A2 / MART1. كانت ملطخة Transfectants مع PC5 مترافق مكافحة CD8 ماب (133X المخفف) وأشار HLA-A2 متعدد القسيمات (2 ميكروغرام / مل). البيانات هي تمثيلية من تجربتين مستقلة. وتشير أشرطة الخطأ النطاق. الشكل إعادة طبع بإذن من المرجع 5 (حقوق الطبع والنشر عام 2015. والجمعية الأمريكية للمناعة، وشركة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1:.. الإعداد لPMX ناقلات الهضم وترد الكواشف وأحجام كل الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
الجدول 2: إعداد ل1 شارع الجولة 5 "RACوترد E PCR. الكواشف وأحجام منها، إعدادات PCR، وتسلسل التمهيدي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
الجدول 3: إعداد ل2 الثانية الجولة 5 "سباق PCR الكواشف وأحجام منها، إعدادات PCR، ويتم عرض تسلسل التمهيدي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الشرط الأول لنجاح تطبيق هذه الطريقة هو تحقيق الكفاءة تنبيغ كافية من خلايا تي الأولية مع hemichain من الفائدة. في تجربتنا، والجمع بين استخدام PG13 كخط خلية التعبئة والتغليف وPMX كنتائج ناقلات فيروسات في التعبير مستقرة وفعالة من الجينات التي أدخلت في خلايا T الإنسان الأساسية. خلايا التعبئة والتغليف PG13 يمكن أن يكون وحيدة الخلية المستنسخة لتحديد الخلايا التعبئة والتغليف عالية عيار لتحسين كفاءة ترنسدوكأيشن. وعلاوة على ذلك، مطلوب أيضا انتشار الخلايا T للكفاءة تنبيغ عالية من الفيروس الارتجاعي. في البروتوكول وصفها، التحفيز مع ذوبان مكافحة CD3 ماب OKT3، جنبا إلى جنب مع تركيز عال من rhIL-2، يقدم إشارات تفعيل اللازمة للحث على انقسام الخلايا. ويلزم حيدات للطاقة تنشيطية من OKT3 القابلة للذوبان، على الأرجح من خلال الربط مع مستقبلات لكرة القدم. لذلك، ومعظم PBMC، وليس تنقية خلايا T، مطلوب لهذا البروتوكول التحفيز معين. تيجب أن تكون الخلايا المستزرعة في RPMI تستكمل مع المصل البشري لنتائج التجارب المثلى. جميع الخلايا الأخرى المذكورة هنا يمكن أن يكون المثقف في وجود مصل العجل الجنين.
ثانيا، يجب أن دي نوفو ولدت TCRs مستضد معين معربا عن الخلايا يكون كشفها. مؤكد hemichains TCR، مثل TAK1β، دي نوفو TCR الخلايا معربا يتم كشفها إلا بعد التحفيز مع خلايا مستضد نابض المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). وبالتالي، إذا لم يتم الكشف عن TCRs مستضد معين على الفور بعد تنبيغ hemichain مركزية، فإنها يمكن أن تكون اكتشافها بعد التوسع ناقلات الجنود المدرعة. لاحظ أن التنبيغ من hemichain غير مركزية لن تسفر دي نوفو خلايا T مستضد معين حتى بعد توسع مستضد معين مع ناقلات الجنود المدرعة، كما رأينا مع hemichain TAK1α (الشكل 1). في دراساتنا، وتستخدم multimers HLA للكشف، ولكن هذا قد لا تكون متاحة لبعض TCRs، وخاصة الطبقة HLA الثاني مقيدة TCRالصورة. وسيكون البديل للكشف عن الاستجابات الوظيفية الخلايا التائية. Hemichain transduced خلايا T يمكن حفز مع ناقلات الجنود المدرعة نابض مع مستضد من الفائدة. ناقلات الجنود المدرعة، نابض السيارة وخلايا T untransduced يمكن استخدام الضوابط. ويمكن الكشف عن الاستجابة خلايا T من upregulation من علامات تفعيل السطح مثل CD107a، الجزيء CD154، أو CD137.
وأخيرا، من المهم للتحقق من أن مكافحة سلاسل المستنسخة لا في الواقع التعرف على المستضد من الفائدة عندما يقترن مع hemichain مركزية. هذا مهم بشكل خاص عندما hemichain تتمحور هو TCRβ ومكافحة سلاسل وTCRα، منذ إقصاء الأليلي للجينات TCRα هو المتسرب وتشير التقديرات إلى أن جزءا كبيرا من الخلايا αβ تي الطرفية التعبير عن سلسلة TCRα أكثر من 28. ويمكن التأكد من التفاعل مع تلطيخ متعدد القسيمات أو قياس استجابة الوظيفية بعد التحفيز مع ناقلات الجنود المدرعة تقديم المستضد وما شابه ذلك.
واحد limitatiعلى هذا الأسلوب هو أنه ليس كل TCR سوف يؤلف hemichain مركزية، لأن كلا TCRα وTCRβ تساهم نسبيا لمستضد الاعتراف في بعض الحالات 3. لذلك، وخلايا T الطرفية transduced مع مثل hemichains غير مركزية قد لا تسفر عن دي نوفو TCRs مستضد معين.
ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب التقدم المفاهيمي على النهج التقليدي لاستنساخ TCRs، حيث يجب أن يتم استنساخ كلا TCRα وTCRβ الجينات ويجب ضمان الاقتران الصحيح 29،30. في تقنية لدينا، الاقتران بين hemichains لم يعد مصدر قلق رئيسي واحد فقط من سلاسل TCR يحتاج إلى المستنسخة، بالنظر إلى أن الآخر هو ثابت. بالإضافة إلى فئة HLA الأول أو TCRs المقيدة CD1d، ويمكن أيضا أن تطبق الطريقة الموصوفة إلى عزل TCRs الطبقة HLA الثاني المقيدة للعلاج بالجينات TCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
