Summary
Häri beskriver vi en ny metod för att generera antigenspecifika T-cellreceptorer (TCR) genom att para ihop den TCRα eller TCRβ av en befintlig TCR, som har den antigenspecificitet av intresse, med komplementär hemichain av den perifera T-cell-receptorrepertoar. De novo genererade TCRs behålla antigen-specificitet med varierande affinitet.
Abstract
T-cellreceptorer (TCR) används kliniskt för att styra specificiteten hos T-celler att rikta tumörer som en lovande modalitet av immunterapi. Därför har kloning TCRs specifika för olika tumörassocierade antigener varit målet för många studier. Att framkalla ett effektivt T-cellsvar, måste TCR erkänna målantigenet med optimal affinitet. Emellertid har kloning sådan TCR varit en utmaning och många tillgängliga TCR har suboptimal affinitet för besläktade antigen. I detta protokoll, beskriver vi en metod för kloning de novo hög affinitet antigenspecifika TCR med hjälp av befintliga TCR genom att utnyttja hemichain fokus. Det är känt att för vissa TCR, var och TCRα eller TCRβ hemichain inte lika bidra till antigenigenkänning, och den dominerande hemichain benämnes den centrerad hemichain. Vi har visat att genom att para ihop den centrerad hemichain med kontra kedjor som skiljer sig från den ursprungliga kontra kedja, har vi möjlighet att upprätthålla antigen specificity, medan modulera dess interaktion styrka för besläktade antigen. Sålunda kan den terapeutiska potentialen för en given TCR förbättras genom optimering av parning mellan de centric och räknar hemichains.
Introduction
T-cellreceptorer (TCR) är heterodimera adaptiva immun receptorer som uttrycks av T-lymfocyter, som består av en TCRα och TCRβ kedjan. De genereras via somatisk omlagring av V (D) J-gensegment, som producerar en i hög grad mångsidig repertoaren förmåga att känna igen praktiskt taget obegränsade konfigurationer av HLA / peptidkomplex. Kliniskt har T-celler manipulerade att uttrycka klonotypisk TCR specifik för tumörassocierade antigener visat effekt i en rad olika cancerformer 1. Men många TCR klonade för detta ändamål saknar tillräcklig affinitet för antigenet av intresse, som begränsar deras terapeutiska tillämpning.
Här beskriver vi en metod för att övervinna denna begränsning för befintliga TCRs genom att utnyttja kedjan fokusering. Det har rapporterats att en TCR hemichain skulle kunna spela en mer framträdande roll som ett erkännande av målantigenen 2, här benämnd Centricity. Crystal strukturella analyser har visat att en centreradhemichain av en TCR skulle kunna stå för huvuddelen av fotavtryck på MHC / peptidkomplexet 3,4. Med hjälp av detta koncept har vi tidigare visat att SIG35α TCRα kan koppla ihop med en varierad repertoar av TCRβ kedjor och bibehålla reaktiviteten mot MART1 27-35-peptiden presenteras av HLA-A2 5. Liknande resultat erhölls med TAK1 TCR, där centrerad TCRβ hemichain paras ihop med olika TCRα kedjor och underhållas reaktivitet för WT1 235-243 peptiden presenteras av HLA-A24 6. Både MART1 och WT1 är tumörassocierade antigener. Chain fokusering också tillämpas för att studera antigen erkännande av CD1d-begränsade invariant naturliga mördar (inkt) TCR, genom att para ihop den invarianta Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα kedja av mänskliga inkt TCR med olika Vβ11 TCRβ kedjor 7.
I samtliga fall kunde vi generera en de novo repertoar av TCR genom transrande av den centrerad TCR hemichain till perifert blod T-celler, där den införda hemichain parat med den endogena TCRα eller TCRβ counter-kedjor. I huvudsak tjänar centrerad hemichain som ett bete som kan användas för att identifiera lämpliga motåtgärder kedjor, som när parade tillsammans bildar TCR som upprätthåller antigen specificitet intresse, men varierande affinitet. Från dessa nya repertoarer, kunde vi isolera klonotypisk TCR med förbättrad interaktion styrka mot målantigenet jämfört med befintliga TCR. Därför tror vi att denna metod kommer att påskynda pipeline att identifiera optimala TCR för klinisk tillämpning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Retroviral Construct Kodning TCR Hemichain besöksmål
- Linjärisera PMX-vektor för att medge införandet av en TCR-gen i efterföljande steg. Smälta den plasmid-DNA med EcoRI- och Notl-restriktionsenzymer vid 37 ° C under 3 h (Tabell 1) 8.
- Utföra elektrofores av den digererade plasmiden på 1,2% agarosgel. Punkt band av ca 4500 baspar (bps), och eluera i 30 l sterilt vatten med hjälp av kommersiellt tillgängliga gel utvinning kit 9.
- Konstruktions 5'- och 3'-primrar för TCR-genen av intresse som också koda 15-20 bps lappande matsmältningen-stället i PMX vektor, respektive åtta EcoRI och Notl.
- Amplifiera TCR-genen med primrar. Utföra elektrofores av PCR-produkten och eluera band av ca 1000 bps såsom beskrivs i steg 1,2.
- Klona TCR-genen i uppsluten vektor genom att kombinera varje linjära fragmentet med kommersiellt tillgängliga plasmidmontering Master Mix reagens och inkubering vid 50 ° C under 1 timme.
OBS: Se tillverkarens protokoll för relativa volymer av varje komponent. Denna sammansättningsmetod är baserad på den teknik som ursprungligen beskrivits av Gibson et al. 10. - (Tillval) Tag TCR-genen för att markera omvandlade celler med stympad form av human nervtillväxtfaktorreceptor (ΔNGFR, aminosyror 1-277) 11 åtskilda av furin klyvningsställe, serin-glycin länk, och 2A-sekvenserna 12,13. Design primers kodande sekvenser som överlappar de fragmentändarna och montera plasmid som beskrivs i steg 1,3-1,5.
OBS: Dessa sekvenser kan hittas i referenser 11-13. - Transformera kemiskt kompetenta E. coli med monterad plasmiden efter tillverkarens protokoll 14. Frö transformerade bakterier på agarplattor (20 mg / ml lysogeni buljong (LB), 15 mg / ml agar, och 1 | ig / ml ampicillin) och inkubera vid 37 ° C under 18 h. Kultur en enda bakterie koloni i 50 ml LB-medium (20 mg / ml LB och 1 | j, g / ml ampicillin) för 16 h i en skakinkubator vid 37 ° C och 200 varv per minut.
- Rena plasmider med användning av kommersiellt tillgängliga Midiprep kit följande tillverkarens protokoll. Späd plasmid till en koncentration av cirka 1 mikrogram / l.
OBS: Plasmiden reningsprotokoll är baserad på den alkaliska extraktionsmetoden 15.
2. Generera Stabil paketerande cellinje
OBS: Både 293GPG och PG13 celler är anhängare. Kulturceller i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS) och 50 | j, g / ml gentamicin. Kultur 293GPG celler med 1 mikrogram / ml tetracyklin före transfektion. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 mellan alla steg.
- Transfektera 293GPG förpackningsceller 16 odlade i T75-kolv med hemichain-kodningsvektor som erhållits i steg 1,9, USIng kommersiellt tillgängliga transfektionsreagens efter tillverkarens protokoll 1 7. OBS: Transfektera 293GPG celler vid 50-60% konfluens.
- Aspirera medium för 293GPG celler och tillsätt 10 ml färskt DMEM-medium en dag efter transfektion.
- Harvest transient producerade virus från transfekterade 293GPG celler 2 dagar efter steg 2,2 genom att överföra odlingsmedium för att spruta och passera genom 0,45 um filter.
OBS: Virus kan användas omedelbart eller lagras vid -80 ° C för framtida användning. - Kultur 1 x 10 5 PG13 celler i T25-kolv. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Efter en dag, aspirera odlingsmedium och tillsätt 1,5 ml 293GPG härledda viruset från steg 2,3 och 1,5 ml DMEM-medium, tillsammans med 8 pg / ml polybren.
- Ändra det medium som beskrivs i steg 2,4 gång per dag under 4 dagar, för att etablera stabila PG13 förpackningar cellinje som producerar retrovirus som kodar för TCR hemichain av intresse.
- Aspirera medium och ersättmed färskt DMEM-medium för PG13 cellinjer 24 timmar efter sista infektion för ytterligare odling.
OBS: Freeze eller sub-kulturceller genom att lossa med 0,05% trypsin-EDTA-lösning. - För att producera virus från transducerade PG13 cellinjer, kultur 2 x 10 6 celler i T75-kolv med 10 ml DMEM-medium, och skörd viruset såsom beskrivs i steg 2.3 tre dagar efter sådd av cellerna.
OBS: Virus är bäst användas omedelbart men kan lagras vid -80 ° C under upp till två månader.
3. Aktivering och Transduction av humana T-celler
OBS: Mänskliga sampel erhålls och används i enlighet med de institutionella etiska kommittén godkända protokoll. Kultur primära humana celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplementerat med 10% humant serum i stället för FCS och 50 | j, g / ml gentamicin. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 mellan alla steg.
- Isolera humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) från densitetgradient separation efter tillverkarens protokoll 18.
- Aktivera T-celler att inducera proliferation krävs för retroviral infektion. Kultur 2 x 10 7 färskt eller upptinat PBMC per brunn i 6-brunnsplatta, i 5 ml RPMI-medium med 100 lU / ml av rekombinant humant interleukin-2 (rhIL-2) och 50 ng / ml av anti-CD3-monoklonal antikropp (klon OKT3).
- Tre dagar efter stimulering, samla T-celler genom pipettering och centrifugera vid 350 xg under 4 minuter. Kassera supernatanten och utsäde 0,5-1 x 10 6 T-celler per brunn i 24-brunnar resuspenderades i 1 ml PG13-virus från steg 2,7, och 1 ml RPMI-medium kompletterat med 200 lU / ml av rhIL-2. Centrifugera plattan vid 1000 x g och 32 ° C under 1 timme.
- Efter 24 h, samla T-celler genom pipettering och centrifugera vid 350 xg under 4 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml PG13-virus från steg 2,7, och 1 ml RPMI-medium kompletterat med 200 lU / ml av rhIL-2. Upprepa detta steg för totalt 6 infekterajoner.
OBS: Antal infektioner bör optimeras beroende på titer av virus producerat av förpackningar cellinje. Om det är nödvändigt, att passage T-celler genom att ta bort 20-30% av cellerna varje dag förhindra överväxt. - 24 h efter den sista infektionen, samla T-celler genom pipettering och centrifugera vid 350 xg under 4 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i RPMI-medium med 100 IE / ml rhIL-2 för ytterligare odling.
- 2-3 dagar efter steg 3,5, bets T-celler med HLA multimer vid 4 ° C under 30 min, därefter anti-humant CD3 och co-receptorantikroppar (mAbs) vid 4 ° C under 15 min. Analysera med flödescytometri. Använd irrelevant multimer och / eller otransducerade celler som negativa kontroller (Figur 1-3) 19.
- Om den införda centrerad hemichain är en TCRα kedja, analysera Vp användning av de novo multimer positiva celler med användning av kommersiellt tillgängliga Vp-specifik antikropp panel med flödescytometri 20.
4. Kloning De Novo TCR Counter-hemichains
- Sortera novo multimeren positiv befolknings de i steg 3,6 av flödes assisterad cellsortering.
- Isolera RNA från sorterade T-celler genom att använda syra guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformextraktion metod 21,2 2.
OBS: RNA kan förvaras vid -80 ° C, men bör användas för att generera cDNA så snart som möjligt. - Syntetisera cDNA-bibliotek från extraherat RNA med användning av kommersiellt tillgängliga omvänt transkriptas-PCR-kit enligt tillverkarens protokoll 23,24.
- Om kloning TCRβ counter-kedjor, utforma Vp-genen och TCRβ konstant regionspecifika primers, som bestämts i steg 3,7, och klona fullängds TCRβ gener som beskrivs i steg 1,3-1,9. Se steg 4,5 om kontra kedja är TCRα, annars fortsätter du till steg 5,1.
- Kommersiellt tillgängliga Va-specifika antikroppar är begränsade, vilket Va-genanvändning kan intebestämmas genom flödescytometri. Klon TCRα counter-kedjor via 5'-snabb förstärkning av cDNA-ändar (RACE) 25, med användning av kommersiellt tillgängliga 5 'RACE kit 6.
- Syntetisera 5 'RACE-kompatibel cDNA från RNA extraherat i steg 4,2 efter tillverkarens protokoll.
- Utför en st runt PCR som beskrivs i tabell 2.
- Utföra elektrofores av PCR-produkten och eluera band av ca 1100 bps, såsom beskrivs i steg 1,2.
- Utföra 2 nd runda PCR såsom beskrivs i tabell 3, med användning av en st round PCR-produkt som mall.
OBS: Primer sekvenser som visas i tabell 3 utformades för kloning in i EcoRI och NotI digererad PMX vektor. - Utföra elektrofores av PCR-produkten och eluera band av ca 1000 bps, såsom beskrivs i steg 1,2.
- Klon TCRα gener i EcoRI och NotI digererad PMX vektor och puriFY plasmider som beskrivs i steg 1,5-1,9.
5. rekonstituera Novel Antigen-specifika TCR Kloner
OBS: Culture Jurkat 76-celler och efterföljande cellinjer i RPMI-medium kompletterat med 10% FCS och 50 | j, g / ml gentamicin. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 mellan alla steg.
- Transducera Jurkat 76 celler 26 (eller motsvarande TCR - / - human T-cellinje) med centrisk TCR hemichain använder 293GPG virus producerat i steg 2,3. För Jurkat 76, frö 5 x 10 4 celler per brunn i 24-brunnar med 1 ml av virus och 1 ml RPMI-medium. Centrifugera plattan vid 1000 x g och 32 ° C under 1 timme.
- 24 timmar efter infektion, samla hemichain omvandlade Jurkat 76 celler genom pipettering och centrifugera vid 350 xg under 4 min. Kassera supernatanten och återsuspendera i färskt RPMI medium för ytterligare odling.
- Rena transducerade celler om hemichain är molekylärt taggade 2-3 dagar efter steg 5,2 genom fläcking med fluorofor konjugerad anti-NGFR mAb följt av flödesassisterad eller magnetiskt assisterad cellsortering (tillval) 27.
- Efter steg 2,1 till 2,3, producera 293GPG virus som kodar för en TCR kontra kedja klonas från steg 4.4 eller 4.5.
- För att till fullo återskapa TCR, transducera T-cellinje som stabilt uttrycker centrerad TCR hemichain genereras i steg 5.1-5.3 använder viruset från steg 5,4. Utför överföring som beskrivs i steg 5,1-5,2.
- Rena CD3 + transfektanter som använder anti-CD3 magnetisk assisterad cellsortering efter tillverkarens protokoll, 2-3 dagar efter steg 5,5 27.
- För att validera antigen specificitet, färga transfektanterna uttrycker klonotypisk TCR består av centrerade TCR hemichain paras ihop med olika kontrakedjor, med anti-CD3 och / eller co-receptor mAbs, och HLA multimer, 3-5 dagar efter CD3 rening. Analysera cellerna genom flödescytometri (figur 4-5) 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utan förkunskaper som hemichain är chain-centrerad, den TCRα och TCRβ kedjan bör separat klonas och omvandlas till perifert blod T-celler, som gjordes i fallet med HLA-A24 / WT1 reaktivt TAK1 TCR (figur 1). Transduktion av TAK1β gav en märkbart högre frekvens av antigenspecifika T-celler. Omvänt skulle transduktion av en icke-centrerad hemichain inte att ge de novo multimer positiva T-celler, vilket kan ses med TAK1α kedja (figur 1). Under analys, grind på NGFR + celler om TCR-genen märktes att särskilt analysera omvandlade celler (Figur 1-2). Å andra sidan kan den enda centrerad hemichain transduceras om det är känt för att vara dominerande, exempelvis SIG35α och invariant Vα24 TCRα kedjor (figur 2 och 3). T-celler specifika för respektive Cognåt antigen ökade i frekvens vid transduktion av ett centriskt TCRα hemichain. (Figur 2 - 3). Tillsammans visar dessa data att införandet av ett centriskt TCRα eller TCRβ hemichain till perifera blod-T-celler kan generera de novo TCRs med antigen-specificiteten av intresse.
Antigen-specifik population kan sorteras flödes assisterad cellsortering och TCR hemichains kan klonas som beskrivs i avsnittet protokoll 4. klonotypisk TCR counter-kedjor kan individuellt rekonstitueras på en T-cellinje som stabilt uttrycker centrerad hemichain. Jurkat 76 transfektanter, som uttrycker nyligen klonade unika TCR från TAK1β eller SIG35α centrerad hemichain transducerade T-celler, besatt varierande aviditet för respektive besläktade antigen, enligt bestämning av HLA / peptid-multimer färgning 5,6. Specifikt kunde vi isolera de novo TCRα counter-kedjor thatt när det paras ihop med TAK1β färgades med antingen lägre eller högre intensitet av WT1 antigenkomplexet än föräldra TAK1αβ parning (Figur 4). På samma sätt, parat med unika kontrakedjor SIG35α erkänt HLA-A2 / MART1 med måttlig till hög affinitet (Figur 5). SIG35α klonades oberoende av en TCRαβ heterodimer 5, därför en föräldra parning för hemichain var tillgänglig för jämförelse. Viktigt, indikerar dessa data att det är möjligt att modulera affinitet för målantigenet genom att para ihop den centrerad hemichain med olika kontrakedjor.
Figur 1:. TAK1β som ett exempel på HLA-begränsade TCRβ centric hemichain TCRα eller TCRβ hemichains av HLA-A24 / WT1 reaktivt TAK1 TCR taggade med stympad nervtillväxtfaktor receptor (ΔNGFR) och individuellt omvandlas till perifert blod T-celler. Transfektanter färgades med PC5-konjugerat anti-CD8 (133x utspädning) och FITC-konjugerat anti-NGFR (20x utspädd) monoklonala antikroppar (mAbs), och indikerade HLA-A24 multimer (5 mikrogram / ml), efter två gånger antigenspecifik stimulering. Totalt 6 donatorer testades. Alla data gated på NGFR + celler. Figur åter tryckt med tillstånd från referens 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. SIG35α som ett exempel på HLA-begränsade TCRα centric hemichain SIG35α TCRα kedja taggade med ΔNGFR, eller etiketten ensam, transducerades till perifera blod-T-celler. Transfektanter färgades med PC5-samnjugated anti-CD8 (133x utspädning) och FITC-konjugerat anti-NGFR (20x utspädd) mAbs, och indikerade HLA-A2 multimer (8 ug / ml). Totalt 4 donatorer testades. Alla data gated på NGFR + celler. Figur re-tryckt med tillstånd från referens 5 (Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc.). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Invariant natural killer T (inkt) cellreceptor Vα24 (Vα24i) som ett exempel på CD1d begränsade TCRα centric hemichain Vα24i TCRα kedjan transducerades till perifera blod-T-celler. Transfektanter färgades med FITC-konjugerad anti-CD3 (20x utspätt) mAb och indikerade CD1d multimer (5 | j, g / ml). Lossas CD1d molecules producerades från HEK293-celler och presentera endogena okända själv lipider. inkt TCR definieras av erkännande av CD1d presentera α-GalCer eller dess analog PBS-57. Totalt 4 donatorer testades. Figur åter tryckt med tillstånd från referens 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representant TCRα counter-kedjor klonade från TAK1β transducerade T-celler TCRα kloner T262, A262, A186, A133, och T4 klonades från HLA-A24 / WT1 multimer positiva TAK1β transducerade perifera T-celler, och individuellt rekonstitueras på Jurkat 76 celler. som uttrycker CD8, tillsammans med den TAK1β kedjan. Transfektanter färgades med PC5-konjugerad anti-CD8 mAb (133x utspädning) och indikerade HLA-A24multimer (5 mikrogram / ml). Data är representativa två oberoende experiment. Felstaplar indikerar intervall. Figur åter tryckt med tillstånd från referens 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa TCRβ counter-kedjor klonade från SIG35α transducerade T-celler TCRβ klonerna 413, 523, 788, 1086, 794, och 830 klonades från HLA-A2 / MART1 multimer positiv SIG35α transducerade perifera T-celler, och individuellt rekonstitueras på Jurkat. 76 celler som uttrycker CD8, tillsammans med SIG35α kedjan. DMF5 var en tidigare klonad hög affinitet TCR erkänner HLA-A2 / MART1. Transfektanter färgades med PC5-konjugerad anti-CD8 mAb (133x utspädning) och indikerade HLA-A2 multimer (2 ug / ml). Data är representativa för två oberoende experiment. Felstaplar indikerar intervall. Figur re-tryckt med tillstånd från referens 5 (Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc.). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1:.. Inställning för PMX vektor matsmältningen Reagens och respektive volymerna visas Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 2: Inställningar för en st omgång 5 'RACE PCR. Reagens och respektive volymer, PCR inställningar och primersekvensen visas. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 3: Inställningar för 2: a omgång 5 'RACE PCR-reagens och respektive volymer, PCR inställningar och primersekvenser visas.. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det första kravet för framgångsrik tillämpning av denna metod är att uppnå tillräcklig transduktionseffektiviteten av primära T-celler med den hemichain av intresse. I vår erfarenhet, kombinationen av att använda PG13 som paketerande cellinje och PMX som retrovirala vektor resulterar i en stabil och effektiv expression av den införda genen i humana primära T-celler. PG13 förpackningsceller kan vara encelliga klonats för att selektera för hög titer paketeringsceller för att förbättra transduktionseffektiviteten. Vidare är proliferation av T-celler också krävas för hög transduktionseffektiviteten av retrovirus. I den beskrivna protokollet, stimulering med lösligt anti-CD3 mAb OKT3, tillsammans med hög koncentration av rhIL-2, ger den nödvändiga aktiveringssignaler för att inducera celldelning. Monocyter krävs för den stimulerande kapacitet löslig OKT3, troligen genom bindning med Fc-receptorer. Därför bulk PBMC, och inte renad T-celler, krävs för denna specifika stimuleringsprotokoll. Tceller bör odlas i RPMI kompletterat med humant serum för optimala experimentella resultat. Alla andra celler som beskrivs här kan odlas i närvaro av fetalt kalvserum.
För det andra måste de novo genererade antigenspecifika TCR uttryckande celler vara detekterbara. För vissa TCR hemichains, såsom TAK1β, de novo TCR-uttryckande celler är endast detekteras efter stimulering med antigen-pulsade antigen-presenterande celler (APC). Om sålunda antigenspecifika TCRs inte upptäcks omedelbart efter transduktion av centrerad hemichain, kunde de vara detekterbara efter expansion genom APC. Notera att transduktion av en icke-centrerad hemichain inte skulle ge de novo antigen-specifika T-celler även efter antigenspecifik expansion med APC: er, såsom ses med TAK1α hemichain (Figur 1). I våra studier, är HLA-multimerer för detektion, men detta kanske inte är tillgängliga för vissa TCR, särskilt HLA klass II begränsad TCRs. Ett alternativ skulle vara att upptäcka T-cell funktionella svar. Hemichain transducerade T-celler kan stimuleras med APC pulserade med antigenet av intresse. Fordons-pulsade APC: er och otransducerade T-celler kan användas som kontroller. Svarande T-celler kan detekteras genom uppreglering av ytan aktiveringsmarkörer såsom CD107a, CD154, eller CD137.
Slutligen är det viktigt att validera att de klonade kontra kedjor i själva verket erkänner antigenet av intresse när det paras ihop med centrerad hemichain. Detta är särskilt viktigt när centrerad hemichain är TCRβ och counter-kedjorna är TCRα eftersom allelisk exklusion för TCRα gener är läckande och det uppskattas att en betydande del av perifera αβ T-celler uttrycker mer än en TCRα kedja 28. Reaktivitet kan bekräftas med multimer färgning eller mäta funktionell respons efter stimulering med APC presenterar det besläktade antigenet.
en limitatipå med denna teknik är att inte alla TCR kommer att komponera en centrerad hemichain, eftersom både TCRα och TCRβ bidra jämförbart med antigen erkännande i vissa fall 3. Därför kan perifera T-celler transducerade med sådana icke-centrerad hemichains inte ge de novo antigenspecifika TCR.
Ändå är detta förfarande en konceptuell utveckling på det konventionella sättet att kloning TCR, där både TCRα och TCRβ gener måste klonas och korrekt parning måste garanteras 29,30. I vår teknik är sammankopplingen mellan hemichains inte längre ett stort problem och endast en av TCR-kedjorna behöver klonas, med tanke på att den andra är fast. I tillägg till HLA klass I eller CD1d-begränsade TCRs, kan den beskrivna metoden även tillämpas för isoleringen av HLA klass II-begränsade TCRs för TCR genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
