Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة

Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54698
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 1
1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

Summary

وقد استخدمت العديد من النظم التجريبية لفهم الآليات التي تنظم نمو الخلايا T وظيفة في الاستجابة المناعية. هنا يتم وصف نهج الوراثي باستخدام تنبيغ فيروسات، وهو الاقتصادية، والوقت كفاءة، والأهم من ذلك، مفيدة للغاية في تحديد مسارات التنظيمية.

Protocol

واضطلع كل عمل الماوس أجريت في هذه البروتوكولات وفقا لإجراءات حيوانات علمي القانون، المملكة المتحدة تحت الحيوان ترخيص مشروع 70/6965.

1. فيروسات الرجعية الإنتاج

قبل إجراءات الحصول على جميع الموافقات اللازمة لإنتاج الكائنات المحورة وراثيا واستخدام الفيروسات في خلايا الثدييات.

  1. نمو خلايا كلوة 293T
    1. تنمو الخلايا 293T كلوة على أطباق 10 سم زراعة الأنسجة في كلوة 293T المتوسطة (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 100 وحدة / مل البنسلين 0.1 ملغ / مل الستربتوميسين، و2 مم L-الجلوتامين) . لمرور خلية العام، تقسيم الخلايا 1:10 عندما تصل إلى نقطة التقاء طريق إزالة المتوسطة وpipetting لخلايا قبالة اللوحة مع الطازجة المتوسطة كلوة 293T.
      ملاحظة: يجب أن خلايا تصل إلى نقطة التقاء في 2-3 أيام. الخلايا 293T كلوة نعلق فضفاضة على لوحة بحيث لا يشترط trypsinization.
    2. 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، تقسيم conflueلوحة الإقليم الشمالي من خلايا 01:10 لوحة 10 سم (لوحة واحدة لكل ترنسفكأيشن) وذلك في اليوم التالي كانت الخلايا ~ 50٪ متموجة.
  2. ترنسفكأيشن من الكالسيوم فوسفات هطول
    1. حوالي 1 ساعة قبل ترنسفكأيشن، وإزالة المتوسطة من الخلايا وبعناية إضافة 9 مل من الطازجة المتوسطة كلوة 293T لمنع خلايا فصل من لوحة.
    2. إعداد 2X HEPES مخزنة المالحة (2X HBS) والطازجة 2.5 M CaCL 2 الحل كما هو موضح في الجدول رقم 1. أذاب الأسهم الحمض النووي. لتعداء الأكثر كفاءة استخدام البلازميد جودة الإعدادية الحمض النووي.
    3. في 6 مل جولة القاع أو 15 مل أنبوب مخروطي إضافة 5 ميكروغرام من الحمض النووي للفيروسات (pMIG) 4، 5 ميكروغرام من الحمض النووي فيروس مساعد (PCL للبيئة) 7، وH 2 O إلى 420 ميكرولتر. إضافة 80 ميكرولتر من 2.5 M CaCl 2 ليصل الحجم النهائي إلى 500 ميكرولتر.
      ملاحظة: هذا جنبا إلى جنب مع الخطوة التالية (إضافة 2X HBS) يمكن القيام به على مقاعد البدلاء منتظم طالما ster يسود العاميستخدم تقنية إيل.
    4. ببطء إضافة 500 ميكرولتر من انخفاض 2X HBS قطرة إلى خليط الحمض النووي أعلاه في حين vortexing لبلطف حتى أن الحل هو مختلطة بشكل مستمر وكابو 4 يترسب في البلورات حتى الحجم.
    5. نقل إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة وببطء يضاف خليط الحمض النووي كابو 4 (1 مل) قطرة قطرة إلى 9 مل من المتوسط تغطي الخلايا في حين يحوم باستمرار وبلطف لوحة. مرة واحدة يكون مرة أخرى الحرص على عدم فصل الخلايا من لوحة. وضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة.
      ملاحظة: عند هذه النقطة يعجل كابو 4 سوف تكون مرئية بسهولة تحت المجهر كما بلورات صغيرة عن حجم البكتيريا. وتعتبر هذه بسهولة بعد 30-60 دقيقة عندما كان البلورات فرصة لتستقر في الجزء السفلي من لوحة.
  3. مجموعة من الفيروسات في Supernatants الثقافة.
    1. في اليوم التالي (في أي مكان 12-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن) إزالة المتوسطة وتغذية الخلايا مع 10 ملمن جديد المتوسطة كلوة 293T يجري مرة واحدة مرة أخرى الحرص على عدم طرد الخلايا من لوحة.
      ملاحظة: هذا يخفف من المواد المثبطة لمفاوية أن الخلايا كلوة 293T تفرز في المتوسط ​​خلال ترنسفكأيشن.
    2. وفي مساء اليوم الثاني (~ 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن) تغذية الخلايا مع 3.5 مل من الطازجة المتوسطة كلوة 293T. كن حذرا من أن لوحة وضعت مستوى بالضبط في الحاضنة بحيث لا تترك جانب واحد جافة.
    3. جمع المتوسطة ~ بعد 12 ساعة (مخزن في 4 درجة مئوية) والأعلاف مع 3.5 مل من الطازجة المتوسطة كلوة 293T. كرر جمع 2 مرات أكثر في ما يقرب من 12 ساعة فترات بحيث يتم جمع حوالي 10 مل من المتوسط. هذا هو مخزون الفيروس.
    4. تخرج أي خلايا كلوة 293T المتبقية والحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، تصفية باستخدام 0.45 ميكرون، وانخفاض بروتين ملزمة، مرشح حقنة. فيروس مخزن في 4 درجات مئوية، وأفضل التتر، واستخدام في غضون يوم أو اثنين، كما عيار سوف تتضاءل ببطء في 4 درجات مئوية. لا الابeeze، لأن هذا يقلل إلى حد كبير من عيار.

2. عزل الخلايا الأولية السذاجة CD4 + T

  1. عزل خلايا كريات بيضاء
    1. الموت ببطء الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم، CO 2 الخنق، أو غيرها من بروتوكول إنسانية المناسب لقواعد التعامل مع الحيوان للمؤسسة.
    2. تشريح الفئران الموت الرحيم الطازجة وإزالة الطحال والغدد الليمفاوية المطلوب 15. وضع أجهزة في الآبار لوحة زراعة الأنسجة 6 جيدا تحتوي R10 المتوسطة (RPMI المتوسطة مع الحرارة 10٪ المعطل FBS، و 100 وحدة / مل البنسلين، 0.1 ملغ / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 0.1٪ β-المركابتويثانول) . استخدام غطاء الثقافة خلية لتشريح الفئران وجميع التلاعب اللاحقة لتقليل فرصة التلوث في الثقافات.
      ملاحظة: حافظ على متوسط ​​R10 البرد وتنفيذ كافة الخطوات تنقية المصب في 4 درجات مئوية.
    3. وضع 70 ميكرون ثقافة مصفاة الخلية إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على ما يقرب من 5 مل من R10 المتوسطة. استخدام مصفاة واحدة للالطحال والغدد الليمفاوية تصل إلى ثلاثة الفئران.
    4. إضافة الطحال والغدد الليمفاوية إلى مصفاة الخلية وأضعف باستخدام نهاية 5 مل حقنة الغطاس. شطف مع 1-2 مل من R10 المتوسطة.
    5. نقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وجلب حجم ما يصل الى 14 مل مع R10. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف بصب تشغيله مع حركة واحدة نظيفة لمنع إزعاج بيليه الخلية.
    6. إضافة 2 مل من البرد (4 درجات مئوية) خلايا الدم الحمراء تحلل العازلة (الجدول 1) إلى كل أنبوب. المزيج بلطف لمدة 3.5 دقيقة، والحفاظ على أنبوب على الجليد.
      ملاحظة: توقيت تحلل الخلايا الحمراء أمر بالغ الأهمية لمنع موت الخلايا الليمفاوية. ولذلك، فإن التوقيت الدقيق من كل دفعة من العازلة تحلل الخلايا الحمراء يحتاج إلى أن يكون الأمثل.
    7. إضافة ≈12-13 مل من R10 المتوسطة. على الفور أجهزة الطرد المركزي وتجاهل طاف كما في الخطوة 2.1.5. تنفيذ الخطوات غسل 2X أكثر خفة دمح R10 المتوسطة لإزالة أي العازلة خلية تحلل الأحمر المتبقي من الخلايا وتجنب موت الخلايا الليمفاوية.
    8. عد الخلايا في عدادة الكريات تمييع 01:20 في التريبان الأزرق لتحديد العائد من خلايا قابلة للحياة. نتوقع ما يقرب من 8-10 × 10 7 خلايا في الماوس.
  2. عزل خلايا CD4 + T عن طريق الخرز المغناطيسي كيت لإزالة CD8 +، CD11b +، CD16 / 32 +، CD45R +، MHC من الدرجة الثانية + وتير-119 + الخلايا.
    1. قسامة 8-10 × 10 7 خلايا من الخطوة 2.1.8 في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تخلصي من طاف مع حركة واحدة نظيفة لمنع إزعاج بيليه الخلية. resuspend الخلايا في كل أنبوب في 100 ميكرولتر من الحرارة المعطل FBS ثم إضافة 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة من هذه المجموعة. احتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الخلط لطيف على الأسطوانة.
    2. في حين أن الخلايا المذكورة أعلاه تحتضن، وإعداد حبات.
      1. الخرز resuspend في القارورة قبل vortexing ل> 30 ثانية ثم نقل 1 مل من الخرز في 8-10 × 10 7 خلايا على استعداد ل15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 2 مل من R10 المتوسطة لكل مل من الخرز وتخلط بلطف.
      2. وضع أنبوب في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ثم تجاهل طاف. إزالة أنبوب من المغناطيس و resuspend حبات في 4 مل من R10 المتوسطة. هذا المبلغ من الخرز كافية لجولتين من الحضانة.
    3. غسل الخلايا في نهاية الأجسام المضادة الحضانة (الخطوة 2.2.1) وذلك بإضافة 10 مل من المتوسط ​​R10 في أنبوب. المزيج بلطف بشكل جيد مع دوامات من خلايا الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تخلصي من طاف مع حركة واحدة نظيفة لمنع إزعاج بيليه الخلية. Resuspend الخلايا في 1 مل من R10 المتوسطة.
    4. إضافة 2 مل من الخرز غسلها من الخطوة 2.2.2.2 (½ كمية أعد لكل أنبوب) إلى كل أنبوب خلايا الجسم المضاد المعالجة واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الخلط لطيف على ريال عمانيروزينمولر.
    5. Resuspend وخليط خلية حبة من قبل pipetting بلطف 5 مرات مع الماصة التي تحتوي على افتتاح قمة الضيق. تجنب الرغوة. وضع أنبوب في المغناطيس حبات لمدة 2 دقيقة ثم نقل طاف التي تحتوي على الخلايا المحددة سلبا على أنبوب جديد. الحفاظ على هذه الخلايا، كما أنها السكان CD4 +.
    6. كرر اختيار سلبية واحدة لمزيد من الوقت. تدور الخلايا من الخطوة 2.2.5 في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تخلصي من طاف كما في الخطوة 2.2.3 و resuspend في 1 مل من R10 المتوسطة. اتبع الخطوات 2.2.4 و2.2.5 مرة أخرى. بعد اختيار حبة المغناطيسي النهائية، عد الخلايا لتحديد الاسترداد (غلة النموذجية هي 15-20 × 10 6 خلايا في 10 8 الكريات البيض).
  3. عزل خلايا CD4 + T السذاجة (CD25 - وCD62L عالية) باستخدام أعمدة فصل خلية
    1. خلايا الطرد المركزي CD4 + T في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وresuspend في 150-200 ميكرولتر منمتوسط R10 في 10 8 خلايا. إضافة 2 ميكرولتر من الأوراق المالية المعقدة البيروكسيديز CD25 ريتوكسيماب (استنساخ 7D4). احتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الخلط لطيف على الأسطوانة.
    2. غسل الخلايا بإضافة 10 مل من العازلة عمود فصل الخلية (الجدول 1). أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن، وتقدير حجم العازلة / الخلايا المتبقية. و resuspend إلى الحجم النهائي من ما يقرب من 90 ميكرولتر في 10 7 خلايا.
    3. إضافة 20 ميكرولتر من الخرز Streptavidin في 10 7 خلايا وتخلط مع نقرات لطيف. احتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    4. في حين أن الخلايا تحتضن، وإعداد الأعمدة فصل الخلايا المتوسطة (MS) للنهج اليدوي. كل عمود MS يحتفظ 10 7 خلايا، ومنذ CD25 + الخلايا تمثل عادة حوالي 10٪ من مجموع خلايا CD4 +، استخدام العمود 1 لكل 10 8 خلايا CD4 + T. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة عمود فصل الخلية إلى العمودوالسماح بالتدفق من خلال. كرر 2 مرات أكثر.
    5. في نهاية الحضانة خلية / حبة، وغسل الخلايا بإضافة 10 مل من العازلة عمود فصل الخلية والطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. و resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من فصل الخلية عازلة عمود في 10 8 خلايا، ولكن لا تزال تستخدم 500 ميكرولتر إذا كان هناك عدد أقل من الخلايا.
    6. تطبيق 500 ميكرولتر من تعليق خلية / حبة إلى العمود وجمع التدفق من خلال. تمرير هذا على العمود 1 المزيد من الوقت وجمع من خلال تدفق مرة أخرى. شطف العمود 3 مرات مع 500 ميكرولتر من العازلة عمود فصل الخلية، مضيفا كل تتدفق من خلال من هذه يشطف إلى الخلايا التي تم جمعها. هذه هي CD25 - الخلايا. عد الخلايا لتحديد العائد.
    7. وإذا رغبت Tregs (CD25 + الخلايا)، عزل على النحو التالي.
      1. إزالة عمود من الفاصل والاحتفاظ بها فوق أنبوب الرعاية أخذ عالمية مفتوحة للحفاظ على عقم. ماصة بسرعة 500 ميكرولتر من العازلة فصل الخلية على العقيدUMN وطرد بحزم من الكسر إيجابي، وذلك باستخدام المكبس المتوفرة مع العمود.
      2. كرر الإجراء بيغ 2 مرات أكثر. تمرير جزء ايجابية بشأن MS عمود فصل الخلية الطازجة وتجاهل هذا التدفق من خلال. طرد بحزم على خلايا إيجابية ثلاث مرات، كما كان من قبل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات خلايا جيم Resuspend في 1 مل من R10 المتوسطة والعد لتحديد العائد.
    8. للحصول على CD25 - CD62L خلايا عالية T، الطرد المركزي CD25 - خلايا T معزولة أعلاه في خطوة 2.3.6 في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات و resuspend في 150-200 ميكرولتر من المتوسطة R10 في 10 7 خلايا. إضافة 5 ميكرولتر من الأوراق المالية المعقدة البيروكسيديز CD62L وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (استنساخ MEL-14)، واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الخلط لطيف على الأسطوانة كما كان من قبل.
    9. أداء الغسيل، Streptavidin حبة ملزم، وإعداد عمود فصل الخلايا كما هو موضح لبروتوكول العزلة Treg (2.3.7). هذا استخدام الوقتفصل الخلايا كبير (LS) عمود، الذي لديه القدرة من 10 8 خلايا.
      1. منذ CD62L خلايا عالية T تمثل عادة حوالي 60-70٪ من CD25 - خلايا، استخدم 1 ليرة سورية عمود فصل الخلية في 10 8 خلايا. يضاف خليط خلية / حبة ليرة سورية عمود فصل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.3.6 - وهذه المرة التخلص من تدفق النهائي من خلال ويشطف العمود. جمع CD62L خلايا عالية T كما هو موضح في الخطوة 2.3.7 لجمع الخلايا CD25 +.
      2. خلايا الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات خلايا جيم Resuspend في 1 مل من R10 وتحسب لتحديد العائد. تمييع ل،75-1 X10 6 خلايا لكل مل في R10 المتوسطة.
  4. تحليل الطهارة من الخلايا التي الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية).
    1. استراتيجية تلطيخ FACS
      1. للخلايا قبل وبعد كل مراحل العزلة، وصمة عار مع CD4-FITC، CD8a-PerCP-Cy5.5 (مساعد والسامة للخلايا T خلايا)، وMHCII-PE (MHC من الدرجة الثانية الخلايا معربا).
      2. للخلايا قبل وبعد العزلة CD25، وصمة عار مع FITC-CD4 وCD25-PE (Tregs مقابل الخلايا التائية المساعدة الأخرى).
      3. للخلايا ما قبل وما بعد CD62L وصمة عار العزلة مع CD4-FITC، CD62L-PE و CD44-APC (السذاجة مقابل خلايا الذاكرة والمستجيب التائية المساعدة).
    2. لكل مكان تحليل 10 5 الخلايا في بئر من لوحة جيدا U-القاع 96. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تخلصي من المتوسط ​​وغسل خلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولتر DPBS. أجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه وتخلصي DPBS.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من DPBS لكل بئر و 0.5 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة (كما هو مبين في 2.4.1)، واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة في الظلام لتجنب تبييض التسمية الفلورسنت.
    4. غسل الخلايا 2X مع DPBS كما هو الحال في 2.4.2 وتحليل فورا على قياس التدفق الخلوي باستخدام بروتوكولات ومبادئ توجيهية محددة إلى أداة في متناول اليد.
      ملاحظة: بعد الخطوة العزلة النهائية من التحضير الجيد، و90-95٪ من الخلايايكون CD4 + CD25 - CD62L خلايا عالية تي.

3. فيروسات تنبيغ من المنشط خلايا CD4 + T والتمايز بهم إلى محددة تي مساعد مجموعات فرعية

  1. فيروسات تنبيغ
    ملاحظة: التكامل للفيروسات، والتعبير عن الجينات تتطلب انقسام الخلايا. لذلك، وخلايا T يجب تنشيط O / N.
    1. وعزل خلايا T ساذجة، ومعطف 24 جيدا نسيج لوحة الثقافة مع مكافحة CD3 والأجسام المضادة-CD28 مخففة في DPBS. إضافة 250 ميكرولتر لكل بئر. استخدام المضادة لمكافحة CD3 في 1μg / مل. استخدام مكافحة CD28 في 2 ميكروغرام / مل إذا في نهاية المطاف أن تكون متباينة الخلايا تحت Th0، TH1، TH2 وiTregs الظروف. استخدام مكافحة CD28 في 10 ميكروغرام / مل لشروط Th9 وTh17. احتضان ~ 2 ساعة على 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة.
    2. فقط قبل زراعة الخلايا، وإزالة حل الأجسام المضادة وغسل لوحة مع ~ 250 ميكرولتر من DPBS لكل بئر لإزالة unbouالثانية الأجسام المضادة. يجب الحرص على عدم السماح لوحة تجف حتى معالجة بحد أقصى 6 آبار في وقت واحد. إزالة DPBS غسل وإضافة 1 مل من خلايا CD4 + T ساذجة في R10 المتوسطة في ،75-1 × 10 6 خلايا لكل مل. تنشيط خلايا O / N (14-16 ساعة).
    3. اليوم، خلايا الطرد المركزي التالية في لوحة في 900 x ج لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية لإرفاق الخلايا في الجزء السفلي من الآبار.
    4. جمع وحفظ المتوسطة والحرص على عدم إزاحة الخلايا، واستبدال طاف 1 مل الثقافة فيروس أعدت من بروتوكول إنتاج الفيروس. لا تدع الخلايا تجف حتى معالجة بحد أقصى 4 آبار في وقت واحد.
      1. إلى كل إضافة جيدا 1 ميكرولتر من 8 ملغ / مل polybrene و 10 ميكرولتر من 1M HEPES 7.5 درجة الحموضة لمساعدة امتصاص الفيروس ومنع قلونة كبيرة في CO المحيطة 2 خلال الطرد المركزي التالية. خلايا الطرد المركزي في لوحة في 900 x ج لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية.
  2. تمايز الخلايا إلى SPECIالمرورية مجموعات فرعية
    1. إزالة بعناية ثقافة طاف الفيروس واستبدالها مع 1 مل من المتوسط ​​جمعت أعلاه في خطوة 3.1.4، كما أنه يحتوي على IL-2 وعوامل نمو الخلايا الأخرى تي. إضافة الكواشف مبين في الجدول رقم (2) وثقافة الخلايا لمدة 3-4 أيام للتمييز الخلايا في مجموعات فرعية محددة.
  3. تحليل الخلايا
    1. لتلطيخ الخلايا السيتوكينات، وعلاج الخلايا مع 1 ميكروغرام / مل كل من Phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) وionomycin عن 4 ساعات. خلال ساعة الأخيرة (2) من التحفيز، إضافة 1 ميكروغرام / مل من brefeldin أ.
    2. Resuspend الخلايا من الجزء السفلي من كل بئر بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل ما يقرب من 10 5 خلايا إلى 96 لوحة جيدا U أسفل (عادة 100 ميكرولتر من 1 مل من ثقافة خلايا ث) لتثبيت وتلطيخ.
    3. لتلطيخ GFP، إصلاح الخلايا مع 100 ميكرولتر من 2٪ امتصاص العرق في RT لمدة 5 دقائق بالضبط، وذلك فترة حضانة أطول وتبييض GFP لالثانية تتداخل مع Foxp3 تلطيخ. غسل الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من DPBS إلى كل بئر وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تخلصي من طاف.
      تحذير: لامتصاص العرق هي سامة. التعامل معها في غطاء الدخان مع الجلد وحماية العين.
    4. إصلاح الخلايا مرة أخرى باستخدام 100 ميكرولتر 1X التثبيت عازلة مصنوعة من عدة تلطيخ Foxp3 (1 حجم العازلة التثبيت إلى 3 مجلدات من مخفف). احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة في RT أو احتضان بدلا من ذلك في 4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    5. بعد التثبيت، permeabilize الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من العازلة permeabilization من نفس المجموعة. في احتضان RT ل30-45 دقيقة ثم الطرد المركزي في 600 x ج عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. لتلوين الأجسام المضادة، وإزالة تثبيت عازلة / permeabilization وإضافة 50 ميكرولتر من العازلة permeabilization جديدة. إضافة الأجسام المضادة المطلوبة المخفف في المخزن permeabilization عند 0.5 ميكرولتر في 50 ميكرولتر العازلة لكل عينة. احتضان لمدة 30-45 دقيقة في RT في الظلام لتجنب التبييض من الانفلونزاالتسمية orescent.
    7. إضافة 150 ميكرولتر العازلة permeabilization وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل المخزن المؤقت permeabilization وإضافة 200 ميكرولتر DPBS. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام بروتوكولات ومبادئ توجيهية محددة إلى أداة في متناول اليد.
      ملاحظة: تأكد من تضمين الضوابط المناسبة لتلطيخ خلوى مثل تلطيخ مع الأجسام المضادة isotype السيطرة، وتحليل الخلايا غير مفعلة أو Th0 المنشط، الخ

Representative Results

نجاح هذا النظام التجريبي يتطلب السكان نقية للغاية من خلايا تي وارتفاع عيار الاستعدادات الارتجاعي. وتظهر نتائج ممثلة هنا كأمثلة على التجارب الناجحة الشكل 1 يدل على نقاء نموذجية من السكان قبل ومختارة آخر في كل مرحلة من مراحل السذاجة التائية المساعدة بروتوكول العزلة خلية الشكل 2 و 3 توضيح تحليل الإنتاج الارتجاعي من خلال التعبير GFP في الخلايا كلوة 293T transfected (الشكل 2) وخلايا تي transduced (الشكل 3). الكفاءة ترنسفكأيشن من الخلايا كلوة 293T يمكن أن تختلف بشكل كبير مع بنيات فيروسات مختلفة، ولكن هذا غالبا ما لا يتماشى مع مستوى الإنتاج الارتجاعي لاحظ مع عدد الخلايا GFP + T. أيضا، فإن عدد الخلايا GFP + T يمكن أن تختلف تبعا للظروف الاستقطاب. وعلاوة على ذلك، ممستوى التعبير EAN من GFP والجينات إدراجها يمكن أن تختلف تبعا لعدد نسخ الفيروس المتكاملة، وتأثير الموقع التكامل في النسخ، والآليات التنظيمية بعد النسخي التي تؤثر على نسخة الفيروسي.

وأخيرا، ويبين الشكل 4 بعض النتائج النموذجية لاحظنا مع التائية المساعدة تمايز الخلايا عندما miRNAs مير 15B وoverexpressed / 16. وتشير هذه النتائج بعض التقلبات التي يمكن أن تحدث في تجربة فردية يجب أن يثبت الآثار الحقيقية لذلك عن طريق التحليل الإحصائي لتكرار تجارب متعددة باستخدام استعدادات مختلفة من الخلايا التائية المساعدة. في هذه التجارب يمكن أن يكون استجابات TH2 الصعب مراقبة في C57BL / 6 خط المستخدمة هنا لأنها عرضة للاستجابات TH1. وبالمثل، يمكن IL-9 تلطيخ يكون من الصعب اكتشاف فوق الخلفية. لذلك، لا بد من القيام الضوابط نمط إسوي وانشاء التعويض المناسب لضمان الجا الصحيحتينغ التعبير خلوى. في نتائجنا وجدنا أن مير 15B / 16 يعزز iTreg الاستقراء عن طريق تثبيط mTOR س إشارات الطريق من خلال قمع التعبير عن Rictor مكونات وmTOR س 15. مير 15B / 16 يمكن أن تؤثر في بعض الأحيان Th0، TH1، وTh17 التمايز في التجارب الفردية، ولكن ليس هناك تأثير كبير عندما بحثت في التجارب المتكررة متعددة. في المقابل مير 15B / 16 overexpression لا تقمع بشكل كبير Th9 التمايز (أنظر المرجع 18).

شكل 1
الشكل 1. نقاء نموذجي من الخلايا التائية المساعدة في كل مرحلة من العزلة. التدفق الخلوي الممثل نتائج مستضدات أشار ترد من بوابة الخلايا الحية المعينة في مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) المؤامرات. (A) قبل وبعد CD4 اختيار السلبية. ملامح التعبير من CD4،وتظهر CD8a، وMHCII. هذه توضيح تخصيب الخلايا التائية المساعدة وفقدان السامة للخلايا خلايا T ومعقد التوافق النسيجي الكبير الثاني معربا عن الخلايا. ينبغي أن يؤدي وتنقية جيدة في ~ 90٪ خلايا CD4 + T في هذه المرحلة. (ب) اختيار CD25. على اليسار هي ملامح التعبير من CD4، CD8a، وMHCII، وعلى اليمين هي CD4 والتعبير CD25 لمحات من قبل واختيار آخر. عند هذه النقطة> 95٪ من CD25 الخلايا المحددة سلبا ينبغي أن يكون CD4 + CD25 -. (C) CD62L الاختيار. وترد CD4، CD8a، وMHCII ملامح التعبير على اليسار. على اليمين وأظهرت ملامح التعبير عن CD62L وCD44 للخلايا ما قبل وما بعد CD62L اختيار جنبا إلى جنب مع CD4 وCD62L الشخصي تعبير عن وظيفة الخلايا المحددة. بعد اختيار CD62L تتم إزالة خلايا الذاكرة تقريبا جميع (CD44 +) ترك السكان التخصيب الخلايا التائية المساعدة الساذجة التي تحتوي على 10-15٪ خلايا المستجيب (CD62L منخفض). للجميعواستمرت ملامح نظام مراقبة الأصول الميدانية، وإعدادات تعادل والمقاييس للمعلمة محددة في جميع أنحاء. وتمثل الأرقام النسبة المئوية للخلايا داخل الكتلة السكانية المعزولة. ومن المقرر يفترض أن إجهاد خلال بروتوكول انخفاض طفيف في حجم الخلايا بعد الاختيار الأولي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل الخلايا 293T كلوة-transfected الارتجاعي. ويظهر التعبير GFP في الخلايا كلوة 293T التي كانت إما untransfected أو transfected وتحليلها بعد جمع supernatants ثقافة الفيروسية. وقد تم تحليل GFP في الخلايا الحية من البوابة على FSC ومؤامرة محكمة أمن الدولة في الفريق الأول. وتمثل الأرقام نسبة GFP + الخلايا داخل المنطقة المغلقة. ر نموذجي وتتراوح كفاءة ransfection بين 30-90٪. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
ويظهر الشكل 3. تحليل الفيروس الارتجاعي transduced الخلايا التائية المساعدة. التعبير GFP في الخلايا التائية المساعدة فيروسات-transduced بعد التمايز في Th0، TH1، TH2، Th9، Th17، وظروف الاستقطاب Treg لمدة ثلاثة أيام. تم بوابات التحليل على الخلايا الحية والمفعلين مبين في لوحة FSC / SSC. الكفاءة تنبيغ يمكن أن تختلف بين 10-75٪ اعتمادا على بناء وظروف الاستقطاب. وبالمثل، فإن كثافة الفلورسنت يعني التعبير GFP يمكن أن تختلف. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (4)
الرقم 4. تأثير مير 15B / 16 overexpression على المساعد تمايز الخلايا تي في ظروف الاستقطاب مختلفة. وتظهر ملامح خلوى التمثيلية على GFP + السكان من الخلايا من الشكل (3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه البروتوكولات الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول كما جداول البيانات إكسل.

المساعدتي الظروف خلية الاستقطاب
Th0 مكافحة IL-4 5 ميكروغرام / مل
مكافحة IFN-γ 5 ميكروغرام / مل
TH1 المترابط IL-12 20 نانوغرام / مل
مكافحة IL-4 5 ميكروغرام / مل
TH2 المؤتلف IL-4 40 نانوغرام / مل
مكافحة IFN-γ 5 ميكروغرام / مل
Th9 المؤتلف TGF-β 2.5 نانوغرام / مل
المؤتلف IL-4 40 نانوغرام / مل
مكافحة IFN-γ 10 ميكروغرام / مل
Th17 المؤتلف TGF-β 2.5 نانوغرام / مل
المؤتلف IL-6 50 نانوغرام / مل
مكافحة IFN-γ 5 ميكروغرام / مل
مكافحة IL-4 5 ميكروغرام / مل
مكافحة IL-2 5 ميكروغرام / مل
Tregs المؤتلف TGF-β 2.5 نانوغرام / مل
المؤتلف IL-2 5 نانوغرام / مل

الجدول 2: مساعد تي خلية فرعية ظروف الاستقطاب.

Discussion

فيروسات overexpression بوساطة الجينات هو وسيلة قوية لتحليل وظيفة في الخلايا التائية المساعدة، وتنميتها وظيفة غالبا ما يحدده مستوى التعبير من المنظمين الرئيسيين. ومع ذلك، لا بد من تفسير حذرا من نتائج لمستويات التعبير أعلى بكثير من تلك الجينات الذاتية يمكن إدخال العديد من القطع الأثرية. ولذلك، ينبغي أن يقترن هذا الأسلوب مع الآخرين للتحقق من مدى أهمية وظيفة. على سبيل المثال، يجب أن تستكمل overexpression من انخفاض التعبير باستخدام الرناوات siRNAs أو تعطيل مورثة إذا كانت متوفرة. مع miRNAs، نحن تستكمل التجارب overexpression مع تلك الحجب باستخدام الفيروسات التي overexpressed ميرنا الاصطناعي استهداف المواقع التي تصرف مثبطات تنافسية، لميرنا 15. ويمكن أيضا أن تستخدم فيروسات خلايا transduced في فحوصات البيوكيميائية التي تنطوي على الحمض النووي الريبي وتحليل البروتين. ومع ذلك، يشكل قيدا رئيسيا من هذه التجارب هو كفاءة الدقة التنبيغulting في يسكنها خليط من الخلايا transduced وuntransduced. ولذلك، فإن هذه المقايسات على الأرجح تتطلب فرز من GFP + السكان. وأخيرا، يجب أن تكون مجتمعة في فحوصات المختبر التمايز مع التجارب في الجسم الحي، وطريقة واحدة يمكن تحقيق ذلك هو من خلال نقل adoptively خلايا تي transduced في الفئران، وبعد التمايز وتأثيرها على الاستجابة المناعية.

واحدة من القيود الرئيسية لهذا النظام هو حجم الجينوم الحمض النووي الريبي التي يمكن تعبئتها في القفيصة فيروسات. في تجربتنا، والحد الأقصى لحجم إدراج لنظام فيروسات MIG أن يعطي إنتاج فيروس الجيد هو 3-3.5 كيلو بايت. وبالتالي، لا يمكن تحليل الجينات أكبر مع هذا النظام، كما أنها تعطي التتر فيروس الفقيرة. ومع ذلك، فإن معظم الجينات هي أصغر من هذا الحجم لذلك هذا النظام مفيد لمجموعة واسعة من الدراسات الجينية.

مع تنبيغ فيروسات، العديد من البدائل في هذه protocoوقد استخدمت ليرة سورية. وقد استخدمت العديد من الباحثين خطوط الخلايا التعبئة والتغليف التي تعبر عن ثبات الجينات فيروسات (على سبيل المثال مرجع 16). ومع ذلك، فقد حصل على أعلى التتر باستخدام خلايا كلوة 293T القياسية مع زملاء ترنسفكأيشن من ناقلات فيروس المساعد PCL للبيئة. عزل المساعد السذاجة خلايا تي ويمكن أيضا أن يتحقق من خلال الفرز الخلية بدلا من المغناطيسي حبة وفصل الخلية بروتوكول العمود، ولكن هذا يتطلب الوصول إلى فارز الخلية، والتكاليف لمرة ونوع وعادة ما تكون أعلى من الكواشف حبة. وأخيرا، هناك اختلافات على شروط تفعيل استخدامها للتمييز الخلايا التائية المساعدة إلى مجموعات فرعية مختلفة. على سبيل المثال، TCR تحفيز خلايا لفترة طويلة جدا قبل التعرض لظروف حمل Treg يمكن أن تحول دون تحريض من 16. هذا يمكن أن يكون مشكلة لأن التعبير فيروسات يتطلب تقسيم الخلايا الناجم عن تحفيز الخلايا. ومع ذلك، فقد وجدنا تحريض Treg كفاءة استخدام هذا البروتوكول مع O / أكتيف Nأوجه قبل تنبيغ فيروسات.

ضمن هذه البروتوكولات، يتطلب التطبيق الناجح عدة عوامل. ارتفاع عيار الاستعدادات الارتجاعي تحتاج ترنسفكأيشن كفاءة من كلوة خلايا 293T الحمض النووي ذات جودة عالية جدا ومستعدة على وجه التحديد 2X HBS مهمة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كثافة خلية من خلايا كلوة 293T يجب أن يكون حوالي 50٪ في وقت ترنسفكأيشن لتعبير جيد من الحمض النووي transfected يتطلب أن الخلايا تنمو بنشاط، وسوف تحول دون هذا إذا كانت الخلايا متفرق جدا أو كثيفة. يجب أن الخلايا في كثافة الأمثل خلال ترنسفكأيشن تصل إلى نقطة التقاء في مرحلة ما خلال الخطوات جمع الفيروس، ولكنها ستواصل إنتاج مخزونات فيروس ارتفاع عيار كل طريق للوصول الى جمع الماضي. التمايز كفاءة الخلايا التائية المساعدة يتطلب نوعية جيدة خلية ضمان ذلك أن الخلايا المعزولة إلى نقاء موضح في الشكل 1. وبالمثل، فإن نوعية الخلايا تعتمد على الاب الفئرانام التي تم عزلها. لهذه الدراسات، وقد استخدمنا 6-8 الاسبوع C57BL البالغ من العمر / 6 الفئران. يمكن أن الفئران الأكبر سنا لديهم خلايا أقل ساذجة، وقد تختلف سلالات أخرى في المفاضلة الخاصة بهم. على سبيل المثال، الفئران BALB / ج أكثر عرضة لردود TH2 من C57BL / 6 الفئران 17 حتى كما هو مذكور أعلاه، C57BL / 6 خلايا تي يمكن أن يكون صعبا للحث على استجابة Th2. وبالإضافة إلى ذلك، أي من الشروط التمايز قد تختلف قليلا من المختبر إلى المختبر، وتأثير overexpression الجين قد تصبح فقط واضح في ظروف دون المستوى الأمثل لذلك قد تحتاج إلى معاير تركيزات خلوى في ظروف الاستقطاب المختلفة. وأخيرا، يمكن أن آثار هذا الجين overexpressed أو شروط الاستقطاب على تكاثر الخلايا تؤثر على كفاءة تنبيغ من الآثار قياس الجينات في المصالح قد تتطلب تحسين توقيت وتركيز الكواشف الاستقطاب. يجب تحسين كل هذه العوامل تؤدي إلى نتائج مفيدة مع هذا النظام.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
DMEM Sigma D5671
Penicillin Streptomycin solution Sigma P4333
L-Glutamine Sigma G7513
β-mercaptoethanol Sigma M3148
DPBS Sigma D8537
MIG vector Addgene Plasmid 9094
pCL-Eco vector Addgene Plasmid 12371
Cell strainer BD Falcon 352350
Magnetic beads mouse CD4 cell kit  Invitrogen (Dynabeads) 11415D
Streptavidin Beads  Miltenyi Biotech 130-048-102
MS cell separation columns Miltenyi Biotech 130-042-201
LS cell separation columns Miltenyi Biotech 130-042-401
CD25 Biotenylated MAb  BD Biosciences 85059 clone 7D4
CD62L Biotenylated MAb  BD Biosciences 553149 clone MEL-14
Polybrene (Hexadimethrine Bromide) Sigma 107689
Anti-CD3 eBiosciences 16-0031-85 clone 145-2C11 
Anti-CD28 eBiosciences 16-0281-85 clone 37.51 
Anti-IL-4 BD Biosciences 559062 clone 11B11
Anti-IFN-gamma BD Biosciences 559065 clone XMG1.2
Anti-IL-2 BD Biosciences 554425 cloneJES6-5H4
Recombinant IL-12 p70 eBiosciences 14-8121
Recombinant IL-4 BD Biosciences 550067
Recombinant TGF-beta eBiosciences 14-8342-62
Recombinant IL-6 eBiosciences 14-8061
Recombinant IL-2 eBiosciences 14-8021
PMA  Sigma P8139
Ionomycin Sigma I0634
Brefeldin A eBiosciences 00-4506
Paraformaldehyde Sigma 16005 Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling 
Foxp3 staining buffer set eBiosciences 00-5523
Anti-CD4  FITC eBiosciences 11-0041 clone GK1.5 
Anti-CD8a perCP-cy5.5 eBiosciences 45-0081-80 clone 53-6.7 
Anti-MHCII PE eBiosciences 12-0920  clone HIS19
Anti-CD25 PE eBiosciences 12-0251-82  clone PC61.5 
Anti-CD62L PE eBiosciences 12-0621-82 clone MEL-14 
Anti-CD44 APC eBiosciences 17-0441 clone IM7 
Anti-IFN-gamma FITC  eBiosciences 11-7311-81 clone XMG1.2
Anti-IL-4 PE BD Biosciences 554435 clone 11B11
Anti-IL-9 PE or APC eBiosciences/Biolegend 50-8091-82/514104 clone RM9A4
Anti-IL-17a PE BD Biosciences 559502 clone TC11-18H10
Anti-Foxp3  APC or PE eBiosciences 17-5773-82/12-5773-80  clone FJK-16s
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
Na2HPO4-2H2O Sigma 71643
Dextrose/Glucose Sigma G7021
HEPES, free acid Sigma H3375
NH4Cl Sigma A9434
Disodium EDTA Sigma D2900000
KHCO3 Sigma 237205
 CaCl2  Sigma C5670

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumjohann, D., Ansel, K. M. MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity. Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).
  2. Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. Epigenetic control of T-helper-cell differentiation. Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).
  3. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
  4. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells. Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).
  5. Miller, A. D., Rosman, G. J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).
  6. Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).
  7. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  8. Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
  9. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  10. Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).
  11. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  12. Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease. J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).
  13. Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function. J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).
  14. Zhou, X., Jeker, L. T., et al. Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).
  15. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR. J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).
  16. Sauer, S., Bruno, L., et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).
  17. Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells. Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).
  18. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation. Immunology. 149, 74-86 (2016).

Tags

علم المناعة، العدد 117، فيروسات تنبيغ، خلايا الفئران تي الابتدائية، التائية المساعدة زنزانة انفرادية، المساعد الخلايا التائية التمايز، والتدفق الخلوي، الرنا الميكروية
فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F.,… More

Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. J. Vis. Exp. (117), e54698, doi:10.3791/54698 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter