Summary
Många experimentella system har använts för att förstå de mekanismer som reglerar T-cellutveckling och funktion i ett immunsvar. Här en genetisk strategi med användning av retroviral transduktion beskrivs, som är ekonomiska, tidseffektivt, och viktigast av allt, mycket informativ i att identifiera regulatoriska vägar.
Protocol
Alla mus arbete som utförs i dessa protokoll genomfördes i enlighet med de djur Scientific Procedures Act, Storbritannien under djuret Project License 70/6965.
1. Retroviral Produktion
Innan du fortsätter få alla nödvändiga godkännanden för att producera genetiskt modifierade organismer och användningen av retrovirus i däggdjursceller.
- Tillväxt av HEK 293T-celler
- Växa HEK 293T-celler på 10 cm vävnadskulturskålar i HEK 293T-medium (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 enheter / ml penicillin 0,1 mg / ml streptomycin, och 2 mM L-glutamin) . För allmän cellpassager, delade celler 1:10 när de når sammanflödet genom att avlägsna mediet och pipettering cellerna från plattan med färsk HEK 293T medium.
OBS: Celler bör nå sammanflytning i 2-3 dagar. 293T HEK-celler fästa löst vid plattan så trypsinering inte krävs. - 24 h före transfektion, dela en confluent plattan med celler 1:10 till en 10 cm platta (en platta per transfektion), så att nästa dag cellerna är ~ 50% konfluenta.
- Växa HEK 293T-celler på 10 cm vävnadskulturskålar i HEK 293T-medium (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 enheter / ml penicillin 0,1 mg / ml streptomycin, och 2 mM L-glutamin) . För allmän cellpassager, delade celler 1:10 när de når sammanflödet genom att avlägsna mediet och pipettering cellerna från plattan med färsk HEK 293T medium.
- Transfektion genom kalciumfosfatutfällning
- Ca 1 h före transfektion, avlägsna mediet från cellerna och tillsätt försiktigt 9 ml färskt HEK 293T-medium för att förhindra att cellerna lossnar från plattan.
- Förbereda 2x HEPES-buffrad saltlösning (2x HBS) och en färsk 2,5 M CaCl2-lösning, såsom beskrivs i Tabell 1. Tina DNA bestånd. För de mest effektiva transfektioner använder plasmid prep kvalitet DNA.
- I en 6 ml rundbottnad eller 15 ml koniska rör lägga 5 pg av retroviralt DNA (pMIG) 4, 5 | ig av Helper virus DNA (PCL-Eco) 7, och H2O till 420 pl. Tillsätt 80 | il av 2,5 M CaCl 2 föra den slutliga volymen till 500 pl.
Obs: Detta tillsammans med nästa steg (tillsats av 2x HBS) kan göras på en vanlig bänk så länge som allmän sterile teknik används. - Tillsätt långsamt 500 pl 2x HBS droppvis till ovanstående DNA-blandningen medan försiktigt vortexa så att lösningen blandas kontinuerligt och Capo 4 fällningar i jämnstora kristaller.
- Överföring till en vävnadsodling huva och tillsätt långsamt den CaPO fyra DNA-blandningen (1 ml) droppvis till de 9 ml medium som täcker cellerna medan konstant och försiktigt virvlande plattan. Än en gång vara noga med att inte ta bort celler från plattan. Placera cellerna tillbaka in i inkubatorn.
OBS: Vid denna punkt Capo 4 fällning är väl synlig i mikroskop som små kristaller om storleken av bakterier. Dessa är lätt ses efter 30-60 min när kristallerna har haft en chans att sedimentera till botten av plattan.
- Insamling av virus i odlingssupematanter.
- Följande dag (helst 12-24 timmar efter transfektion) avlägsna mediet och mata cellerna med 10 mlfärskt HEK 293T-medium återigen vara noga med att inte rubba cellerna från plattan.
OBS: Detta späder ut lymfocyt-hämmande ämnen att HEK 293T-celler utsöndrar till mediet under transfektionen. - På kvällen den andra dagen (~ 24 timmar efter transfektion) foder celler med 3,5 ml färskt HEK 293T medium. Var försiktig så att plattan är placerad exakt nivå i inkubatorn, så att den ena sidan inte är kvar torr.
- Samla medel ~ 12 timmar senare (förvara vid 4 ° C) och foder med 3,5 ml färskt HEK 293T medium. Upprepa samling två gånger på ungefär 12 timmars intervall så att ca 10 ml medium samlas. Detta är den virusstam.
- Snurra ut eventuella kvarvarande HEK 293T-celler och cellrester genom centrifugering vid 600 xg under 5 min. Alternativt, filtrera med hjälp av en 0,45 um, låg proteinbindning, sprutfilter. Store virus vid 4 ° C, och för bästa titer, användas inom en dag eller två, eftersom titer långsamt minskar vid 4 ° C. Inte frEeze, eftersom detta avsevärt minskar titern.
- Följande dag (helst 12-24 timmar efter transfektion) avlägsna mediet och mata cellerna med 10 mlfärskt HEK 293T-medium återigen vara noga med att inte rubba cellerna från plattan.
2. Isolering av Primär Naiv CD4 + T-celler
- Isolering av leukocytceller
- Avliva möss genom cervikal luxation, CO 2 kvävning eller annan human protokoll är lämplig för de bestämmelserna om djurhantering av institutionen.
- Dissekera nyligen avlivade möss och ta bort mjälten och önskad lymfkörtlar 15. Placera organen i brunnarna i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta innehållande R10-medium (RPMI-medium med 10% värmeinaktiverat FBS, 100 enheter / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, och 0,1% β-merkaptoetanol) . Använd en cellkultur huva för dissektion av möss och alla efterföljande manipulationer för att minimera risken för kontaminering i kulturer.
OBS: Håll R10-medium kall och utföra alla de efterföljande reningssteg vid 4 ° C. - Placera en 70 pm cellodlings sil i en 50 ml koniska rör innehållande cirka 5 ml R10 medium. Använd en sil för mjälte och lymfkörtlar på upp till tre möss.
- Lägga mjälte och lymfkörtlar till cellfilter och blöta att använda i slutet av en 5 ml sprutkolv. Skölj med 1-2 ml R10 medium.
- Överför celler till en 15 ml koniska rör och bringa volymen upp till 14 ml med R10. Centrifugera vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten genom att hälla bort det med en ren rörelse för att förhindra att störa cellpelleten.
- Tillsätt 2 ml kall (4 ° C) av röda blodkroppar lyseringsbuffert (Tabell 1) till varje rör. Blanda försiktigt i 3,5 min, varvid röret på is.
OBS: Tidpunkten för röda cellys är avgörande för att förhindra dödsfall av lymfocyter. Därför kommer den exakta tidpunkten för varje sats av Red cellysbuffert måste optimeras. - Lägga ≈12-13 ml R10 medium. centrifug omedelbart och kassera supernatanten som i steg 2.1.5. Utför tvättstegen 2x mer vetth R10-medium för att avlägsna eventuellt kvarvarande röda blodkroppar lyseringsbuffert från cellerna och undvika döden av lymfocyter.
- Räkna celler i en hemocytometer späda 1:20 i trypanblått för att bestämma utbytet av viabla celler. Förväntar cirka 8-10 x 10 7 celler per mus.
- Isolering av CD4 + T-celler med magnetiska pärlor Kit för att ta bort CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC klass II + och Ter-119 + celler.
- Alikvot 8-10 x 10 7 celler från steg 2.1.8 per 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C. Häll av vätskan med en ren rörelse för att förhindra att störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i varje rör i 100 pl värmeinaktiverad FBS tillsätt sedan 100 | il av antikroppblandning ur satsen. Inkubera i 30 min vid 4 ° C med varsam blandning på en vals.
- Även om ovanstående cellerna inkubation, förbereda pärlorna.
- Resuspendera pärlor i flaskan genom att vortexa i> 30 sekunder sedan överföra 1 ml av pärlor per 8-10 x 10 7 beredda celler till en 15 ml koniska rör. Tillsätt 2 ml av R10-medium per ml pärlor och blanda försiktigt.
- Placera röret i magnet under 1 min sedan kassera supernatanten. Ta bort röret från magneten och återsuspendera pärlorna i 4 ml R10 medium. Denna mängd av pärlor är tillräcklig för två rundor av inkubation.
- Tvätta cellerna vid slutet av antikroppen inkubationen (steg 2.2.1) genom tillsats av 10 ml av R10-medium per rör. Försiktigt blanda väl under virvling av röret och centrifugera celler vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C. Häll av vätskan med en ren rörelse för att förhindra att störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i 1 ml av R10 medium.
- Tillsätt 2 ml av de tvättade pärlorna från steg 2.2.2.2 (½ mängden framställd för varje rör) till varje rör av antikroppsbehandlade celler och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C med försiktig blandning på ett roller.
- Resuspendera cellkornsblandningen genom att försiktigt pipettera 5 gånger med en pipett innehållande en smal spetsöppningen. Undvik skumbildning. Placera röret i pärlor magnet för 2 min sedan överföra supernatanten innehållande de negativt selekterade cellerna till ett nytt rör. Hålla dessa celler, eftersom de är CD4 + befolkningen.
- Upprepa negativ val en gång. Snurra cellerna från steg 2.2.5 vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C. Häll av supernatanten som i steg 2.2.3 och återsuspendera i 1 ml av R10-medium. Följ steg 2.2.4 och 2.2.5 igen. Efter den sista magnetisk pärla val, räkna celler för att bestämma återhämtning (typiska utbyten är 15-20 x 10 6 celler per 10 8 leukocyter).
- Isolering av Naiv CD4 + T-celler (CD25 - och CD62L hög) Använda Cell separationskolonner
- Centrifugera CD4 + T-celler vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C och återsuspendera i 150 till 200 | j, l avR10 medium per 10 8 celler. Tillsätt 2 pl lager biotinylerad CD25 monoklonal antikropp (klon 7D4). Inkubera i 30 min vid 4 ° C med varsam blandning på en vals.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml av cellseparationskolonnbuffert (tabell 1). Centrifugera vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C. Ta bort så mycket supernatanten som möjligt och uppskatta volymen av buffert / celler kvar. Återsuspendera till en slutlig volym av ca 90 | j, l per 10 7-celler.
- Tillsätt 20 ul streptavidin pärlor per 10 7 celler och blanda med mjuka flicks. Inkubera i 15 min vid 4 ° C.
- Medan celler inkubation, förbereda medelseparationscell (MS) kolumner för manuell inställning. Varje MS-kolonn behåller 10 7-celler, och eftersom CD25 + celler representerar typiskt ca 10% av den totala CD4 + celler, använder en kolonn per 10 8 CD4 + T-celler. Tillsätt 500 pl av cellseparationskolonnbuffert till kolonnenoch låt rinna igenom. Upprepa ytterligare 2 gånger.
- Vid slutet av cell / bead inkubation, tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml av cellseparationskolonnbuffert och centrifugering vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i 500 pl av cellseparationskolonnbuffert per 10 8 celler, men fortfarande använda 500 ^ om det finns färre celler.
- Applicera 500 pl av cell / pärlsuspension till kolonnen och samla flödet genom. Passera detta över kolonnen en mer tid och samla flödet genom en gång. Skölj kolonnen 3 ggr med 500 pl cellseparationskolonnbuffert, lägga till varje flöde genom dessa sköljningar till de uppsamlade cellerna. Dessa är de CD25 - celler. Räkna celler för att bestämma utbytet.
- Om tregs (CD25 + celler) önskas, isolera följande.
- Ta bort kolumnen från separatorn och hålla den över en öppen allmän rör för att bevara sterilitet. Snabbt pipett 500 pl cellseparationsbuffert på colUMN och bestämt spola ut den positiva fraktionen med hjälp av kolven medföljer kolonnen.
- Upprepa spolningsprocedur 2 gånger till. Passera positiva fraktionen över ett färskt MS cellseparationskolonnen och häll bort denna genomströmning. Ordentligt spola ut de positiva cellerna tre gånger, såsom före och centrifugera celler vid 600 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i 1 ml R10-medium och räkna för att bestämma utbytet.
- För att erhålla CD25 - CD62L hög T-celler, centrifugera CD25 - T-celler isolerade ovan i steg 2.3.6 vid 600 xg under 5 min vid 4 ° och återsuspendera i 150 till 200 | j, l av R10-medium per 10 7-celler. Tillsätt 5 | il lager biotinylerad CD62L monoklonal antikropp (klon MEL-14) och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C med varsam blandning på en vals som tidigare.
- Utför tvätt, Streptavidin pärlbindning och cellseparationskolonn preparat såsom beskrivits för Treg isolering protokoll (2.3.7). Den här gången användningden stora cellseparation (LS) -kolonn, som har en kapacitet på 10 8 celler.
- Sedan CD62L hög T-celler utgör typiskt ca 60-70% av CD25 - celler, använder 1 LS cellseparationskolonn per 10 8 celler. Lägg cell / pärlblandningen till LS cellseparationskolonn såsom beskrivs i steg 2.3.6 - denna gång kasta den slutliga flödet genom och kolonnen sköljningar. Samla CD62L hög T-celler såsom beskrivs i steg 2.3.7 för cellkollektion CD25 +.
- Centrifugera cellerna vid 600 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i 1 ml R10 och räkna för att bestämma utbytet. Späd till 0,75-1 X10 6 celler per ml i R10-medium.
- Analysera renhet celler genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
- FACS-färgning strategi
- För celler före och efter alla stadier av isolering, fläck med CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (hjälpar och cytotoxiska T-celler), och MHCII-PE (MHC klass Il-uttryckande celler).
- För celler före och efter CD25 isolering, fläck med CD4-FITC och CD25-PE (tregs jämfört med andra hjälpar-T-celler).
- För celler före och efter CD62L isolering fläck med CD4-FITC, CD62L-PE och CD44-APC (naiva kontra minne och effektor hjälpar-T-celler).
- För varje analys plats 10 5 celler i en brunn i en 96 brunnars U-bottnad platta. Centrifugera vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C. Häll av mediet och tvätta cellerna en gång med 200 mikroliter DPBS. Centrifug enligt ovan och häll bort DPBS.
- Tillsätt 50 pl av DPBS per brunn och 0,5 | il av varje antikropp (såsom indikeras i 2.4.1) och inkubera vid RT i 30 minuter i mörker för att undvika blekning av fluorescerande markör.
- Tvätta cellerna 2x med DPBS som i 2.4.2 och omedelbart analysera på en flödescytometer använder protokoll och riktlinjer som är specifika för instrumentet till hands.
OBS: Efter den slutliga isoleringen steget i en bra förberedelse, 90-95% av cellervara CD4 + CD25 - CD62L hög T-celler.
- FACS-färgning strategi
3. Retroviral Transduction av aktiverade CD4 + T-celler och deras differentiering till specifika T Helper Subsets
- retroviral transduktion
OBS: Retroviral integration och uttryck av gener kräver celldelning. Därför måste T-celler aktiveras O / N.- Medan isolering av de naiva T-celler, belägga en 24 brunnars vävnadsodlingsplatta med anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar utspädda i DPBS. Tillsätt 250 | il per brunn. Använd anti anti-CD3 på 1 pg / ml. Använd anti-CD28 på 2 pg / ml om celler i slutändan kommer att differentieras enligt Th0, Th1, Th2 och iTregs villkor. Använda anti-CD28 på 10 | ig / ml för Th9 och Th17 betingelser. Inkubera ~ 2 h vid 37 ° C i en vävnadsodlingsinkubator.
- Strax före odla cellerna, ta bort antikropplösningen och tvätta plattan med ~ 250 | il DPBS per brunn för att avlägsna unbound antikropp. Var noga med att inte låta plattan torka ut så bearbeta högst 6 brunnar åt gången. Ta bort DPBS tvätta och tillsätt 1 ml naiva CD4 + T-celler i R10-medium vid 0,75-1 x 10 6 celler per ml. Aktivera celler O / N (14-16 timmar).
- Följande dag, centrifugera cellerna i plattan vid 900 xg under 5 min vid 30 ° C för att fästa cellerna till botten av brunnarna.
- Samla och spara mediet försiktigt så att inte förskjuta cellerna, och ersätta med 1 ml virus odlingssupernatant framställd av virusproduktionen protokollet. Låt inte cellerna torka ut så bearbeta högst 4 brunnar åt gången.
- Till varje brunn tillsätts 1 | il 8 mg / ml polybren och 10 | il av 1 M HEPES pH 7,5 för att underlätta virusupptag och förhindra nämnvärd alkalisering i omgivnings CO 2 under följande centrifugering. Centrifugera cellerna i plattan vid 900 xg under 90 min vid 30 ° C.
- Differentiering av celler in Specific Delmängder
- Försiktigt bort viruset odlingssupernatanten och ersätta med 1 ml av mediet som samlats ovan i steg 3.1.4, eftersom det innehåller IL-2 och andra T-cell tillväxtfaktorer. Tillsätta reagens som anges i tabell 2 och odlingsceller i 3-4 dagar för att differentiera celler i specifika underuppsättningar.
- Analys av celler
- För intracellulär färgning av cytokiner, behandla cellerna med 1 | ig / ml vardera av Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) och jonomycin under 4 timmar. Under den sista 2 h av stimulering, tillsätt 1 | j, g / ml av Brefeldin A.
- Resuspendera cellerna från botten av varje brunn genom att pipettera upp och ned flera gånger. Överför ca 10 5 celler till en 96 brunnars U bottenplattan (vanligen 100 ^ från 1 ml kultur av Th-celler) för fixering och färgning.
- För GFP färgning, fixa celler med 100 | il av 2% paraformaldehyd vid RT under exakt 5 min, som en längre inkubationstid bleker GFP ennd störa Foxp3 färgning. Tvätta cellerna genom tillsats av 100 | il DPBS till varje brunn och centrifugera vid 600 xg vid 22 ° C under 5 min. Häll av supernatanten.
Varning: Paraformaldehyd är giftig. Hantera det på ett dragskåp med hud och ögonskydd. - Fixera cellerna igen med 100 pl 1 x Fixering buffert gjord av Foxp3 färgningskit (en volym Fixering buffert till 3 volymer spädningsmedel). Inkubera cellerna i 45 minuter vid RT eller alternativt inkubera vid 4 ° C under 16 h.
- Efter fixering, permeabilize celler genom att tillsätta 100 pl permeabilization buffert från samma kit. Inkubera vid RT i 30 till 45 min centrifugera sedan vid 600 xg vid 22 ° C under 5 min.
- För antikroppsfärgning, ta bort fixering / permeabilization buffert och tillsätt 50 pl färsk permeabilization buffert. Tillsätt krävs antikropp utspädd i permeabilization buffert vid 0,5 l per 50 pl buffert per prov. Inkubera i 30-45 minuter vid rumstemperatur i mörker för att undvika blekning av influensaorescent label.
- Lägg 150 pl permeabilization buffert och centrifugera vid 600 xg vid 22 ° C under 5 min. Kasta permeabilization buffert och tillsätt 200 pl DPBS. Analysera på en flödescytometer använder protokoll och riktlinjer som är specifika för instrumentet till hands.
OBS: Var noga med att inkludera lämpliga kontroller för cytokin färgning såsom färgning med isotyp kontrollantikroppar, analysera icke-aktiverade eller Th0 aktiverade celler, etc.
Representative Results
Framgången för detta experimentella system kräver mycket rena populationer av T-celler och med hög titer retrovirusberedningar. Representativa resultat visas här som exempel på framgångsrika experiment. Figur 1 visar den typiska renhet av pre- och post-utvalda populationer i alla stadier i den naiva hjälpar-T-cellisolering protokoll. Figur 2 och 3 illustrerar analys av retrovirus produktionen genom GFP-uttryck i transfekterade HEK 293T-celler (Figur 2) och omvandlade T-celler (Figur 3). Transfektionseffektiviteter av HEK 293T-celler kan variera avsevärt med olika retrovirala konstruktioner, men detta ofta inte korrelerar med nivån av retrovirus produktion observerades med antalet GFP + T-celler. Dessutom kan antalet GFP + T-celler variera beroende på polariseringsförhållandena. Vidare mean expressionsnivån av GFP och den insatta genen kan variera beroende på antalet viruskopior integrerade, effekten av integrationsstället på transkription, och post-transkriptionella regulatoriska mekanismer som påverkar den virala transkriptet.
Slutligen, Figur 4 visar några typiska resultat som vi har observerat med hjälpar-T-cellsdifferentiering när miRNA miR-15b / 16 överuttrycks. Dessa resultat visar en del av variationen som kan förekomma inom en enskild experiment så sanna effekter måste styrkas genom statistisk analys av flera upprepade försök med olika preparat av hjälpar-T-celler. I dessa experiment Th2 svaren kan vara svårt att observera i C57BL / 6 linje används här eftersom de är benägna att Th1-svar. På samma sätt kan IL-9-färgning vara svårt att upptäcka över bakgrunden. Därför är det viktigt att göra isotypkontrollerna och ställa in korrekt ersättning för att säkerställa korrekt gating av cytokin uttryck. I våra resultat har vi funnit att MIR-15b / 16 förbättrar iTreg induktion genom att hämma mTOR signalväg genom att undertrycka uttrycket av komponenter Rictor och mTOR 15. MIR-15b / 16 kan ibland påverka Th0, Th1 och Th17 differentiering i enskilda experiment, men det finns ingen signifikant effekt när de undersöks i flera upprepade experiment. I motsats MIR-15b / 16 uttryck inte undertrycka signifikant Th9 differentiering (se 18 referens).
Figur 1. Typisk renhet av hjälpar-T-celler i varje steg av isolering. Representant flödescytometri resultaten av de angivna antigenerna visas från porten av levande celler som utsetts i Forward Scatter (FSC) och sidospridning (SSC) tomter. (A) före och efter CD4 negativ selektion. Uttryck profiler av CD4,CD8a och MHCII visas. Dessa illustrerar anrikning av hjälpar-T-celler och förlust av cytotoxiska T-celler och MHC klass Il-uttryckande celler. En bra rening bör resultera i ~ 90% CD4 + T-celler i detta skede. (B) CD25 val. På vänster är ett uttryck profiler av CD4, CD8a och MHCII, och till höger är CD4 och CD25 uttryck profiler före och efter valet. Vid denna tidpunkt> 95% av CD25 negativt utvalda celler bör vara CD4 + CD25 -. (C) CD62L val. CD4, CD8a och MHCII uttryck profiler visas till vänster. Till höger expressionsprofiler för CD62L och CD44 visas för före och efter CD62L utvalda celler tillsammans med CD4 och CD62L uttrycksprofilen för post utvalda celler. Efter CD62L val så gott som alla minnesceller (CD44 +) tas bort lämnar ett höganrikat population av naiva hjälpar T-celler som innehåller 10-15% effektorceller (CD62L låg). För allaFACS profiler, motsvarande inställningar och skalor för en specifik parameter bibehölls under. Siffrorna representerar procentandelen av celler inom en gated population. Den svaga minskningen i storlek av cellerna efter det första urvalet är förmodligen på grund av mekaniska påfrestningar under protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Analys av retrovirus-transfekterade HEK 293T-celler. GFP-uttryck visas i HEK 293T-celler som antingen otransfekterade eller transfekterade och analyserades efter insamling av virus odlingssupernatanter. GFP analys gjordes på levande celler från porten på FSC och SSC tomt i den första panelen. Siffrorna representerar procentandelen av GFP + celler inom gated regionen. typiska transfection effektivitet varierar mellan 30-90%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av retrovirus transducerade hjälpar-T-celler. GFP-uttryck visas i retrovirala-transducerade hjälpar-T-celler efter differentiering i Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, och Treg polariseringsförhållanden under tre dagar. Analysen gated på levande och aktiverade celler som anges i FSC / SSC panelen. Transduction effektivitetsvinster kan variera mellan 10-75% beroende på konstruktionen och polariseringsförhållanden. Likaså var den genomsnittliga fluorescensintensiteten av GFP uttryck kan variera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekt av MIR-15b / 16 uttryck på hjälpar-T-celldifferentiering i olika polariseringsförhållanden. Representativa cytokinprofiler visas på GFP + populationen av celler från figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1:. Buffertar som används i dessa protokoll Klicka här för att ladda ner tabellen som ett Excel-ark.
| HjälpareT-cellpolariseringsförhållanden | ||
| Th0 | anti-IL-4 | 5 | j, g / ml |
| anti-IFN-γ | 5 | j, g / ml | |
| Th1 | rekombinant-IL-12 | 20 ng / ml |
| anti-IL-4 | 5 | j, g / ml | |
| Th2 | rekombinant IL-4 | 40 ng / ml |
| anti-IFN-γ | 5 | j, g / ml | |
| Th9 | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-4 | 40 ng / ml | |
| anti-IFN-γ | 10 | j, g / ml | |
| Th17 | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-6 | 50 ng / ml | |
| anti-IFN-γ | 5 | j, g / ml | |
| anti-IL-4 | 5 | j, g / ml | |
| anti-IL-2 | 5 | j, g / ml | |
| tregs | rekombinant TGF-β | 2,5 ng / ml |
| rekombinant IL-2 | 5 ng / ml | |
Tabell 2: Hjälpar-T-cell-subset polariseringsbetingelser.
Discussion
Retroviral medierad överuttryck av gener är ett effektivt sätt att analysera funktion i hjälpar-T-celler, som deras utveckling och funktion är ofta bestäms av uttrycksnivån för nyckelregulatorer. Dock är försiktig tolkning av resultaten krävs eftersom uttrycksnivåer betydligt över de den endogena genen kan införa många artefakter. Därför bör denna teknik kombineras med andra för att kontrollera relevansen av funktionen. Till exempel bör överuttryck kompletteras med minskad uttryck med hjälp av siRNA eller gen knockouts om sådana finns. Med miRNA, kompletterade vi överuttryck experiment med dem att blockera genom att använda virus som överuttryckta artificiell miRNA inriktning webbplatser som fungerade som konkurrerande hämmare för en miRNA 15. Retrovirala transducerade celler kan också användas i biokemiska analyser som inbegriper RNA och proteinanalys. Emellertid är en stor begränsning av dessa experiment effektiviteten i transduktion resulting i en blandad population av transducerade och otransducerade celler. Därför kommer dessa analyser mest sannolikt att kräva sortering av GFP + populationen. Slutligen bör differentiering in vitro-analyser kombineras med in vivo experiment, och ett sätt detta kan uppnås är genom adoptivt överföra transducerade T-celler i möss och efter deras differentiering och deras effekt på immunsvaret.
En av de viktigaste begränsningar för detta system är storleken på RNA-genomet som kan paketeras in i retrovirala kapsiden. I vår erfarenhet, den maximala insatsen storlek för MIG retroviral system som ger bra virusproduktionen är 3-3,5 kb. Därför kan större gener inte analyseras med detta system, eftersom de ger dåliga virustitrar. Men de flesta gener är mindre än denna storlek, så detta system är användbart för ett stort antal olika genprodukter studier.
Med retroviral transduktion, flera alternativ inom dessa protocols har använts. Många forskare har utnyttjat förpackningar cellinjer som stabilt uttrycker de retrovirala generna (exempelvis referens 16). Emellertid har vi erhållit de högsta titrarna med användning av standard HEK 293T-celler med co-transfektion av pCl-Eco hjälpvirus-vektor. Isolering av naiva hjälpar-T-celler kan också åstadkommas genom cellsortering i stället för magnetiska pärlor och cellseparationskolonn protokollet, men detta kräver tillgång till en cellsorterare, och kostnaderna för sorterings tid är vanligtvis högre än pärla reagens. Slutligen finns det variationer på aktiveringsbetingelser som användes för att differentiera hjälpar-T-celler in i de olika undergrupper. Till exempel, TCR-stimulering av celler för länge innan exponering för Treg inducerande betingelser kan hämma deras induktion 16. Detta kan vara ett problem eftersom retroviral expressions kräver celldelning som induceras genom stimulering av celler. Trots detta har vi funnit effektiv Treg induktion med detta protokoll med O / N activation före retroviral transduktion.
Inom dessa protokoll kräver framgångsrik tillämpning flera faktorer. Hög titer retrovirus preparat behöver effektiv transfektion av HEK 293T-celler så hög kvalitet DNA och exakt beredda 2x HBS är viktiga. Dessutom måste celldensiteten av HEK 293T-celler vara ungefär 50% vid punkten för transfektion eftersom god expression av den transfekterade DNA kräver att cellerna är aktivt växande, och detta kommer att inhiberas om cellerna är alltför glest eller tätt. Celler vid optimal täthet under transfektion ska nå sammanflödet vid något tillfälle under de virusuppsamlingssteg, men de kommer att fortsätta att producera hög titer virusstammar hela vägen fram till den sista samlingen. Effektiv differentiering av hjälpar-T-celler kräver god cellkvalitet så säkerställa att isolerade celler är att renheten som illustreras i figur 1. På samma sätt, är beroende av möss fr kvaliteten hos cellernaabout vilken de isolerades. För dessa studier har vi använt 6-8 veckor gamla C57BL / 6-möss. Äldre möss kan ha mindre naiva celler, och andra stammar kan skilja sig i deras differentiering. Till exempel BALB / c-möss är mer benägna att Th2-svar än C57BL / 6-möss 17 så som nämnts ovan, C57BL / 6 T-celler kan vara svåra att inducera ett Th2-svar. Dessutom kan vilken som helst av de differentieringsförhållandena varierar något från labb till labb, och effekten av genen uttryck kan endast bli uppenbara i suboptimala förhållanden så cytokin koncentrationer i de olika polariseringsförhållandena kan behöva titreras. Slutligen kan effekterna av det överuttryckta genen eller de polariseringsförhållandena på cellproliferation påverka transduktionseffektiviteten så mäter effekterna av genen av intresse kan kräva optimering av timing och koncentrationen av polariserande reagens. Optimera alla dessa faktorer bör leda till informativa resultat med detta system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Sigma | P4333 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| DPBS | Sigma | D8537 | |
| MIG vector | Addgene | Plasmid 9094 | |
| pCL-Eco vector | Addgene | Plasmid 12371 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Magnetic beads mouse CD4 cell kit | Invitrogen (Dynabeads) | 11415D | |
| Streptavidin Beads | Miltenyi Biotech | 130-048-102 | |
| MS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| LS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| CD25 Biotenylated MAb | BD Biosciences | 85059 | clone 7D4 |
| CD62L Biotenylated MAb | BD Biosciences | 553149 | clone MEL-14 |
| Polybrene (Hexadimethrine Bromide) | Sigma | 107689 | |
| Anti-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | clone 145-2C11 |
| Anti-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | clone 37.51 |
| Anti-IL-4 | BD Biosciences | 559062 | clone 11B11 |
| Anti-IFN-gamma | BD Biosciences | 559065 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554425 | cloneJES6-5H4 |
| Recombinant IL-12 p70 | eBiosciences | 14-8121 | |
| Recombinant IL-4 | BD Biosciences | 550067 | |
| Recombinant TGF-beta | eBiosciences | 14-8342-62 | |
| Recombinant IL-6 | eBiosciences | 14-8061 | |
| Recombinant IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Brefeldin A | eBiosciences | 00-4506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling |
| Foxp3 staining buffer set | eBiosciences | 00-5523 | |
| Anti-CD4 FITC | eBiosciences | 11-0041 | clone GK1.5 |
| Anti-CD8a perCP-cy5.5 | eBiosciences | 45-0081-80 | clone 53-6.7 |
| Anti-MHCII PE | eBiosciences | 12-0920 | clone HIS19 |
| Anti-CD25 PE | eBiosciences | 12-0251-82 | clone PC61.5 |
| Anti-CD62L PE | eBiosciences | 12-0621-82 | clone MEL-14 |
| Anti-CD44 APC | eBiosciences | 17-0441 | clone IM7 |
| Anti-IFN-gamma FITC | eBiosciences | 11-7311-81 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-4 PE | BD Biosciences | 554435 | clone 11B11 |
| Anti-IL-9 PE or APC | eBiosciences/Biolegend | 50-8091-82/514104 | clone RM9A4 |
| Anti-IL-17a PE | BD Biosciences | 559502 | clone TC11-18H10 |
| Anti-Foxp3 APC or PE | eBiosciences | 17-5773-82/12-5773-80 | clone FJK-16s |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | 71643 | |
| Dextrose/Glucose | Sigma | G7021 | |
| HEPES, free acid | Sigma | H3375 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Disodium EDTA | Sigma | D2900000 | |
| KHCO3 | Sigma | 237205 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 |
References
- Baumjohann, D., Ansel, K. M. MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity. Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).
- Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. Epigenetic control of T-helper-cell differentiation. Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells. Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).
- Miller, A. D., Rosman, G. J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).
- Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease. J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).
- Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function. J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).
- Zhou, X., Jeker, L. T., et al. Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR. J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).
- Sauer, S., Bruno, L., et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).
- Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells. Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation. Immunology. 149, 74-86 (2016).
