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Immunology and Infection

एक आनुवंशिक दृष्टिकोण के रूप में अध्ययन करने के लिए सहायक टी कोशिकाओं की रेट्रोवायरल पारगमन तंत्र उनके भेदभाव और फंक्शन को नियंत्रित करना

Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54698
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 1
1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

Summary

कई प्रायोगिक प्रणाली तंत्र एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में टी सेल के विकास और समारोह के विनियमन को समझने के लिए उपयोग किया गया है। यहाँ एक आनुवंशिक रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग कर दृष्टिकोण वर्णन किया गया है, जो आर्थिक, समय, कुशल, और नियामक रास्ते की पहचान करने में सबसे महत्वपूर्ण बात, अत्यधिक जानकारीपूर्ण है।

Protocol

सभी माउस काम इन प्रोटोकॉल में प्रदर्शन पशु वैज्ञानिक प्रक्रिया अधिनियम, ब्रिटेन पशु परियोजना लाइसेंस 70/6965 के तहत के अनुसार किया गया।

1. रेट्रोवायरल उत्पादन

आगे बढ़ने से पहले आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों और स्तनधारी कोशिकाओं में रेट्रोवायरस के उपयोग के उत्पादन के लिए सभी आवश्यक मंजूरी प्राप्त करते हैं।

  1. HEK 293T कोशिकाओं के विकास
    1. 10 सेमी टिशू कल्चर HEK 293T माध्यम में बर्तन पर HEK 293T कोशिकाओं को विकसित (पेनिसिलिन 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) (एफबीएस), 100 इकाइयों / एमएल, और 2 मिमी एल glutamine) । सामान्य सेल पारित होने के लिए, विभाजन कोशिकाओं 01:10 जब वे संगम मध्यम हटाने और ताजा HEK 293T माध्यम के साथ थाली से दूर कोशिकाओं pipetting द्वारा तक पहुँचने।
      नोट: प्रकोष्ठों 2-3 दिनों में संगम तक पहुंच जाना चाहिए। 293T HEK कोशिकाओं प्लेट इतनी trypsinization की आवश्यकता नहीं है के लिए शिथिल देते हैं।
    2. 24 घंटा अभिकर्मक के लिए पहले, एक conflue विभाजितएक 10 सेमी प्लेट (अभिकर्मक प्रति एक प्लेट) इतना है कि अगले दिन कोशिकाओं ~ 50% मिला हुआ हैं करने के लिए कोशिकाओं 1:10 के NT थाली।
  2. कैल्शियम फास्फेट तेज़ी से अभिकर्मक
    1. लगभग 1 घंटा अभिकर्मक के लिए पहले, कोशिकाओं से मध्यम हटाने और ध्यान से थाली से detaching कोशिकाओं को रोकने के लिए नए सिरे से HEK 293T माध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. 2x Hepes खारा बफर (2x एचबीएस) और एक ताजा 2.5 एम 2 CaCl के रूप में तालिका 1 में वर्णित समाधान तैयार है। डीएनए शेयरों गला लें। सबसे कुशल transfections के लिए प्लाज्मिड प्रस्तुत करने का गुणवत्ता के डीएनए का उपयोग करें।
    3. एक 6 मिलीलीटर दौर नीचे या 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब रेट्रोवायरल डीएनए (pMIG) 4 से 5 माइक्रोग्राम, सहायक वायरस डीएनए (पीसीएल-पारिस्थितिकी) 7 में से 5 माइक्रोग्राम, और एच 2 ओ को 420 μl जोड़ें। 500 μl के लिए अंतिम मात्रा लाने 2.5 एम 2 CaCl के 80 μl जोड़ें।
      नोट: यह अगले कदम (2x HBS के अलावा) के साथ-साथ सामान्य Ster के रूप में के रूप में लंबे समय से एक नियमित बेंच पर किया जा सकता हैइले तकनीक का इस्तेमाल किया जाता है।
    4. धीरे धीरे जबकि धीरे vortexing ताकि समाधान लगातार मिलाया जाता है और Capo 4 भी आकार क्रिस्टल में precipitates ऊपर डीएनए मिश्रण करने के लिए ड्रॉप द्वारा 2x HBS बूंद के 500 μl जोड़ें।
    5. एक टिशू कल्चर हुड के लिए स्थानांतरण और धीरे धीरे कोशिकाओं को कवर करते हुए लगातार और धीरे थाली घूमता माध्यम के 9 मिलीलीटर Capo 4 डीएनए मिश्रण (1 मिलीलीटर) dropwise जोड़ें। एक बार फिर से सावधान थाली से कोशिकाओं को अलग करने के लिए नहीं हो। कोशिकाओं इनक्यूबेटर में वापस जगह है।
      नोट: इस बिंदु पर Capo 4 वेग बैक्टीरिया के आकार के बारे में छोटे क्रिस्टल के रूप में एक खुर्दबीन के नीचे आसानी से देखा जा सकेगा। जब क्रिस्टल प्लेट के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए एक मौका मिला है ये आसानी से 30-60 मिनट के बाद देखा जाता है।
  3. संस्कृति supernatants में वायरस का संग्रह।
    1. दिन (अभिकर्मक के बाद 12-24 मानव संसाधन से कहीं भी) निम्न मध्यम हटाने और 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को खिलाने केताजा HEK 293T माध्यम की एक बार फिर से थाली से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा।
      नोट: यह लिम्फोसाइट निरोधात्मक पदार्थ है कि HEK 293T कोशिकाओं अभिकर्मक के दौरान माध्यम में छिपाना बाहर dilutes।
    2. दूसरे दिन (~ 24 घंटे बाद अभिकर्मक) की शाम में ताजा HEK 293T माध्यम की 3.5 मिलीग्राम के साथ कोशिकाओं को खिलाओ। सावधान रहना है कि प्लेट इनक्यूबेटर में बिल्कुल स्तर रख दिया गया है, इसलिए है कि एक तरफ सूखी छोड़ नहीं है।
    3. मध्यम लीजिए ~ 12 घंटा बाद में (4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर) और ताजा HEK 293T माध्यम की 3.5 मिलीलीटर के साथ खिलाओ। दोहराएँ संग्रह 2 गुना अधिक मोटे तौर पर 12 घंटे के अंतराल इतना है कि माध्यम के बारे में 10 मिलीलीटर एकत्र किया जाता है। यह वायरस स्टॉक है।
    4. 5 मिनट के लिए 600 XG पर centrifuging द्वारा किसी भी अवशिष्ट HEK 293T कोशिकाओं और सेलुलर मलबे से बाहर स्पिन। वैकल्पिक रूप से, एक 0.45 माइक्रोन, कम प्रोटीन बाध्यकारी, सिरिंज फिल्टर का उपयोग फिल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर वायरस, और सबसे अच्छा titers के लिए, एक या दो दिन के भीतर उपयोग के रूप में अनुमापांक धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस पर कम होगा। fr नहीं हैEeze, के रूप में यह काफी कम हो जाती है अनुमापांक।

2. प्राथमिक भोले सीडी 4 + टी कोशिकाओं का अलगाव

  1. ल्युकोसैट कोशिकाओं के अलगाव
    1. ग्रीवा अव्यवस्था, सीओ 2 asphyxiation, या अन्य मानवीय प्रोटोकॉल संस्था के जानवर से निपटने के नियमों के उचित द्वारा चूहों euthanize।
    2. हौसले से euthanized चूहों काटना और तिल्ली को दूर करने और वांछित लिम्फ नोड्स 15। एक 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर R10 मध्यम (10% गर्मी निष्क्रिय FBS, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, 0.1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, और 0.1% β-mercaptoethanol साथ RPMI मध्यम) युक्त थाली के कुओं में अंगों की जगह । संस्कृतियों में संदूषण की संभावना को कम करने के लिए चूहों और बाद के सभी जोड़तोड़ के विच्छेदन के लिए एक सेल संस्कृति हुड का प्रयोग करें।
      नोट: R10 मध्यम ठंडा रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी नीचे की ओर शुद्धि चरणों का प्रदर्शन।
    3. एक 70 माइक्रोन सेल संस्कृति झरनी एक 5 में रखें0 मिलीलीटर शंक्वाकार R10 माध्यम के लगभग 5 मिलीलीटर युक्त ट्यूब। अप करने के लिए तीन चूहों की तिल्ली और लिम्फ नोड्स के लिए एक झरनी का प्रयोग करें।
    4. सेल झरनी के लिए तिल्ली और लिम्फ नोड्स जोड़ें और एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार के अंत का उपयोग कर पानी में डालकर रखना। R10 मध्यम 1-2 मिलीलीटर के साथ कुल्ला।
    5. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और R10 के साथ 14 मिलीलीटर तक की मात्रा लाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र। इसे दूर डालने का कार्य एक स्वच्छ आंदोलन के साथ सेल गोली परेशान रोकने के द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. प्रत्येक ट्यूब ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) लाल सेल बफर (तालिका 1) के 2 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे 3.5 मिनट के लिए मिश्रण, बर्फ पर ट्यूब रखे हुए हैं।
      ध्यान दें: लाल सेल के समय लिम्फोसाइट की मौत को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, रेड सेल बफर के प्रत्येक बैच का सही समय अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
    7. R10 माध्यम की ≈12-13 मिलीलीटर जोड़ें। इसके तत्काल बाद सेंट्रीफ्यूज और कदम 2.1.5 के रूप में सतह पर तैरनेवाला त्यागें। अधिक बुद्धि 2x धोने चरणों का प्रदर्शनज R10 मध्यम कोशिकाओं से किसी भी अवशिष्ट लाल सेल बफर हटाने और लिम्फोसाइट की मौत से बचने के लिए।
    8. एक hemocytometer trypan नीले रंग में 01:20 गिराए व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज का निर्धारण करने में कोशिकाओं की गणना। माउस के अनुसार लगभग 8-10 10 x 7 कोशिकाओं की अपेक्षा करें।
  2. चुंबकीय मोती किट का उपयोग कर सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अलगाव सीडी 8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, एमएचसी वर्ग द्वितीय + और टेर-119 + कोशिकाओं को हटाने के लिए।
    1. अशेष कदम 8-10 10 x 7 कोशिकाओं 2.1.8 के अनुसार 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र। एक स्वच्छ आंदोलन के साथ सतह पर तैरनेवाला सेल गोली परेशान रोकने के लिए बंद कर डालो। निष्क्रिय FBS तो किट से एंटीबॉडी मिश्रण के 100 μl जोड़ने गर्मी के 100 μl में प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं Resuspend। एक रोलर पर कोमल मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. ऊपर कोशिकाओं incubating रहे हैं, माला तैयार।
      1. > 30 सेकंड के लिए vortexing द्वारा शीशी में Resuspend मोती तो एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब प्रति 8-10 10 x 7 तैयार कोशिकाओं मोतियों की 1 मिलीलीटर हस्तांतरण। मोतियों की मिलीलीटर प्रति R10 के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण।
      2. 1 मिनट के लिए चुंबक में ट्यूब रखें फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागें। R10 माध्यम के 4 मिलीलीटर में चुंबक और resuspend मोतियों से ट्यूब निकालें। मोतियों की यह राशि ऊष्मायन के दो दौर के लिए पर्याप्त है।
    3. ट्यूब प्रति R10 माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर एंटीबॉडी ऊष्मायन (चरण 2.2.1) के अंत में कोशिकाओं को धो लें। धीरे अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर ट्यूब और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के घूमता साथ मिश्रण। एक स्वच्छ आंदोलन के साथ सतह पर तैरनेवाला सेल गोली परेशान रोकने के लिए बंद कर डालो। R10 के माध्यम से 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
    4. कदम 2.2.2.2 एंटीबॉडी इलाज कोशिकाओं के प्रत्येक ट्यूब (प्रत्येक ट्यूब के लिए तैयार राशि आधा) से धोया मोती के 2 मिलीलीटर जोड़ें और एक प्रबंधक की भूमिका पर सौम्य मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेतेller।
    5. धीरे एक pipet एक संकीर्ण टिप खोलने से युक्त के साथ 5 बार pipetting द्वारा सेल मनका मिश्रण Resuspend। झाग से बचें। 2 मिनट के लिए मोती चुंबक में ट्यूब रखें तो एक नया ट्यूब नकारात्मक चयनित कक्षों युक्त सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण। इन कोशिकाओं के रूप में वे सीडी 4 + आबादी करते रहें।
    6. नकारात्मक चयन एक बार और दोहराएँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर कदम 2.2.5 से कोशिकाओं स्पिन। R10 के माध्यम से 1 मिलीलीटर में कदम 2.2.3 और resuspend में के रूप में सतह पर तैरनेवाला डालो। का पालन 2.2.4 और 2.2.5 फिर से कदम। अंतिम चुंबकीय मनका चयन के बाद, वसूली का निर्धारण करने के लिए (ठेठ पैदावार प्रति 10 8 ल्यूकोसाइट्स 15-20 x 10 6 कोशिकाओं) कर रहे हैं कोशिकाओं की गिनती।
  3. सेल जुदाई स्तंभों का उपयोग - भोले सीडी 4 + टी कोशिकाओं (और CD62L उच्च CD25) का अलगाव
    1. अपकेंद्रित्र सीडी 4+ टी के 150-200 μl में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर कोशिकाओं और resuspend10 8 कोशिकाओं प्रति R10 माध्यम। शेयर biotinylated CD25 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (क्लोन 7D4) के 2 μl जोड़ें। एक रोलर पर कोमल मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. सेल जुदाई स्तंभ बफर (तालिका 1) के 10 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र। जितना संभव हो उतना तैरनेवाला निकालें और बफर / कोशिकाओं शेष की मात्रा का अनुमान है। 10 7 कोशिकाओं के अनुसार लगभग 90 μl के अंतिम मात्रा को Resuspend।
    3. 10 7 कोशिकाओं प्रति streptavidin मोती के 20 μl जोड़ें और कोमल गेंद के साथ मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. कोशिकाओं incubating रहे हैं, मैनुअल दृष्टिकोण के लिए मध्यम सेल जुदाई (एमएस) कॉलम तैयार करते हैं। प्रत्येक एमएस स्तंभ 10 7 कोशिकाओं को बरकरार रखे हुए है, और के बाद से CD25 + कोशिकाओं आम तौर पर कुल सीडी 4 + कोशिकाओं के बारे में 10% का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्रति 10 8 सीडी 4+ टी कोशिकाओं 1 स्तंभ का उपयोग करें। स्तंभ के लिए सेल जुदाई स्तंभ बफर के 500 μl जोड़ेऔर के माध्यम से प्रवाह करते हैं। 2 बार दोहराएँ।
    5. सेल / मनका ऊष्मायन के अंत में, सेल जुदाई स्तंभ बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं धो लें। 10 8 कोशिकाओं प्रति सेल जुदाई स्तंभ बफर के 500 μl में कोशिकाओं resuspend, लेकिन अभी भी 500 μl का उपयोग करता है, तो वहाँ कम कोशिकाओं रहे हैं।
    6. स्तंभ के लिए सेल / मनका निलंबन के 500 μl लागू करें और के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा। स्तंभ 1 और अधिक समय के साथ इस दर्रे और एक बार फिर से के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा। स्तंभ कुल्ला सेल जुदाई स्तंभ बफर के 500 μl के साथ 3 बार, हर एकत्र कोशिकाओं को इन rinses से प्रवाह के माध्यम से जोड़ने। ये CD25 हैं - कोशिकाओं। कोशिकाओं की गणना उपज का निर्धारण।
    7. Tregs (CD25 + कोशिकाओं) वांछित हैं, इस प्रकार के रूप में अलग।
      1. विभाजक से स्तंभ निकालें और एक खुले यूनिवर्सल ट्यूब देखभाल के ऊपर इसे पकड़ बाँझपन बनाए रखने के लिए। जल्दी कर्नल पर सेल जुदाई बफर के 500 μl पिपेटUMN और मजबूती से सकारात्मक अंश बाहर निकलवाने, सवार स्तंभ के साथ आपूर्ति का उपयोग कर।
      2. निस्तब्धता प्रक्रिया 2 बार दोहराएँ। एक ताजा एमएस सेल जुदाई स्तंभ पर सकारात्मक अंश पास और इस प्रवाह के माध्यम से त्यागें। मजबूती से बाहर सकारात्मक कोशिकाओं में तीन बार, 600 XG पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस Resuspend कोशिकाओं पर R10 के माध्यम से 1 मिलीलीटर में फ्लश पहले और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं के रूप में और उपज का निर्धारण करने के लिए गिनती।
    8. CD62L उच्च टी कोशिकाओं, सेंट्रीफ्यूज CD25 - - ऊपर चरण 2.3.6 में 10 7 कोशिकाओं प्रति R10 माध्यम के 150-200 μl में 4 डिग्री और resuspend पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर पृथक टी कोशिकाओं CD25 प्राप्त करने के लिए। शेयर biotinylated CD62L मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 5 μl (क्लोन मेल- 14) जोड़ें और पहले के रूप में एक रोलर पर कोमल मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    9. धोने प्रदर्शन करते हैं, streptavidin बाध्यकारी मनका, और सेल जुदाई स्तंभ तैयारी के रूप में Treg अलगाव प्रोटोकॉल (2.3.7) के लिए वर्णन किया। इस समय का उपयोगबड़े सेल जुदाई (रास) स्तंभ है, जो 10 8 कोशिकाओं की क्षमता है।
      1. चूंकि CD62L उच्च टी कोशिकाओं को आमतौर पर CD25 के बारे में 60-70% का प्रतिनिधित्व करते - सेल, 1 10 8 लोकसभा कोशिकाओं प्रति सेल जुदाई स्तंभ का उपयोग करें। कदम 2.3.6 में वर्णित के रूप में लोकसभा सेल जुदाई स्तंभ के लिए सेल / मनका मिश्रण जोड़ें - इस समय अंतिम प्रवाह discarding के माध्यम से और स्तंभ rinses। CD25 + सेल वसूली के लिए कदम 2.3.7 में वर्णित के रूप CD62L उच्च टी कोशिकाओं को ले लीजिए।
      2. R10 के 1 मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस Resuspend कोशिकाओं पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और उपज का निर्धारण करने के लिए गिनती। R10 माध्यम में मिलीलीटर प्रति 6 कोशिकाओं 0.75-1 X10 को पतला।
  4. फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटनी (FACS) द्वारा कोशिकाओं की पवित्रता का विश्लेषण।
    1. FACS धुंधला रणनीति
      1. कोशिकाओं पूर्व और अलगाव के सभी चरणों, सीडी 4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 साथ दाग (सहायक और साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं) पोस्ट, और MHCI के लिएमैं पीई (एमएचसी वर्ग द्वितीय व्यक्त कोशिकाओं)।
      2. कोशिकाओं से पहले और के लिए CD25 अलगाव, सीडी 4 FITC और CD25 पीई (अन्य सहायक टी कोशिकाओं की तुलना में Tregs) के साथ दाग के बाद।
      3. सीडी 4-FITC, CD62L पीई और CD44 एपीसी (बनाम स्मृति और प्रेरक सहायक टी कोशिकाओं भोले) के साथ पूर्व कोशिकाओं और पोस्ट CD62L अलगाव दाग के लिए।
    2. प्रत्येक विश्लेषण जगह के लिए एक 96 अच्छी तरह से यू-नीचे की थाली के एक कुएं में 10 5 कोशिकाओं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र। मध्यम डालो और 200 μl DPBS के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। अपकेंद्रित्र के रूप में ऊपर और DPBS टपकना।
    3. अच्छी तरह से प्रति DPBS के 50 μl और प्रत्येक एंटीबॉडी (2.4.1 में संकेत के रूप में) के 0.5 μl फ्लोरोसेंट लेबल के विरंजन से बचने के लिए अंधेरे में 30 मिनट के लिए आरटी पर जोड़ें और सेते हैं।
    4. धो कोशिकाओं 2.4.2 के रूप में DPBS के साथ 2x और तुरंत प्रोटोकॉल और दिशा निर्देशों के हाथ में साधन के लिए विशिष्ट का उपयोग कर एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण।
      ध्यान दें: एक अच्छी तैयारी के अंतिम अलगाव कदम के बाद, कोशिकाओं के 90-95% होगाCD62L उच्च टी कोशिकाओं - सीडी 4 + CD25 हो।

3. सक्रिय सीडी 4+ टी कोशिकाओं की रेट्रोवायरल transduction और विशेष टी हेल्पर सबसेट में उनके भेदभाव

  1. रेट्रोवायरल transduction
    नोट: रेट्रोवायरल एकीकरण और जीनों की अभिव्यक्ति कोशिका विभाजन की आवश्यकता है। इसलिए, टी कोशिकाओं को सक्रिय किया जाना चाहिए हे / एन।
    1. भोले टी कोशिकाओं को अलग-थलग रहते हुए, कोट विरोधी CD3 और DPBS में पतला विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट। अच्छी तरह से प्रति 250 μl जोड़ें। 1μg / मिलीलीटर में विरोधी विरोधी CD3 का प्रयोग करें। 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में विरोधी CD28 का उपयोग कोशिकाओं अंततः Th0, Th1, Th2 और iTregs की शर्तों के तहत भेदभाव किया जा जाएगा। Th9 और Th17 स्थितियों के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल पर विरोधी CD28 का प्रयोग करें। एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 2 घंटा।
    2. बस संवर्धन कोशिकाओं से पहले, एंटीबॉडी समाधान निकालें और अच्छी तरह से प्रति DPBS unbou को दूर करने के ~ 250 μl के साथ थाली धोनेएन डी एंटीबॉडी। सावधान प्लेट बाहर सूखी तो एक समय में 6 कुओं की एक अधिकतम की प्रक्रिया बताने के लिए नहीं हो सकता है। DPBS धोने निकालें और मिलीलीटर प्रति 0.75-1 x 10 6 कोशिकाओं पर R10 माध्यम में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं हे / एन (14-16 घंटा) को सक्रिय करें।
    3. अगले दिन, सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 900 XG पर थाली में 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं कुओं की तह तक कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए।
    4. लीजिए और मध्यम कोशिकाओं को विस्थापित करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा बचाने के लिए, और वायरस उत्पादन प्रोटोकॉल से तैयार किया 1 मिलीलीटर वायरस संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के साथ बदलें। कोशिकाओं के बाहर सूखी तो एक समय में 4 कुओं की एक अधिकतम पर कार्रवाई की अनुमति न दें।
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से वायरस तेज सहायता और निम्नलिखित centrifugation के दौरान परिवेश सीओ 2 में महत्वपूर्ण alkalization को रोकने के लिए 8 मिलीग्राम / एमएल polybrene के 1 μl और 1M HEPES पीएच 7.5 के 10 μl जोड़ें। 30 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 900 XG पर थाली में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र
  2. Speci में कोशिकाओं के भेदभावएफआईसी उपसमुच्चय
    1. ध्यान से वायरस संस्कृति सतह पर तैरनेवाला हटाने और, कदम 3.1.4 में ऊपर एकत्र माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ की जगह के रूप में यह आईएल -2 और अन्य टी सेल के विकास के कारकों में शामिल है। 3-4 दिनों के लिए 2 टेबल और संस्कृति कोशिकाओं में संकेत विशिष्ट सबसेट में कोशिकाओं को अलग करने के लिए अभिकर्मकों जोड़ें।
  3. प्रकोष्ठों के विश्लेषण
    1. साइटोकिन्स के intracellular धुंधला के लिए, phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) में से प्रत्येक / एमएल 1 ग्राम के साथ कोशिकाओं को इलाज के लिए और 4 घंटे के लिए ionomycin। उत्तेजना के अंतिम 2 घंटे के दौरान, 1 माइक्रोग्राम / brefeldin ए की मिलीलीटर जोड़ने
    2. ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे से कोशिकाओं Resuspend। निर्धारण और धुंधला के लिए (ध कोशिकाओं की संस्कृति के 1 मिलीलीटर से आमतौर पर 100 μl) एक साथ 96 यू नीचे की थाली करने के लिए लगभग 10 5 कोशिकाओं स्थानांतरण।
    3. GFP धुंधला के लिए, वास्तव में 5 मिनट के लिए आरटी पर 2% paraformaldehyde के 100 μl के साथ कोशिकाओं को ठीक करने के लिए एक लंबी ऊष्मायन समय GFP एक ब्लीच जाएगा के रूप मेंएन डी Foxp3 धुंधला के साथ हस्तक्षेप। DPBS के 100 μl प्रत्येक के लिए 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 600 XG पर अच्छी तरह से और सेंट्रीफ्यूज जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। सतह पर तैरनेवाला डालो।
      सावधानी: Paraformaldehyde विषैला होता है। त्वचा और आंखों की सुरक्षा के साथ एक धूआं हुड में इसे संभाल।
    4. कोशिकाओं को फिर से 100 μl 1x निर्धारण बफर Foxp3 धुंधला किट (मंदक के 3 संस्करणों के निर्धारण बफर के 1 मात्रा) से बनाया का उपयोग कर ठीक करें। आरटी पर 45 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं या वैकल्पिक रूप से 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. निर्धारण के बाद, एक ही किट से permeabilization बफर के 100 μl जोड़कर कोशिकाओं permeabilize। 30-45 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं तो 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 600 XG पर अपकेंद्रित्र।
    6. एंटीबॉडी धुंधला के लिए, निर्धारण / permeabilization बफर हटाने और ताजा permeabilization बफर के 50 μl जोड़ें। नमूना प्रति 0.5 50 प्रति μl μl बफर पर permeabilization बफर में पतला आवश्यक एंटीबॉडी जोड़ें। अंधेरे में आरटी पर 30-45 मिनट के लिए सेते फ्लू के विरंजन से बचने के लिएorescent लेबल।
    7. 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 600 XG पर 150 μl permeabilization बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। permeabilization बफर त्यागें और 200 μl DPBS जोड़ें। प्रोटोकॉल और दिशा निर्देशों के हाथ में साधन के लिए विशिष्ट का उपयोग कर एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण।
      नोट: इस तरह के आदि निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना, गैर सक्रिय या Th0 सक्रिय कोशिकाओं का विश्लेषण, के रूप में साइटोकाइन धुंधला के लिए उचित नियंत्रण शामिल करना न भूलें

Representative Results

इस प्रायोगिक प्रणाली की सफलता के टी कोशिकाओं अनुमापांक और उच्च रेट्रोवायरस तैयारियों की अत्यधिक शुद्ध आबादी की आवश्यकता है। प्रतिनिधि परिणाम सफल प्रयोगों के उदाहरण के रूप में यहाँ दिखाया गया है। चित्रा 1 भोले सहायक टी सेल अलगाव प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में पूर्व और बाद में चयनित आबादी के विशिष्ट पवित्रता से पता चलता है। चित्रा 2 और 3 GFP अभिव्यक्ति के माध्यम से रेट्रोवायरस उत्पादन के विश्लेषण के उदाहरण देकर स्पष्ट करना ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293T कोशिकाओं में (चित्रा 2) और transduced टी कोशिकाओं (चित्रा 3)। HEK 293T कोशिकाओं के अभिकर्मक क्षमता अलग रेट्रोवायरल निर्माणों के साथ काफी भिन्न हो सकते हैं, लेकिन इस बार GFP + टी कोशिकाओं की संख्या के साथ मनाया रेट्रोवायरस उत्पादन के स्तर के साथ संबंध स्थापित नहीं करता। इसके अलावा, GFP + टी कोशिकाओं की संख्या ध्रुवीकरण की स्थिति के आधार पर भिन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, मीGFP के EAN अभिव्यक्ति के स्तर पर और डाला जीन एकीकृत वायरस प्रतियों की संख्या के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, प्रतिलेखन पर एकीकरण साइट का प्रभाव है, और बाद विनियामक वायरल प्रतिलेख प्रभावित करने वाले तंत्र।

अंत में, चित्रा 4 कुछ खास परिणाम हम सहायक टी सेल भेदभाव के साथ मनाया है जब miRNAs मीर 15B / 16 overexpressed दिखाता है। इन परिणामों के परिवर्तनशीलता है कि एक व्यक्ति प्रयोग तो सच प्रभाव सहायक टी कोशिकाओं के विभिन्न तैयारियों का उपयोग कर कई दोहराने प्रयोगों के सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा प्रमाणित किया जाना चाहिए के भीतर हो सकता है कुछ दिखा। इन प्रयोगों में Th2 प्रतिक्रियाओं का यहां इस्तेमाल किया क्योंकि वे Th1 प्रतिक्रियाओं से ग्रस्त हैं C57BL / 6 लाइन में निरीक्षण करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसी तरह, आईएल 9 धुंधला पृष्ठभूमि के ऊपर का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसलिए, यह निर्धारण नियंत्रण करते हैं और सही गा सुनिश्चित करने के लिए उचित मुआवजे की स्थापना के लिए आवश्यक हैसाइटोकाइन अभिव्यक्ति की टिंग। हमारे परिणामों में हमने पाया है कि मीर-15B / 16 mTOR घटकों Rictor और mTOR 15 की अभिव्यक्ति को दबाने के माध्यम से मार्ग संकेत बाधा iTreg प्रेरण को बढ़ाता है। मीर 15B / 16 कभी कभी अलग-अलग प्रयोगों में Th0, Th1, और Th17 भेदभाव को प्रभावित कर सकते हैं, लेकिन वहाँ कोई महत्वपूर्ण प्रभाव जब कई दोहराने प्रयोगों में जांच की है। इसके विपरीत मीर 15B / 16 overexpression काफी Th9 भेदभाव (संदर्भ 18 देखें) को दबाने करता है।

आकृति 1
चित्रा अलगाव के हर चरण में सहायक टी कोशिकाओं की 1. ठेठ पवित्रता। संकेत दिया एंटीजन के परिणामों cytometry प्रतिनिधि प्रवाह आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) भूखंडों में नामित जीवित कोशिकाओं के गेट से दिखाए जाते हैं। (ए) पूर्व और बाद में सीडी 4 नकारात्मक चयन। सीडी 4 की अभिव्यक्ति प्रोफाइल,CD8a, और MHCII दिखाए जाते हैं। इन सहायक टी कोशिकाओं का संवर्धन और साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं के नुकसान और MHC वर्ग द्वितीय व्यक्त कोशिकाओं को दर्शाते हैं। एक अच्छा शुद्धि ~ इस चरण में 90% सीडी 4+ टी कोशिकाओं में परिणाम चाहिए। (बी) CD25 चयन। बाईं तरफ सीडी 4, CD8a, और MHCII की अभिव्यक्ति प्रोफाइल हैं, और सही पर सीडी 4 कर रहे हैं और CD25 अभिव्यक्ति से पहले और बाद चयन प्रोफाइल। इस बिंदु> 95 CD25 नकारात्मक चयनित कक्षों की% से कम सीडी 4 + CD25 होना चाहिए -। (सी) CD62L चयन। सीडी 4, CD8a, और MHCII अभिव्यक्ति प्रोफाइल छोड़ दिया पर दिखाए जाते हैं। सही पर CD62L और CD44 के लिए अभिव्यक्ति प्रोफाइल पोस्ट चयनित कक्षों की सीडी 4 और CD62L अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ-साथ पूर्व और बाद CD62L चयनित कक्षों के लिए दिखाए जाते हैं। CD62L चयन के बाद लगभग सभी स्मृति कोशिकाओं (CD44 +) भोले सहायक टी कोशिकाओं 10-15% प्रेरक कोशिकाओं (CD62L कम) शामिल हैं इस बात का एक अत्यधिक समृद्ध आबादी छोड़ने हटा रहे हैं। सबके लिएFACS प्रोफाइल, बराबर सेटिंग्स और एक विशिष्ट पैरामीटर के लिए तराजू भर में बनाए रखा गया। नंबर एक gated आबादी के भीतर कोशिकाओं का प्रतिशत प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रारंभिक चयन के बाद कोशिकाओं के आकार में मामूली कमी शायद प्रोटोकॉल के दौरान यांत्रिक तनाव के कारण है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. रेट्रोवायरस ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293T कोशिकाओं का विश्लेषण। GFP अभिव्यक्ति HEK 293T कोशिकाओं है कि या तो untransfected या ट्रांसफ़ेक्ट और वायरल संस्कृति supernatants के संग्रह के बाद विश्लेषण किया गया में दिखाया गया है। GFP विश्लेषण पहली पैनल में एफएससी पर फाटक और एसएससी साजिश से जीवित कोशिकाओं पर किया गया था। नंबर gated क्षेत्र के भीतर GFP + कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। ठेठ टीransfection क्षमता 30-90% के बीच सीमा होती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. रेट्रोवायरस transduced सहायक टी कोशिकाओं का विश्लेषण। GFP अभिव्यक्ति तीन दिनों के लिए Treg ध्रुवीकरण की स्थिति Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 में भेदभाव के बाद रेट्रोवायरल-transduced सहायक टी कोशिकाओं में दिखाया गया है, और। विश्लेषण एफएससी / एसएससी पैनल में संकेत रहते हैं और सक्रिय कोशिकाओं पर gated था। पारगमन क्षमता निर्माण और ध्रुवीकरण की स्थिति पर निर्भर करता है 10-75% के बीच भिन्न हो सकते हैं। इसी तरह, GFP अभिव्यक्ति का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता बदलती हैं। सकते हैं यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।


चित्रा 4. मीर 15B का प्रभाव / अलग ध्रुवीकरण की स्थिति में सहायक टी सेल भेदभाव पर 16 overexpression। साइटोकाइन प्रतिनिधि प्रोफाइल + GFP चित्रा 3 से कोशिकाओं की आबादी पर दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1:। इन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बफ़र कृपया यहां एक एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में इस तालिका डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।

सहायकटी सेल ध्रुवीकरण की स्थिति
Th0 विरोधी आईएल 4 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
विरोधी IFN-γ 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
Th1 पुनः संयोजक आईएल -12 20 एनजी / एमएल
विरोधी आईएल 4 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
Th2 पुनः संयोजक आईएल 4 40 एनजी / एमएल
विरोधी IFN-γ 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
Th9 पुनः संयोजक TGF-β 2.5 एनजी / एमएल
पुनः संयोजक आईएल 4 40 एनजी / एमएल
विरोधी IFN-γ 10 माइक्रोग्राम / एमएल
Th17 पुनः संयोजक TGF-β 2.5 एनजी / एमएल
पुनः संयोजक आईएल -6 50 एनजी / एमएल
विरोधी IFN-γ 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
विरोधी आईएल 4 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
विरोधी आईएल -2 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
Tregs पुनः संयोजक TGF-β 2.5 एनजी / एमएल
पुनः संयोजक आईएल -2 5 एनजी / एमएल

तालिका 2: हेल्पर टी सेल सबसेट ध्रुवीकरण की स्थिति।

Discussion

के रूप में उनके विकास और समारोह अक्सर प्रमुख नियामकों की अभिव्यक्ति के स्तर से निर्धारित होता है जीन की रेट्रोवायरल मध्यस्थता overexpression, सहायक टी कोशिकाओं में समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। लेकिन, परिणाम की व्याख्या सतर्क क्योंकि काफी अंतर्जात जीन के उन लोगों के ऊपर अभिव्यक्ति के स्तर में कई कलाकृतियों को पेश कर सकते हैं की आवश्यकता है। इसलिए, इस तकनीक समारोह की प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए अन्य लोगों के साथ जोड़ा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, overexpression siRNAs या जीन नॉकआउट का उपयोग कर यदि उपलब्ध कम अभिव्यक्ति से पूरित किया जाना चाहिए। MiRNAs के साथ, हम वायरस है कि कृत्रिम miRNA को लक्षित साइटों है कि एक miRNA 15 के लिए के रूप में प्रतिस्पर्धी अवरोधकों काम किया overexpressed का उपयोग करके अवरुद्ध करने में उन लोगों के साथ overexpression प्रयोगों पूरित। रेट्रोवायरल transduced कोशिकाओं को भी जैव रासायनिक शाही सेना और प्रोटीन विश्लेषण शामिल assays में उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, इन प्रयोगों की एक प्रमुख सीमा पारगमन संसाधन और अन्य विभागों की दक्षता हैट्रांसड्यूस और untransduced कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में ulting। इसलिए, इन assays सबसे अधिक संभावना + GFP आबादी की छंटाई की आवश्यकता होगी। अंत में, इन विट्रो भेदभाव assays में विवो प्रयोगों के साथ जोड़ा जाना चाहिए, और एक तरह से यह प्राप्त किया जा सकता adoptively चूहों में transduced टी कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए और उनके भेदभाव और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर उनके प्रभाव पालन कर रहा है।

इस प्रणाली के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक आरएनए जीनोम कि रेट्रोवायरल capsid में पैक किया जा सकता है के आकार है। हमारे अनुभव में, यह अच्छा वायरस उत्पादन देता मिग रेट्रोवायरल प्रणाली के लिए अधिकतम डालने आकार 3-3.5 KB है। इसलिए, बड़ा जीन, इस प्रणाली के साथ विश्लेषण नहीं किया जा सकता क्योंकि वे गरीब वायरस titers दे। हालांकि, ज्यादातर जीनों इस आकार की तुलना में छोटे होते हैं इसलिए इस प्रणाली के जीन के अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए उपयोगी है।

रेट्रोवायरल पारगमन, इन protoco के भीतर कई विकल्पों के साथरास इस्तेमाल किया गया है। कई शोधकर्ताओं पैकेजिंग सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक रेट्रोवायरल जीन (उदाहरण के लिए संदर्भित 16) को व्यक्त कि उपयोग किया है। हालांकि, हम पीसीएल-पारिस्थितिकी सहायक वायरस वेक्टर के सह अभिकर्मक के साथ मानक HEK 293T कोशिकाओं का उपयोग उच्चतम titers प्राप्त किया है। भोले सहायक टी कोशिकाओं के अलगाव भी सेल चुंबकीय मनका और सेल जुदाई स्तंभ प्रोटोकॉल के बजाय छँटाई के माध्यम से हासिल किया जा सकता है, लेकिन यह एक सेल सॉर्टर के लिए उपयोग की आवश्यकता है, और तरह समय के लिए लागत आम तौर पर मनका अभिकर्मकों की तुलना में अधिक है। अंत में, वहाँ विभिन्न सबसेट में सहायक टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल सक्रियण की स्थिति पर बदलाव कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, बहुत देर के लिए कोशिकाओं की TCR उत्तेजना Treg उत्प्रेरण की स्थिति के लिए जोखिम से पहले उनके प्रेरण 16 को बाधित कर सकते हैं। यह एक समस्या हो सकती है क्योंकि रेट्रोवायरल अभिव्यक्ति कोशिका विभाजन कोशिकाओं की उत्तेजना से प्रेरित आवश्यकता है। फिर भी, हम हे / एन activ के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग कुशल Treg प्रेरण पाया हैव्यावहारिक रेट्रोवायरल पारगमन से पहले।

इन प्रोटोकॉल के भीतर, सफल आवेदन कई कारकों की आवश्यकता है। उच्च अनुमापांक रेट्रोवायरस तैयारियों HEK 293T कोशिकाओं तो उच्च गुणवत्ता डीएनए और ठीक तैयार 2x HBS के कुशल अभिकर्मक की जरूरत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, HEK 293T कोशिकाओं के घनत्व सेल अभिकर्मक के बिंदु पर लगभग 50% होने की जरूरत है क्योंकि ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए की अच्छी अभिव्यक्ति की आवश्यकता है कि कोशिकाओं को सक्रिय रूप से बढ़ रहे हैं, और इस हिचकते होगा यदि कोशिकाओं को भी विरल या घने हैं। अभिकर्मक के दौरान इष्टतम घनत्व में कोशिकाओं को वायरस संग्रह चरणों के दौरान कुछ बिंदु पर संगम तक पहुंच जाना चाहिए, लेकिन वे पिछले संग्रह करने के लिए सभी तरह के माध्यम से उच्च अनुमापांक वायरस शेयरों का निर्माण जारी रहेगा। सहायक टी कोशिकाओं के कुशल भेदभाव अच्छा सेल गुणवत्ता इतनी है कि यह सुनिश्चित अलग कक्षों पवित्रता चित्रा 1 में सचित्र कर रहे हैं की आवश्यकता है। इसी तरह, कोशिकाओं की गुणवत्ता चूहों fr पर निर्भर हैओम जो वे अलग थे। इन अध्ययनों के लिए, हम 6-8 सप्ताह पुरानी C57BL / 6 चूहों का इस्तेमाल किया है। बड़े चूहों कम भोले कोशिकाओं हो सकता है, और अन्य नस्लों उनके भेदभाव में अलग हो सकता है। उदाहरण के लिए, BALB / ग चूहों अधिक C57BL / 6 चूहों 17 से Th2 प्रतिक्रियाओं होने का खतरा जैसा कि ऊपर कहा गया है C57BL 6 / टी कोशिकाओं एक Th2 प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, भेदभाव शर्तों के किसी भी प्रयोगशाला में प्रयोगशाला से थोड़ा भिन्न हो सकते हैं, और जीन overexpression का प्रभाव केवल उप इष्टतम परिस्थितियों में स्पष्ट हो सकता है तो विभिन्न ध्रुवीकरण की स्थिति में साइटोकाइन सांद्रता titrated होना पड़ सकता है। अंत में, सेल प्रसार पर overexpressed जीन का प्रभाव या ध्रुवीकरण की स्थिति पारगमन दक्षता इसलिए ब्याज की जीन के प्रभाव को मापने के समय और ध्रुवीकरण अभिकर्मकों की एकाग्रता के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती प्रभावित कर सकते हैं। इन सभी कारकों का अनुकूलन इस प्रणाली के साथ जानकारीपूर्ण परिणाम के लिए नेतृत्व करना चाहिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
DMEM Sigma D5671
Penicillin Streptomycin solution Sigma P4333
L-Glutamine Sigma G7513
β-mercaptoethanol Sigma M3148
DPBS Sigma D8537
MIG vector Addgene Plasmid 9094
pCL-Eco vector Addgene Plasmid 12371
Cell strainer BD Falcon 352350
Magnetic beads mouse CD4 cell kit  Invitrogen (Dynabeads) 11415D
Streptavidin Beads  Miltenyi Biotech 130-048-102
MS cell separation columns Miltenyi Biotech 130-042-201
LS cell separation columns Miltenyi Biotech 130-042-401
CD25 Biotenylated MAb  BD Biosciences 85059 clone 7D4
CD62L Biotenylated MAb  BD Biosciences 553149 clone MEL-14
Polybrene (Hexadimethrine Bromide) Sigma 107689
Anti-CD3 eBiosciences 16-0031-85 clone 145-2C11 
Anti-CD28 eBiosciences 16-0281-85 clone 37.51 
Anti-IL-4 BD Biosciences 559062 clone 11B11
Anti-IFN-gamma BD Biosciences 559065 clone XMG1.2
Anti-IL-2 BD Biosciences 554425 cloneJES6-5H4
Recombinant IL-12 p70 eBiosciences 14-8121
Recombinant IL-4 BD Biosciences 550067
Recombinant TGF-beta eBiosciences 14-8342-62
Recombinant IL-6 eBiosciences 14-8061
Recombinant IL-2 eBiosciences 14-8021
PMA  Sigma P8139
Ionomycin Sigma I0634
Brefeldin A eBiosciences 00-4506
Paraformaldehyde Sigma 16005 Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling 
Foxp3 staining buffer set eBiosciences 00-5523
Anti-CD4  FITC eBiosciences 11-0041 clone GK1.5 
Anti-CD8a perCP-cy5.5 eBiosciences 45-0081-80 clone 53-6.7 
Anti-MHCII PE eBiosciences 12-0920  clone HIS19
Anti-CD25 PE eBiosciences 12-0251-82  clone PC61.5 
Anti-CD62L PE eBiosciences 12-0621-82 clone MEL-14 
Anti-CD44 APC eBiosciences 17-0441 clone IM7 
Anti-IFN-gamma FITC  eBiosciences 11-7311-81 clone XMG1.2
Anti-IL-4 PE BD Biosciences 554435 clone 11B11
Anti-IL-9 PE or APC eBiosciences/Biolegend 50-8091-82/514104 clone RM9A4
Anti-IL-17a PE BD Biosciences 559502 clone TC11-18H10
Anti-Foxp3  APC or PE eBiosciences 17-5773-82/12-5773-80  clone FJK-16s
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
Na2HPO4-2H2O Sigma 71643
Dextrose/Glucose Sigma G7021
HEPES, free acid Sigma H3375
NH4Cl Sigma A9434
Disodium EDTA Sigma D2900000
KHCO3 Sigma 237205
 CaCl2  Sigma C5670

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 117 रेट्रोवायरल पारगमन प्राथमिक murine टी कोशिकाओं सहायक टी सेल अलगाव सहायक टी सेल भेदभाव प्रवाह cytometry microRNAs
एक आनुवंशिक दृष्टिकोण के रूप में अध्ययन करने के लिए सहायक टी कोशिकाओं की रेट्रोवायरल पारगमन तंत्र उनके भेदभाव और फंक्शन को नियंत्रित करना
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Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. J. Vis. Exp. (117), e54698, doi:10.3791/54698 (2016).

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