Summary
Qui si descrive un nuovo metodo per generare recettori delle cellule T antigene-specifiche (TCR) accoppiando la TCRα o TCRβ di un TCR esistente, che possiede l'antigene-specificità di interesse, con hemichain complementare del T periferico recettore delle cellule repertorio. I TCR de novo generati conservano antigene-specificità con vari affinità.
Abstract
recettori delle cellule T (TCR) sono utilizzati clinicamente per dirigere la specificità delle cellule T a colpire i tumori come modalità promettente di immunoterapia. Pertanto, TCR clonazione specifici per diversi antigeni associati al tumore è stato l'obiettivo di molti studi. Per suscitare una risposta delle cellule T efficace, il TCR deve riconoscere l'antigene bersaglio con affinità ottimale. Tuttavia, la clonazione come TCR è stata una sfida e molti disponibili TCR possedere affinità sub-ottimale per l'antigene cognate. In questo protocollo, si descrive un metodo di clonazione de novo ad alta affinità TCR antigene-specifiche che utilizzano TCR esistenti sfruttando hemichain centralità. È noto che per alcuni TCR, ogni TCRα o TCRβ hemichain non contribuiscono ugualmente al riconoscimento dell'antigene, e il hemichain dominante è indicato come il hemichain centric. Abbiamo dimostrato che accoppiando il hemichain centrica con contro-catene differenti dal contatore-catena originale, siamo in grado di mantenere l'antigene specificity, mentre modulando la sua forza di interazione per l'antigene cognate. Pertanto, il potenziale terapeutico di un dato TCR può essere migliorata ottimizzando l'accoppiamento tra le centric e contro hemichains.
Introduction
recettori delle cellule T (TCR) sono eterodimeriche recettori immunitarie adattative espressi dai linfociti T, composto da una catena TCRα e TCRβ. Essi sono generati mediante riarrangiamento somatica di V (D) J segmenti genici, che produce un repertorio altamente diversificata capace di riconoscere configurazioni praticamente illimitata di complessi HLA / peptide. Clinicamente, cellule T ingegnerizzate per esprimere clonotypic specifico TCR per antigeni tumore-associati hanno dimostrato l'efficacia in una varietà di tumori 1. Tuttavia, molti TCR clonati per questo scopo non hanno sufficiente affinità per l'antigene di interesse, che limitano la loro applicazione terapeutica.
Qui, descriviamo un metodo per superare questo limite per TCR esistenti sfruttando catena di centralità. E 'stato riportato che un TCR hemichain potrebbe svolgere un ruolo più dominante in riconoscimento del target dell'antigene 2, qui chiamato centralità. analisi strutturali cristallo hanno dimostrato che uno centrichemichain di un TCR potrebbe spiegare la maggioranza della impronta sulla MHC / peptide complesso 3,4. Usando questo concetto, abbiamo precedentemente dimostrato che l'SIG35α TCRα può accoppiare con un repertorio vario di catene TCRβ e mantenere la reattività contro il peptide MART1 27-35 presentato da HLA-A2 5. Risultati simili sono stati ottenuti con l'TAK1 TCR, dove il centric TCRβ hemichain accoppiato con varie catene TCRα e mantenuto reattività per il peptide WT1 235-243 presentati da HLA-A24 6. Sia MART1 e WT1 sono antigeni associati al tumore. Catena-Centricity è stato applicato anche per studiare il riconoscimento dell'antigene di TCR invarianti CD1d-ristrette natural killer (iNKT), accoppiando la catena invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα di TCR iNKT umani con diverse catene Vβ11 TCRβ 7.
In tutti i casi, siamo stati in grado di generare un repertorio de novo di TCR da transdurre il centrica TCR hemichain alle cellule T del sangue periferico, dove il hemichain introdotto accoppiato con il TCRα endogena o TCRβ contro-catene. In sostanza, il hemichain centric serve come esca che può essere utilizzato per identificare le opportune contromisure catene, che quando accoppiati insieme formano TCR che mantengono la specificità antigene di interesse, ma variano in affinità. Da questi nuovi repertori, siamo stati in grado di isolare TCR clonotypic con resistenza migliorata interazione contro l'antigene bersaglio rispetto al TCR preesistenti. Pertanto, riteniamo che questo metodo accelererà la pipeline di identificare TCR ottimali per l'applicazione clinica.
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Protocol
1. Preparazione retrovirale Construct Codifica TCR Hemichain di interesse
- Linearizzare PMX vettoriale per consentire l'inserimento di un gene TCR nei passaggi successivi. Digerire il DNA plasmide con EcoRI e NotI enzimi di restrizione a 37 ° C per 3 ore (Tabella 1) 8.
- Effettuare elettroforesi del plasmide digerito su 1,2% gel di agarosio. Banda accise di circa 4.500 paia di basi (bps), ed eluire in 30 ml di acqua sterile utilizzando disponibili in commercio kit di estrazione gel 9.
- Progettazione 5 'e 3' primer per il gene TCR di interesse che codificano anche 15-20 bps sovrapposti sito di digestione EcoRI e NotI di PMX vettore, rispettivamente 8.
- Amplificare TCR gene con primer. Effettuare elettroforesi del prodotto della PCR e la banda eluire di circa 1.000 bps come descritto al punto 1.2.
- Clonare TCR gene in vettore digerito combinando ogni frammento lineare con plasmide disponibile in commerciocomplesso principale reagente mix e incubando a 50 ° C per 1 ora.
NOTA: Fare riferimento al protocollo del produttore per i volumi relativi di ogni componente. Questo metodo di montaggio è basato sulla tecnica originariamente descritta da Gibson et al. 10. - (Opzionale) gene Tag TCR per marcare cellule trasdotte con la forma troncata del nervo umano recettore del fattore di crescita (ΔNGFR, amminoacidi 1-277) 11 separati da sito di scissione Furin, linker serina-glicina, e 2A SEQUENZE 12,13. primer design sequenze di codifica che si sovrappongono le estremità frammento e assemblare plasmide come descritto ai punti 1.3-1.5.
NOTA: Queste sequenze possono essere trovati nei riferimenti 11-13. - Trasforma chimicamente competente E. coli con il plasmide assemblato seguendo il protocollo 14 del produttore. Seed trasformato batteri su piastre di agar (20 mg / ml di brodo lisogenia (LB), 15 mg / ml di agar, e 1 mg / ml di ampicillina) e incubare a 37 ° C per 18 ore. Culture un singolo batterio colonia in 50 ml di terreno LB (20 mg / ml LB e 1 mg / ml di ampicillina) per 16 ore in un incubatore agitazione a 37 ° C e 200 giri al min.
- Purificare plasmidi utilizzando kit disponibili in commercio midiprep seguenti protocollo del produttore. Diluire plasmide alla concentrazione di circa 1 mg / mL.
NOTA: Il protocollo di purificazione plasmide è basato sul metodo di estrazione alcalina 15.
2. Generazione stabile Packaging Cell Line
NOTA: le cellule Sia 293GPG e PG13 sono aderenti. cellule di coltura in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS) e 50 mg / ml gentamicina. cellule 293GPG coltura con 1 mg / ml di tetraciclina prima trasfezione. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 tra tutti i passaggi.
- Cellule packaging trasfezione 293GPG 16 coltivate in pallone T75 con il vettore hemichain-codifica ottenuto nel passaggio 1.9, USIng disponibile in commercio reagente di trasfezione seguente protocollo del produttore 1 7. NOTA: le cellule trasfezione 293GPG a 50-60% di confluenza.
- Aspirare media per 293GPG cellule e aggiungere 10 ml di fresca DMEM media 1 messaggio giorno trasfezione.
- Harvest transitoriamente prodotta virus dalle cellule transfettate 293GPG 2 giorni dopo il punto 2.2 con il trasferimento di terreno di coltura di siringa e passando per 0,45 micron filtro.
NOTA: Virus può essere utilizzato immediatamente o conservato a -80 ° C per un uso futuro. - Culture 1 x 10 5 PG13 cellule nel pallone T25. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Dopo un giorno, terreno di coltura aspirare e aggiungere 1,5 ml di virus 293GPG derivata dal punto 2.3 e 1.5 ml di terreno DMEM, insieme a 8 ug / ml di polibrene.
- Modificare il medium come descritto al punto 2.4, una volta al giorno per 4 giorni, per stabilire stabile linea PG13 cellule che producono imballaggi retrovirus codificano la hemichain TCR di interesse.
- Aspirare media e sostituirecon terreno DMEM fresco per linee cellulari PG13 24 ore dopo l'ultima infezione per ulteriori cultura.
NOTA: congelare o sub-cultura cellule staccando con una soluzione di tripsina-EDTA 0,05%. - Per produrre virus da linee cellulari PG13 trasdotte, cultura 2 x 10 6 cellule in T75 pallone con 10 ml di mezzo DMEM, e il virus del raccolto come descritto al punto 2.3 tre giorni dopo la semina delle cellule.
NOTA: Virus è meglio utilizzato immediatamente, ma può essere conservato a -80 ° C per un massimo di due mesi.
3. Attivazione e trasduzione delle cellule T umane
NOTA: i campioni umani sono ottenuti ed utilizzati in conformità con i protocolli approvati Comitato Etico istituzionali. primarie cultura cellule umane in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) di media integrati con siero umano 10% invece di FCS e 50 mg / ml gentamicina. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 tra tutti i passaggi.
- Isolare umani periferici cellule mononucleate del sangue (PBMC) di densitàseparazione gradiente seguente protocollo 18 del produttore.
- Attivare le cellule T per indurre la proliferazione necessaria per l'infezione retrovirale. Culture 2 x 10 7 PBMC fresco o congelato per pozzetto nella piastra da 6 pozzetti, in 5 ml di terreno RPMI con 100 UI / ml di ricombinante umano interleuchina-2 (rhIL-2) e 50 ng / ml di anti-CD3 anticorpo monoclonale (OKT3 clone).
- Tre giorni dopo la stimolazione, raccogliere le cellule T pipettando e centrifugare a 350 xg per 4 minuti. Eliminare il surnatante e sementi 0,5-1 x 10 6 T cellule per pozzetto in 24-pozzetti risospese in 1 ml di virus PG13 dal passaggio 2,7 e 1 ml di mezzo RPMI supplementato con 200 UI / ml di rhIL-2. Piastra centrifugare a 1000 xg e 32 ° C per 1 ora.
- Dopo 24 ore, raccogliere le cellule T pipettando e centrifugare a 350 xg per 4 minuti. Scartare cellule surnatante e risospendere in 1 ml di virus PG13 dal passaggio 2,7 e 1 ml di mezzo RPMI supplementato con 200 UI / ml di rhIL-2. Ripetere questo passaggio per un totale di 6 infettareioni.
NOTA: Il numero di infezioni deve essere ottimizzata a seconda titolo del virus prodotto da imballaggio linea cellulare. Se necessario, le cellule T passaggio rimuovendo il 20-30% delle cellule ogni giorno per prevenire la crescita eccessiva. - 24 ore dopo l'ultima infezione, raccogliere le cellule T pipettando e centrifugare a 350 xg per 4 minuti. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in terreno RPMI con 100 UI / ml di rhIL-2 per ulteriori cultura.
- 2-3 giorni dopo il punto 3.5, cellule macchia T con HLA multimero a 4 ° C per 30 minuti, poi CD3 anti-umana e co-recettore anticorpi monoclonali (mAb) a 4 ° C per 15 min. Analizzare mediante citometria di flusso. Utilizzare multimero irrilevanti e / o cellule non trasdotte come controlli negativi (Figura 1 - 3) 19.
- Se il hemichain centrica introdotto è una catena TCRα, analizzare l'utilizzo Vβ delle cellule positive de novo multimero utilizzando disponibili in commercio pannello di anticorpi Vβ-specifica mediante citometria di flusso 20.
4. Clonazione De Novo TCR Counter-hemichains
- Ordina la de novo multimero popolazione positivo nel passo 3.6 per l'ordinamento cella di flusso-assistita.
- Isolare RNA da cellule T ordinati utilizzando l'acido guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione 21,2 2.
NOTA: RNA può essere conservato a -80 ° C, ma deve essere utilizzato per generare cDNA appena possibile. - Sintetizzare libreria di cDNA da RNA estratto utilizzando disponibili in commercio kit inversa trascrittasi-PCR seguente protocollo 23,24 del produttore.
- Se la clonazione TCRβ contro-catene, progettare Vβ gene e TCRβ primer specifici costante regione, come determinato al punto 3.7, e clonare full-length TCRβ geni come descritto nei passaggi 1.3-1.9. Vedere il punto 4.5 se il contatore-catena è TCRα, altrimenti passare al punto 5.1.
- Disponibili in commercio anticorpi Vα-specifici sono limitati, quindi Vα utilizzo gene non puòessere determinata mediante citometria di flusso. Clone TCRα contro-catene tramite 5'-rapida amplificazione del cDNA estremità (RACE) 25, utilizzando disponibili in commercio 5 'kit Gara 6.
- Sintetizzare 5 'cDNA compatibile corsa da RNA estratto al punto 4.2 seguente protocollo del produttore.
- Eseguire 1 ° turno PCR come descritto nella Tabella 2.
- Effettuare elettroforesi del prodotto di PCR ed eluire banda di circa 1.100 bps, come descritto al punto 1.2.
- Eseguire 2 ° turno PCR, come descritto nella tabella 3, con 1 ° prodotto della PCR tondo come modello.
NOTA: sequenze primer indicati in Tabella 3 sono stati progettati per la clonazione in EcoRI e NotI digerito PMX vettore. - Effettuare elettroforesi del prodotto di PCR ed eluire banda di circa 1000 bps, come descritto al punto 1.2.
- Clone TCRα geni nelle EcoRI e NotI digeriti PMX vettoriale e puriplasmidi fy come descritto ai punti 1.5-1.9.
5. ricostitutivo nuovo antigene-specifiche cloni TCR
NOTA: Culture Jurkat 76 celle e successive linee cellulari in terreno RPMI supplementato con 10% FCS e 50 ug / ml di gentamicina. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 tra tutti i passaggi.
- Trasdurre Jurkat 76 celle 26 (o equivalente TCR - / - linea di cellule T umano) con centric hemichain TCR utilizzando virus 293GPG prodotta nella fase 2.3. Per Jurkat 76, semi di 5 x 10 4 cellule per pozzetto a 24-pozzetti con 1 ml di virus e 1 ml di terreno RPMI. Piastra centrifugare a 1000 xg e 32 ° C per 1 ora.
- 24 ore dopo l'infezione, raccogliere hemichain trasdotte Jurkat 76 cellule pipettando e centrifugare a 350 xg per 4 minuti. Gettare il surnatante e risospendere in terreno RPMI fresco per ulteriori cultura.
- Purificare cellule trasdotte se il hemichain è molecolarmente tagged 2-3 giorni dopo la fase 5.2, dalla macchiare con fluoroforo coniugato anti-NGFR mAb seguita dal flusso assistita o una cella magnetica assistita ordinamento (opzionale) 27.
- A seguito di passaggi da 2.1 a 2.3, la produzione di virus 293GPG codifica di un TCR anti-catena clonato da piazza di 4,4 o 4,5.
- Per ricostituire completamente il TCR, la trasduzione linea di cellule T che esprimono stabilmente la hemichain TCR centrica generata in passi 5.1-5.3 utilizzando virus dal punto 5.4. Eseguire trasduzione come descritto ai punti 5.1-5.2.
- Purificare CD3 + transfettanti con anti-CD3 separazione delle cellule magnetica assistita seguente protocollo del produttore, 2-3 giorni dopo passo 5.5 27.
- Per convalidare specificità antigenica, macchiare le transfettanti esprimono TCR clonotypic composti del centric hemichain TCR in coppia con diverse contro-catene, con anti-CD3 e / o anticorpi monoclonali co-recettore, e HLA multimero, 3-5 giorni dopo la purificazione CD3. Analizzare le cellule mediante citometria di flusso (Figura 4 - 5) 19.
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Representative Results
Senza la conoscenza preventiva di cui hemichain è a catena-centrica, la catena TCRα e TCRβ dovrebbe essere clonato e trasduzione di cellule T del sangue periferico, che è stato fatto nel caso di HLA-A24 / WT1 reattiva TAK1 TCR (Figura 1) separatamente. La trasduzione di TAK1β prodotto una frequenza notevolmente più elevata di cellule T antigene-specifiche. Al contrario, la trasduzione di un hemichain non-centric non voleva cedere de novo cellule multimero positive T, come si è visto con la catena TAK1α (Figura 1). Durante l'analisi, cancello su cellule NGFR + se il gene TCR è stato etichettato per analizzare specificamente cellule trasdotte (Figura 1 - 2). D'altra parte, il singolo hemichain centrica può essere trasdotti se è noto per essere dominante, ad esempio la SIG35α e catene Vα24 TCRα invarianti (Figura 2 e 3). cellule T specifiche per il rispettivo cognate antigene aumento nella frequenza su trasduzione di un centric hemichain TCRα. (Figura 2 - 3). Insieme, questi dati dimostrano che l'introduzione di un centric TCRα o TCRβ hemichain alle cellule T del sangue periferico in grado di generare de novo TCR con l'antigene-specificità di interesse.
popolazione antigene-specifica può essere ordinato per cella di flusso assistita ordinamento e hemichains TCR può essere clonato, come descritto nella sezione protocollo 4. Clonotypic TCR contro-catene possono essere ricostituiti singolarmente su una linea cellulare T che esprimono stabilmente la hemichain centrica. Jurkat 76 transfettanti, esprimendo recente clonati TCR unici da cellule T TAK1β o SIG35α centric hemichain trasdotte, possedevano variando l'avidità per il rispettivo antigene affine, come determinato dal HLA / peptide multimero colorazione 5,6. In particolare, siamo stati in grado di isolare de novo TCRα contro-catene tcappello se abbinato con TAK1β sono state colorate con o minore intensità o superiore da parte del complesso antigene WT1 rispetto alla genitori abbinamento TAK1αβ (Figura 4). Allo stesso modo, in coppia con SIG35α unici contro-catene riconosciuto HLA-A2 / MART1 da moderata a elevata avidità (Figura 5). SIG35α è stato clonato indipendente da un eterodimero TCRαβ 5, quindi un accoppiamento dei genitori per questo hemichain non era disponibile per il confronto. Importante, questi dati indicano che è possibile modulare l'affinità per l'antigene bersaglio accoppiando il hemichain centric con varie contromisure catene.
Figura 1:. TAK1β come esempio di HLA-ristretti TCRβ centric hemichain TCRα o TCRβ hemichains del HLA-A24 / WT1 reattiva TAK1 TCR è stato taggato con nervo tronco fattore di crescita recePTOR (ΔNGFR), e trasdotte individualmente alle cellule T del sangue periferico. Trasfettanti sono state colorate con PC5-coniugato anti-CD8 (133x diluito) e FITC-coniugato anti-NGFR (20x diluito) anticorpi monoclonali (mAbs), ed indicati multimero HLA-A24 (5 mg / ml), seguito due volte antigene-specifica stimolazione. Totale di 6 donatori sono stati testati. Tutti i dati sono stati gated sulle cellule NGFR +. Figura ri-stampato con il permesso di riferimento 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. SIG35α come esempio di HLA-ristretto TCRα centric hemichain catena SIG35α TCRα contrassegnati con ΔNGFR, o il tag da solo, è stato trasdotto alle cellule T del sangue periferico. Transfettanti sono state colorate con PC5-conjugated anti-CD8 (133x diluito) e FITC-coniugato anti-NGFR (20x) diluiti mAbs, e indicati HLA-A2 multimero (8 mg / ml). Totale di 4 donatori sono stati testati. Tutti i dati sono stati gated sulle cellule NGFR +. Figura ristampato con il permesso di riferimento 5 (Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc.). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Invariant recettore delle cellule natural killer T (iNKT) Vα24 (Vα24i) come esempio di CD1d-restricted TCRα centric hemichain Vα24i catena TCRα è stato trasdotto alle cellule T del sangue periferico. Transfettanti sono state colorate con FITC-coniugato anti-CD3 (20x diluito) mAb e indicati CD1d multimero (5 mg / ml). mo CD1d a vuotolecules sono stati prodotti dalle cellule HEK293 e presenti endogene sconosciuti auto-lipidi. iNKT TCR è definito dal riconoscimento della CD1d presentare α-GalCer o il suo analogo PBS-57. Totale di 4 donatori sono stati testati. Figura ri-stampato con il permesso di riferimento 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentante TCRα contro-catene clonati da TAK1β trasdotte cellule T TCRα cloni T262, A262, A186, A133, e T4 sono stati clonati da HLA-A24 / WT1 cellule T periferiche TAK1β trasdotte multimero positivi, e ricostituito singolarmente su Jurkat 76 cellule. esprimendo CD8, insieme con la catena TAK1β. Transfettanti sono state colorate con PC5-coniugato anti-CD8 monoclonale (133x diluito) e indicati HLA-A24multimero (5 mg / ml). I dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. Le barre di errore indicano gamma. Figura ri-stampato con il permesso di riferimento 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rappresentante TCRβ contro-catene clonati da SIG35α trasdotte cellule T TCRβ cloni 413, 523, 788, 1086, 794, e 830 sono stati clonati da HLA-A2 / MART1 cellule T periferiche SIG35α multimero positivo trasdotte, e individualmente ricostituito su Jurkat. 76 cellule che esprimono CD8, insieme con la catena SIG35α. DMF5 era un precedentemente clonato TCR alta affinità riconoscere HLA-A2 / MART1. Transfettanti sono state colorate con PC5-coniugato anti-CD8 monoclonale (133x diluito) e indicati HLA-A2 multimero (2 mg / ml). I dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. Le barre di errore indicano gamma. Figura ristampato con il permesso di riferimento 5 (Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc.). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1:.. Installazione per PMX vettore digestione Reagenti e rispettivi volumi sono mostrati Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 2: Configurazione per il 1 ° turno 5 'RACE PCR. Reagenti e rispettivi volumi, le impostazioni di PCR, e la sequenza di primer sono mostrati. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 3: installazione di 2 ° turno 5 'RACE PCR Reagenti e rispettivi volumi, le impostazioni di PCR, e le sequenze di primer sono mostrati.. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Discussion
Il primo requisito per l'applicazione di successo di questo metodo sta ottenendo sufficiente efficienza di trasduzione delle cellule T primarie con il hemichain di interesse. Nella nostra esperienza, la combinazione di utilizzare PG13 come linea cellulare di packaging e PMX come risultati vettore retrovirale in espressione stabile ed efficiente del gene introdotto nelle cellule T primarie umane. cellule packaging PG13 possono essere unicellulare clonato per selezionare le celle per imballaggio alto titolo per migliorare l'efficienza di trasduzione. Inoltre, è richiesta anche la proliferazione delle cellule T per alta efficienza di trasduzione da retrovirus. Nel protocollo descritto, stimolazione con solubile anti-CD3 mAb OKT3, insieme con alta concentrazione di rhIL-2, fornisce i segnali di attivazione necessari per indurre la divisione cellulare. I monociti sono necessari per la capacità di stimolazione di OKT3 solubile, probabilmente attraverso il legame con i recettori Fc. Pertanto, alla rinfusa PBMC, e non purificato le cellule T, è necessario per questo particolare protocollo di stimolazione. Tcellule devono essere coltivate in RPMI integrato con siero umano per risultati sperimentali ottimali. Tutte le altre celle qui descritte possono essere coltivate in presenza di siero fetale di vitello.
In secondo luogo, de novo TCR antigene-specifiche generate che esprimono le cellule devono essere rilevabili. Per alcuni hemichains TCR, come TAK1β, cellule che esprimono de novo TCR sono rilevabili solo dopo stimolazione con cellule presentanti l'antigene antigene-pulsata (APC). Così, se TCR antigene-specifiche non vengono rilevati immediatamente dopo la trasduzione del hemichain centric, potrebbero essere rilevabili dopo l'espansione da APC. Si noti che la trasduzione di un hemichain non-centric non produrrebbe de novo cellule T antigene-specifiche anche dopo espansione antigene-specifica con APC, come visto con il hemichain TAK1α (Figura 1). Nei nostri studi, multimeri HLA vengono utilizzati per il rilevamento, tuttavia, questo potrebbe non essere disponibile per alcuni TCR, in particolare HLA di classe II limitato TCRS. Un'alternativa sarebbe quella di rilevare le risposte funzionali delle cellule T. Le cellule T Hemichain trasdotte possono essere stimolate con APC pulsate con l'antigene di interesse. APC veicolo-pulsato e le cellule T non trasdotte possono essere utilizzati come controlli. Le cellule T che rispondono possono essere rilevate da upregulation di marker di attivazione superficiale come la CD107a, CD154 o CD137.
Infine, è importante verificare che i contro-catene clonati non di fatto riconoscono l'antigene di interesse se abbinato con il hemichain centrica. Ciò è particolarmente importante quando il hemichain centrica è TCRβ e contro-catene sono TCRα, dal momento che allelica esclusione per i geni TCRα è che perde e si stima che una parte significativa di cellule T αβ periferiche esprimere catena più di un TCRα 28. Reattività può essere confermata con colorazione multimero o di misura risposta funzionale dopo stimolazione con APC che presentano l'antigene cognate.
Un LIMITAZIONI D'su di questa tecnica è che non tutti i TCR sarà comporre una hemichain centrica, dal momento che entrambi TCRα e TCRβ contribuiscono paragonabile a antigene riconoscimento in alcuni casi 3. Pertanto, le cellule T periferiche trasdotte con tali hemichains non-centric non possono produrre de novo TCR antigene-specifiche.
Tuttavia, questo metodo rappresenta un avanzamento concettuale sul metodo convenzionale di TCR la clonazione, in cui sia TCRα e TCRβ geni devono essere clonato e corretto accoppiamento deve essere assicurata 29,30. Nella nostra tecnica, abbinamento tra hemichains non è più una preoccupazione principale e solo una delle catene TCR deve essere clonato, dato che l'altro è fissato. Oltre a HLA di classe I o TCR CD1d-ristretto, il metodo descritto può essere applicato anche per l'isolamento di TCR HLA di classe II-ristretti per la terapia genica TCR.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
