Summary
여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다.
Abstract
T 세포 수용체 (TCR도)의 면역 요법의 유망 양상으로 종양 타겟팅 T 세포의 특이성을 직접 임상 사용된다. 따라서, 다양한 종양 관련 항원에 대한 특정 복제 TCR도 많은 연구의 목표였다. 효과적인 T 세포 반응을 유도하기 위해, TCR 최적 친화력 표적 항원을 인식해야한다. 그러나, 복제 등의 TCR도는 도전과 많은 사용할 수 TCR도하고 동족 항원에 대한 차선의 친 화성을 가지고있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 hemichain의 중심성을 이용하여 기존 TCR도를 사용하여 드 노보 선호도가 높은 항원 특이 TCR도를 복제하는 방법을 설명합니다. 이는 일부 TCR도, 각 TCRα 또는 TCRβ hemichain의 항원 인식에 동일하게 기여하지 않는 것으로 알려져 있으며, 지배적 hemichain는 중심 hemichain로 지칭된다. 우리는 원래 반 체인에서 다른 반 체인으로 중심 hemichain 페어링하여, 우리는 항원의를 유지할 수 있음을 보여 주었다pecificity, 동족 항원 상호 작용의 강도를 조절하면서. 따라서, 주어진 TCR의 치료 가능성은 중심과 대향 hemichains 사이의 페어링을 최적화함으로써 개선 될 수있다.
Introduction
T 세포 수용체 (TCR도)는 TCRα 및 TCRβ 쇄로 이루어지는 T 림프구에 의해 발현 이종 적응 면역 수용체이다. 그들은 HLA / 펩타이드 복합체의 거의 무한대의 구성을 인식 할 수있는 매우 다양한 레퍼토리를 생산 V (D) J 유전자 세그먼트의 체세포 재 배열을 통해 생성된다. 임상 종양 관련 항원에 대한 clonotypic TCR도의 특정을 발현하도록 유전자 조작 된 T 세포는 암 (1)의 다양한 효능을 증명하고있다. 그러나, 이러한 목적을 위해 많은 클론 TCR도 그들의 치료 학적 적용을 제한 관심있는 항원에 충분한 친 화성이 부족하다.
여기서는 체인 중심성을 이용하여 기존의 TCR도이 제한을 극복하는 방법을 설명한다. 그것은 하나의 TCR의 hemichain는 표적 항원이 인식에서 더 지배적 인 역할을 할 수 있다고보고되고있다, 여기 중심성 불린다. 크리스탈 구조 분석은 하나의 중심을 보여 주었다TCR의 hemichain는 3,4 복잡 MHC / 펩타이드의 공간의 대부분을 설명 할 수있다. 이 개념을 사용하여, 우리는 이전에 SIG35α TCRα가 TCRβ 체인의 다양한 레퍼토리와 페어링 및 HLA-A2 (5)에 의해 제시된 MART1 27-35 펩타이드에 대한 반응성을 유지할 수 있음을 증명하고있다. 유사한 결과는 중심 TCRβ의 hemichain 다양한 TCRα 사슬과 페어링 및 HLA-A24 (6)에 의해 제공되는 WT1 펩티드 235-243 반응성을 유지 TAK1 TCR로 얻었다. MART1 및 WT1 모두 종양 관련 항원이다. 체인 중심성은 다른 Vβ11 TCRβ 체인 (7) 인간하여 iNKT TCR도의 불변 Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα 체인을 페어링하여, CD1d 제한 불변 자연 살해 (인 iNKT) TCR도의 항원 인식을 연구하기 위해 적용되었다.
모든 경우에서는 트랜스로 TCR도의 드 노보 레퍼토리를 생성 할 수 있었다도입 hemichain이 내생 TCRα 또는 TCRβ 카운터 사슬와 결합 말초 혈액 T 세포에 중심 TCR의 hemichain를으로 줄. 본질적으로, 중심 hemichain 함께 쌍으로 관심의 항원 특이성을 유지 TCR도 형성하면서도 친 화성 변화 적절한 이의 사슬을 식별하는데 사용될 수있는 미끼로서 기능한다. 이러한 신규 레퍼토리에서, 우리는 기존에 비하여 TCR도 표적 항원에 대해 향상된 상호 작용 강도 clonotypic TCR도를 분리 할 수 있었다. 따라서, 우리는이 방법이 임상 응용 프로그램에 대한 최적의 TCR도를 식별하는 파이프 라인을 가속화 할 전망이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 레트로 바이러스가 관심의 인코딩 TCR Hemichain를 구축 준비
- 후속 단계에서 TCR 유전자의 삽입을 허용하도록 PMX 벡터 선형화. 3 시간 동안 37 ° C (표 1)에 제한 효소 EcoRI과 NotI을 제한 효소로 플라스미드 DNA를 소화 8.
- 1.2 % 아가 로스 겔에 소화 플라스미드의 전기 영동을 수행하십시오. 소비세 약 4,500 염기쌍 (BPS)의 밴드 및 용출은 30 ㎕의 멸균 수에 시판 겔 추출 키트 (9)를 사용.
- 또한 PMX 벡터, 각각 8의를 EcoRI 및 NotI을 소화 사이트를 겹쳐 15 ~ 20 BPS를 인코딩 관심의 TCR 유전자 설계 5 '및 3'프라이머.
- 프라이머와 TCR 유전자를 증폭. 단계 1.2에 설명 된대로 약 1,000 BPS의 PCR 제품 및 용출 밴드의 전기 영동을 수행하십시오.
- 시판되는 플라스미드를 각각 선형 단편을 조합함으로써 소화 벡터에 TCR 유전자를 복제어셈블리 마스터 믹스 시약을 1 시간 동안 50 ° C에서 배양.
주 : 각 구성 요소의 상대적 볼륨에 대한 제조 업체의 프로토콜을 참조하십시오. 이 조립 방법은 원래 깁슨 외. (10)에 의해 기술 된 방법에 기초한다. - (선택 사항) 태그 TCR 유전자가 인간의 신경 성장 인자 수용체의 절단 된 형태로 세포를 형질 표시하려면 (ΔNGFR, 아미노산 1-277) (11)는 furin 분열 사이트, 세린 - 글리신 링커에 의해 분리하고, 2A는 12, 13을 시퀀스. 단편의 단부를 중첩 및 단계 1.3-1.5에 기재된 플라스미드를 조립 설계 프라이머 코딩 서열.
참고 :이 시퀀스는 참조 11-13에서 찾을 수 있습니다. - 화학적으로 유능한 E. 변환 제조 업체의 프로토콜 (14) 다음 조립 플라스미드를 가진 대장균. 한천 접시에 씨앗 변형 박테리아 (20 ㎎ / ㎖ 원성 국물 (LB), 15 ㎎ / ㎖ 한천, 1 μg의 / ㎖ 암피실린), 18 시간 동안 37 ° C에서 품어. 문화 37 ° C 및 분 당 200 원에서 진탕 배양기에서 16 시간 동안 50 LB 배지 ㎖ (20 ㎎ / ㎖ LB 1 μg의 / ㎖ 암피실린)에서 하나의 박테리아 식민지.
- 제조 업체의 프로토콜 시판 midiprep 키트를 사용하여 플라스미드를 정제. 약 1 μg의 / μL의 농도에 플라스미드를 희석.
주 : 플라스미드 정제 프로토콜은 알칼리 추출 방법 (15)에 기초한다.
2. 생성 안정 포장 세포주
참고 : 293GPG 및 PG13 두 세포가 부착된다. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 배양 된 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신으로 보충. 형질 전환 이전에 1 μg의 / ㎖ 테트라 사이클린과 문화 293GPG 세포. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.
- 단계 1.9, USI에서 얻은 hemichain 인코딩 벡터와 T75 플라스크에 16 배양 형질 293GPG 포장 세포제조사의 프로토콜 1~7 시판되는 형질 감염 시약 겨. 참고 : 50-60%의 포화 상태에서의 형질 293GPG 세포.
- 대기음 293GPG 세포 매체와 신선한 DMEM 매체 일일 포스트 형질 10 ㎖를 추가합니다.
- 수확은 일시적으로 이일 주사기에 배지를 전달하고 0.45 μm의 필터를 통과하여 단계 2.2 이후 형질 293GPG 세포로부터 바이러스를 생산했다.
참고 : 바이러스는 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. - T25 플라스크 문화는 1 × 10 5 PG13 세포. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 어느 날 기음 문화 매체와 폴리 브렌 8 μg의 / ㎖와 함께, 단계 2.3 및 1.5 ml의 DMEM 매체로부터 293GPG 유래 바이러스의 1.5 ml를 추가 한 후.
- 4 일 동안 하루에 한 번 단계 2.4에 설명 된대로 관심의 TCR의 hemichain를 인코딩 안정 PG13 포장 세포주 생산 레트로 바이러스를 설정, 매체를 변경합니다.
- 대기음 매체 및 교체24 시간 더 배양을위한 마지막 감염 후 PG13 세포주에 대한 신선한 DMEM 매체와.
주 : 0.05 % 트립신 EDTA 용액으로 분리하여 냉동 또는 하위 문화 세포. - 세포를 시딩 한 후 단계 2.3 사흘 바와 같이 형질 도입 PG13 세포주에서 바이러스 T75에서 2 × 106 세포를 10 mL의 DMEM 배지로 플라스크 배양 및 수확 바이러스를 생성한다.
주 : 바이러스 가장 즉시 사용되지만, 최대 두 달 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
3. 활성화 및 형질 인간 T 세포
참고 : 인간의 샘플을 얻을 및 기관 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 사용됩니다. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 문화의 기본 인간의 세포 (RPMI) 매체는 10 % 인간 혈청 대신 FCS 및 50 μg의 / ㎖ 겐타 마이신으로 보충. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.
- 밀도 분리 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)제조 업체의 프로토콜 (18) 다음 그라데이션 분리.
- 레트로 바이러스 감염에 필요한 증식을 유도하는 T 세포를 활성화. 재조합 인간 인터루킨 2 항 CD3 단클론 항체 (rhIL-2) 및 50 ng를 / ㎖의 100 IU / ㎖와 RPMI 배지 5 ㎖ 6 웰 플레이트에 웰 당 문화 2 × 10 7 신선한 또는 해동 PBMC, (클론 OKT3).
- 세 일, 자극을 게시 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 상청액을 폐기하고, 단계 270에서 PG13 바이러스 1 ㎖에 재현 탁하고, 24 웰 플레이트에 웰 당 0.5 × 106 T 세포를 시드와 rhIL-2, 200 IU / ㎖로 보충 된 RPMI 배지 1 ㎖. 원심 분리기 1000 XG에 접시와 1 시간 동안 32 ° C.
- 24 시간 후, 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 단계 2.7에서 PG13 바이러스 상등액 1 ㎖에 재현 탁하고 세포를 폐기하고, rhIL-2, 200 IU / ㎖로 보충 된 RPMI 배지 1 ㎖. (6)을 감염의 총에 대해이 단계를 반복합니다이온.
참고 : 감염의 수 세포주 포장에 의해 생성 된 바이러스의 역가에 따라 최적화되어야한다. 필요한 경우 매일 세포의 20 ~ 30 %를 제거하여 통로 T 세포 과증식을 방지 할 수있다. - 24 시간 마지막 감염 후 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 또한 문화 rhIL-2의 100 IU / ㎖와 RPMI 배지에서 뜨는에 resuspend 세포를 폐기하십시오.
- 2-3일 단계 3.5, 15 분 동안 4 ° C에서 30 분 동안 4 ° C, 다음 항 인간 CD3에서 HLA의 다량 체와 공동 수용체 단클론 항체 (단클론 항체)와 얼룩 T 세포 후. 유동 세포 계측법에 의해 분석합니다. 19 - 관련성이 다량 체 및 / 또는 음성 대조군 (3 그림 1)과 같은 untransduced 세포를 사용합니다.
- 도입 중심 hemichain가 TCRα 체인 경우 20 유세포 시판 Vβ 특정 항체의 패널을 사용하여 새로이 합체 양성 세포 Vβ 사용을 분석한다.
4. 복제 드 노보 TCR 카운터 hemichains
- 흐름 이용한 세포 분류에 의해 단계 3.6 정렬 드 노보 다량 체 긍정적 인 인구.
- 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출법 21,2 (2)를 사용하여 정렬 T 세포로부터 RNA를 분리.
주 : RNA는 -80 ℃에서 저장 될 수 있지만, 가능한 한 빨리의 cDNA를 생성하는데 사용되어야한다. - 제조 업체의 프로토콜 23, 24 다음 시중에서 판매하는 역전사 효소-PCR 키트를 사용하여 추출 된 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 합성.
- TCRβ 카운터 - 체인을 복제하는 경우, 전체 길이를 단계 3.7에서의 결정에 따라, Vβ 유전자와 TCRβ 불변 영역 특정 프라이머를 설계하고, 복제 TCRβ 단계 1.3-1.9에서 설명하는 유전자있다. 그렇지 않으면 5.1 단계로 진행 단계 카운터 체인 TCRα 경우 4.5를 참조하십시오.
- 시판 Vα 특정 항체가 제한된다, 따라서 Vα 유전자의 사용은 할 수 없습니다유동 세포 계측법에 의해 결정된다. cDNA를 종료 (RACE) 25 5'-빠른 증폭을 통해 복제 TCRα 카운터 - 체인, 5 'RACE 키트 (6) 시판 사용.
- 제조 업체의 프로토콜 다음 단계 4.2에서 추출 RNA의 5 'RACE 호환의 cDNA를 합성.
- 표 2에 기술 된 바와 같이 1 차 라운드 PCR을 수행합니다.
- PCR 산물의 전기 영동을 수행하여 단계 1.2에 기재된 바와 같이, 약 1,100의 BPS 밴드를 용출.
- 주형으로서 1 차 라운드 PCR 생성물을 사용하여, 표 3에 기재된 바와 같이 2 차 라운드 PCR을 수행한다.
참고 : 표 3에서 나타낸 프라이머 시퀀스를 EcoRI 및 NotI에에 복제를 위해 설계되었습니다는 PMX 벡터를 소화. - PCR 산물의 전기 영동을 수행하여 단계 1.2에 기재된 바와 같이, 약 1,000의 BPS 밴드를 용출.
- 를 EcoRI 및 NotI에로 복제 TCRα 유전자 PMX 벡터와 푸리을 소화같은 년도 플라스미드 단계 1.5-1.9에 설명.
5. 재구성 소설 항원 특이 적 TCR 클론
주 : RPMI 배지에서 배양 된 Jurkat 세포 (76) 및 후속 세포주는 10 % FCS, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신으로 보충. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.
- 단계 230에서 생성 293GPG 바이러스를 이용하여 중심의 TCR hemichain으로 (사람 T 세포주 - - / 또는 등가 TCR)는 Jurkat 세포 76 (26) 형질 도입. 주르 케트 (76) 씨 RPMI 매체의 1 바이러스 mL 및 1 ml의 24 웰 플레이트에 웰 당 5 × 10 4 세포하십시오. 원심 분리기 1000 XG에 접시와 1 시간 동안 32 ° C.
- 24 시간 감염 후 4 분 동안 350 XG에 hemichain 형질 도입 된 Jurkat에게 피펫과 원심 분리기 76 세포를 수집합니다. 또한 문화에 대한 신선한 RPMI 매체에 뜨는 및에 resuspend 폐기하십시오.
- hemichain이 2-3일 단계 5.2 이후 태그 분자의 경우 얼룩에 의해, 형질 세포를 정화흐름 보조 또는 자기 보조 세포 (옵션) (27)를 정렬 한 다음 반 NGFR 단클론 항체 결합 형광으로 보내고.
- 단계 2.1 2.3에 따라, 293GPG 바이러스가 단계 4.4 또는 4.5에서 클로닝 TCR 카운터 체인을 인코딩 생산하고 있습니다.
- TCR을 완전히 재구성 안정적으로 단계 5.4로부터의 바이러스를 사용하는 단계 5.1-5.3에서 생성 중심의 hemichain TCR을 발현하는 T 세포주를 형질 도입. 단계 5.1-5.2에 설명 된대로 전달을 수행합니다.
- 2~3일 단계 5.5 27 후, 제조 업체의 프로토콜 다음 항 CD3에게 자기를 이용한 세포 정렬을 사용하여 CD3 + 형질을 정화.
- 항원 특이성을 확인하려면, 항 CD3 및 / 또는 공동 수용체 단클론 항체, 및 HLA의 다량 체와 다양한 반 사슬과 쌍을 이루는 중심 TCR의 hemichain 구성 clonotypic TCR도를 발현하는 형질 얼룩 3-5 일 CD3 정화를 게시합니다. 19 - 유동 세포 계측법 (5 그림 4)에 의한 세포를 분석 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
사전 지식없이하는 hemichain의 TCRα 및 TCRβ 체인은 별도 복제 및 HLA-A24 / WT1 반응 TAK1 TCR (그림 1)의 경우에 이루어졌다 말초 혈액 T 세포에 형질 도입해야 체인 중심이다. TAK1β의 전달은 항원 특이 적 T 세포의 현저히 더 높은 주파수를 수득 하였다. 반대로, 비 중심 hemichain의 전달은 드 노보 합체 양성 T 세포 TAK1α 체인 것과 같이 (도 1)를 산출하지 않았다. 분석하는 동안, NGFR + 세포 게이트는 TCR 유전자는 특히 (- 2 그림 1) 형질 세포를 분석 태그 된 경우. 이 우세한 것으로 알려져 있으면 한편, 단일 중심 hemichain는, 예를 들면 SIG35α 및 불변 Vα24 TCRα 체인 (도 2 및 3) 형질 도입 될 수있다. 각 cogn 특정 T 세포중심 TCRα의 hemichain의 전달에 주파수 증가 항원을 먹었다. (그림 2-3). 함께, 이러한 데이터는 관심의 항원 - 특이 드 노보 TCR도를 생성 할 수 있습니다 말초 혈액 T 세포에 중심 TCRα 또는 TCRβ hemichain의 소개를 보여줍니다.
항원 특이 적 집단 정렬 흐름 이용한 전지를 기준으로 정렬 할 수 있고, 제 Clonotypic TCR 이의 사슬 개별적 안정적 중심 hemichain를 발현하는 T 세포주에 재구성 될 수있는 프로토콜 절에 설명 된 TCR의 hemichains 클로닝 할 수있다. 주르 케트 (76) 형질이 새롭게 TAK1β 또는 SIG35α 중심의 hemichain 형질 T 세포의 TCR도 독특한 클로닝을 발현 5,6- 염색 합체 HLA / 펩티드에 의해 결정되는, 각각의 동족 항원에 대한 결합력을 보유 변화. 특히, 우리는 드 노보 TCRα 반대 체인 t을 분리 할 수 있었다TAK1β와 짝 모자는 부모의 TAK1αβ 페어링보다 WT1 항원 복합체에 의해 낮거나 높은 강도 (그림 4) 중 하나를 염색 하였다. 마찬가지로, SIG35α 고유 카운터 체인과 짝 높은 결합력 (그림 5) 중등도와 HLA-A2 / MART1을 인정했다. SIG35α가 TCRαβ 이질 (5)의 독립적 인 복제하고, 따라서이 hemichain에 대한 부모의 페어링은 비교를 위해 사용할 수 있었다. 중요한 것은, 이러한 데이터는 다양한 이의 사슬과 중심 hemichain 페어링하여 표적 항원에 대한 친 화성을 조정하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
그림 1 :. TAK1β HLA-A24 / WT1 반응 TAK1 TCR의 HLA-제한 TCRβ 중심의 hemichain TCRα 또는 TCRβ hemichains의 예를 들어 절단 된 신경 성장 인자 RECE로 태그되었습니다ptor (ΔNGFR) 개별적으로 말초 혈액 T 세포에 형질 도입. 형질 전환은 PC5 공역 항 CD8 (133X 희석) 및 (모노클로 날 항체) (20 배 희석) 모노클로 날 항체 항 NGFR FITC 접합 물들 및 표시 하였다 합체 HLA-A24 두 배 항원 특이 적하기 (5 μg의 / ㎖) 자극. 6 기증자의 총 시험 하였다. 모든 데이터는 NGFR + 세포에 문이 있었다. 그림 재 인쇄 기준 (6)의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. SIG35α HLA 제한 TCRα의 중심의 hemichain의 일례 SIG35α TCRα의 ΔNGFR 태그 체인 또는 단독 태그는 말초 혈액 T 세포에 형질 도입 하였다. 형질은 PC5 공동으로 염색 하였다njugated 항 CD8 (133X 희석) 및 FITC 공액 안티 NGFR 대한 mAb (20 배 희석), 및 HLA-A2의 다량 체 (8 μg의 / ml)로 나타내었다. 4 기증자의 총 시험 하였다. 모든 데이터는 NGFR + 세포에 문이 있었다. 그림 재 인쇄 참조 5 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 주식 회사)의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 불변 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포 수용체 Vα24 (Vα24i) CD1d 제한 TCRα의 중심에 hemichain의 예로서 Vα24i TCRα 체인은 말초 혈액 T 세포에 형질 도입 하였다. 형질은 FITC - 복합 항 CD3 (20 배 희석) 단클론 항체로 염색과 CD1d의 다량 체 (5 μg의 / ㎖)을 표시 하였다. 언로드 CD1d 모lecules는 HEK293 세포 및 본 내인성 알 자체 지질로부터 제조 하였다. 하여 iNKT TCR은 α-GalCer 또는 아날로그 PBS-57를 제시 CD1d의 인식에 의해 정의된다. 4 기증자의 총 시험 하였다. 그림 재 인쇄 참조 7의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. TAK1β에서 복제 대표 TCRα 반대 체인 TCRα 클론의 T262, A262, A186, A133을 T 세포를 형질 도입하고, T4는 HLA-A24 / WT1에서 복제 된 다량 체 긍정적 인 TAK1β 형질 말초 T 세포를 개별적으로 된 Jurkat 76 세포에서 재구성 TAK1β 체인과 함께 CD8를 발현. 형질은 PC5 - 복합 항 CD8 단클론 항체 (133X 희석)로 염색과 HLA-A24를 표시했다다량 체 (5 μg의 / ㎖). 데이터를 대표하는 두 개의 독립적 인 실험이다. 오차 막대 범위를 나타냅니다. 그림 재 인쇄 기준 (6)의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 : SIG35α로부터 클로닝 주제 TCRβ 이의 사슬 T 세포를 형질 TCRβ 클론 413, 523, 788, 1086, 794, 830는 HLA-A2 / MART1에서 합체 긍정적 SIG35α 형질 말초 T 세포를 클로닝하고, 개별적으로는 Jurkat에 재구성 하였다. SIG35α 체인과 함께 76 CD8를 발현하는 세포. DMF,이 HLA-A2 / MART1을 인식 이전에 복제 선호도가 높은 TCR했다. 형질은 PC5 - 복합 항 CD8 단클론 항체 (133X 희석)로 염색과 HLA-A2의 다량 체 (2 μg의 / m을 표시했다엘). 데이터는 두 개의 독립적 인 실험을 대표한다. 오차 막대 범위를 나타냅니다. 그림 재 인쇄 참조 5 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 주식 회사)의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 :.. PMX 벡터 소화 설치 시약 및 각각의 볼륨이 표시됩니다 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : 1 차 라운드 5 'RAC 설치 프로그램E PCR. 시약 및 각각의 볼륨, PCR 설정 및 프라이머 시퀀스가 표시됩니다. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 3 :.. 2 차 5 'RACE PCR 시약과 각각의 볼륨, PCR 설정 및 프라이머 시퀀스가 표시됩니다 라운드 설정 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 방법을 성공적으로 적용하는 첫 번째 요건은 관심 hemichain 일차 T 세포의 충분한 전달 효율을 달성한다. 경험 인간 T 세포 주에서 도입 유전자의 안정하고 효율적인 발현 레트로 바이러스 벡터의 결과로서 패키징 세포주와 PMX로서 PG13를 사용하는 조합. PG13 패키징 세포는 형질 도입 효율을 향상시키는 고역가 포장 셀 선택 클로닝 단일 셀 수있다. 또한, T 세포 증식은 또한 레트로 바이러스에 의한 높은 전달 효율을 위해 요구된다. 기술 된 프로토콜, rhIL-2의 높은 농도와 함께 가용성 항 -CD3 단클론 항체 OKT3 자극은 세포 분화를 유도하는 데 필요한 활성화 신호를 제공한다. 단핵구 가능성이 Fc 수용체와 결합을 통해, 가용성 OKT3의 자극 용량이 필요합니다. 따라서, 벌크 PBMC, 그리고이 T 세포를 정제하여, 특정 자극 프로토콜에 대해 요구된다. 티RPMI 최적의 실험 결과 인간 혈청 세포 배양해야한다. 여기에 설명 된 모든 다른 셀은 소 태아 혈청의 존재 하에서 배양 할 수있다.
둘째, 세포를 표현 새로이 생성 된 항원 특이 적 TCR도는 감지해야합니다. 이러한 TAK1β 같은 특정 TCR의 hemichains, 들어, 드 노보 TCR 발현하는 세포는 항원 펄스 항원 제시 세포 (장갑차)와 자극 후 만 검출 할 수 있습니다. 항원 특이적인 TCR도가 중심 hemichain의 전달 후에 즉시 검출되지 않는 경우 즉, 이들은 장갑차 의해 전개 후 검출 될 수있다. TAK1α의 hemichain (도 1)를 본도 장갑차 가진 항원 특이 팽창 후에 새로이 항원 특이 적 T 세포를 생성하지 않는 것 인 중심 hemichain의 전달을 참고. 우리의 연구에서 HLA의 다량이 검출에 사용된다, 그러나이 일부 TCR도, TCR 제한 특히 HLA 클래스 II에 대한 사용하지 못할 수 있습니다에스. 대안은 T 세포 기능 응답을 검출하는 것이다. Hemichain 형질 T 세포가 관심있는 항원 펄스 장갑차로 자극 될 수있다. 차량 펄스 장갑차 및 untransduced T 세포는 대조군으로 사용할 수있다. 응답 T 세포는 이러한 CD107a, CD154, CD137 또는 등 표면 활성화 마커의 상향 조절을 검출 할 수있다.
마지막으로,이 중심 hemichain와 결합 할 때 복제 반대 체인이 사실에 관심있는 항원을 인식 않는다는 것을 확인하는 것이 중요하다. TCRα 유전자에 대한 대립 유전자 배제 누설이고 말초 αβ의 T 세포의 상당한 부분은 둘 이상의 TCRα 체인 (28)을 표현하는 것으로 예상되기 때문에, 중심 hemichain가 TCRβ이며 이의 사슬 TCRα을 때 특히 중요하다. 반응성 합체 염색 또는 동족 항원 제시 장갑차 자극 후 기능성 반응을 측정하여 확인할 수있다.
하나 limitatiTCRα 및 TCRβ 둘 경우 3 인식 항원에 상대적으로 기여하기 때문에이 기술에 모든 TCR이 중심 hemichain을 구성 할 수 없습니다 것입니다. 따라서, 이러한 비 중심 hemichains 형질 말초 T 세포는 새로이 항원 특이적인 TCR도를 얻을 수 없다.
그럼에도 불구하고,이 방법은 TCRα 및 TCRβ 두 유전자가 복제되어야하며 올바른 페어링이 29, 30를 확보해야 복제 TCR도에 기존의 접근 방식에 따라 개념적 발전을 나타냅니다. 우리의 기술에서, hemichains 사이 쌍이 더 이상 주요 관심사 및 TCR 사슬의 한 다른 고정 점을 감안 복제 될 필요가 없다. HLA 클래스 I 또는 CD1d 제한 TCR도 외에, 설명 된 방법은 TCR 유전자 요법을위한 HLA 클래스 II 제한 TCR도의 분리에 적용될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
