Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

باستخدام الحمض النووي الريبي لكشف التسلسل رواية لصق المتغيرات ذات الصلة لمقاومة المخدرات في Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54714
Automatic Translation
1,2,3, 1, 4, 3, 5, 6, 1,7, *1, *3,8,9
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano
* These authors contributed equally

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول يهدف إلى التعرف على تأثير الربط الشاذة على مقاومة الأدوية في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتحليل الشخصية transcriptomic نماذج الوالدين والمقاومة في المختبر من خلال الحمض النووي الريبي يليها، وأنشأ طريقة تقوم QRT-PCR للتحقق من صحة الجينات المرشحة.

Abstract

تبقى مقاومة المخدرات مشكلة رئيسية في علاج السرطان لكلا الأورام الخبيثة الدموية والأورام الصلبة. يمكن أن يكون سبب المقاومة الذاتية أو التي حصل عليها مجموعة من الآليات، بما في ذلك زيادة القضاء على المخدرات، وانخفاض امتصاص الدواء، تعطيل المخدرات والتعديلات أهداف المخدرات. وأظهرت بيانات حديثة أن بخلاف المعروفة الجيني (الطفرة، والتضخيم) وجينية (hypermethylation الحمض النووي، هيستون في مرحلة ما بعد متعدية التعديل) التعديلات، وآليات المقاومة للعقاقير ويمكن أيضا أن ينظم الانحرافات الربط. هذا هو المجال المتنامي بسرعة التحقيق التي تستحق الاهتمام في المستقبل من أجل تخطيط مناهج علاجية أكثر فعالية. ويهدف البروتوكول وصفها في هذه الورقة إلى التعرف على تأثير الربط الشاذة على مقاومة الأدوية في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتحليل الشخصية transcriptomic من عدة نماذج في المختبر من خلال الحمض النووي الريبي يليها وإقامةإد QRT-PCR الأسلوب القائم على التحقق من صحة الجينات المرشحة. على وجه الخصوص، قمنا بتقييم الربط التفاضلية من DDX5 وPKM النصوص. تم التحقق من صحة الربط الشاذة الكشف عنها بواسطة أداة الحسابية الحصير في خلايا اللوكيميا، وتبين أن يتم التعبير عن مختلف المتغيرات DDX5 لصق في الخلايا المقاومة مقابل الدية. في هذه الخلايا، ونحن أيضا لاحظ أعلى PKM2 / نسبة PKM1، الذي لم يتم الكشف في Panc-1 نظيره مقاومة للجيمسيتابين مقارنة الأبوية خلايا Panc-1، مما يشير إلى آلية مختلفة من المخدرات المقاومة الناجمة عن التعرض جيمسيتابين.

Introduction

وعلى الرغم من التقدم الكبير في علاج السرطان، ومقاومة للخلايا الخبيثة للعلاج الكيميائي، إما ذاتية أو مكتسبة عند التعرض المخدرات لفترات طويلة، هو السبب الرئيسي لفشل العلاج في مجموعة واسعة من سرطان الدم والأورام الصلبة 1.

من أجل ترسيم الآليات الكامنة وراء مقاومة الجراثيم للأدوية، في نماذج خط الخلية في المختبر يتم تطويرها من قبل مجموعة متدرجة من الخلايا السرطانية مقاومة للعوامل العلاج الكيميائي. هذا الإجراء يحاكي الأنظمة المستخدمة في المرافق الصحية، وبالتالي يسمح في عمق التحقيق في آليات مقاومة ذات الصلة. الخلايا المقاومة التي تنجو من العلاج ثم يتم تمييزها عن الخلايا الحساسة الوالدين باستخدام المقايسات بقاء الخلية / السمية الخلوية 2. في التشكيلات المقاومة للأدوية في المختبر من خلايا أولية وقد ثبت أن تكون مرتبطة إلى حد كبير في استجابة سريرية للعلاج الكيميائي 3.

الإنتاجية العالية cytotoتشكل المقايسات xicity طريقة ملائمة لتحديد حساسية المخدرات في المختبر. هنا، يتم تقييم الجدوى من الخلايا على سبيل المثال 3- [4،5-dimethylthiazol-2-YL] -2،5-ثنائي بروميد نتروبلو - الإنتقالي العسكري فحص 4، والتي تقوم على تحويل التمثيل الغذائي لبعض ركائز (أي، أملاح نتروبلو) إلى منتجات الملونة، مما يعكس النشاط الميتوكوندريا من الخلايا. بدلا من ذلك، ومحتوى البروتين من الخلايا يمكن أن يكون كميا باستخدام فحص sulforhodamine ب (SRB) 5. هنا، وعدد من خلايا قابلة للحياة يتناسب مع الكثافة الضوئية (OD) قياس في الطول الموجي المناسب في معمل، ولا حاجة ل واسعة النطاق وإجراءات عد الخلايا تستغرق وقتا طويلا. ويمكن حساب تثبيط نمو الناجمة عن معينة المخدرات العلاج الكيميائي على أساس OD من الآبار التي تم علاج الخلايا مع وكيل اختبار ومقارنة مع OD من الخلايا السيطرة غير المعالجة. منحنى الاستجابة للجرعة هو obtaINED بالتآمر تركيز الدواء مقابل نسبة من خلايا قابلة للحياة النسبية للسيطرة على الخلايا. وأخيرا، يمكن الإبلاغ عن حساسية العقاقير مثل التركيز الذي يؤدي إلى 50٪ من تثبيط نمو الخلايا بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة (IC 50).

وتشمل الآليات الكامنة وراء مقاومة الجراثيم للأدوية العديد من تشوهات مختلفة، مثل التغيرات التي تؤثر على التعبير الجيني من محددات النشاط المخدرات والأيض الخلوي. هذه الآفات الجزيئية، بما في ذلك الطفرات، وانحرافات في النسخي ومرحلة ما بعد النسخي وكذلك تنظيم جينية منزعجة كثيرا ما تؤثر على الجينات المسؤولة سواء في استقلاب الدواء أو موت الخلايا المبرمج 6.

وقد تلقى البديل قبل الربط مرنا وتنظيمه معقدة في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا ككيان الرواية التي قد تملي مقاومة المخدرات من الخلايا السرطانية 7. ما يصل الى 95٪ من الجينات البشرية وتقسم بدلا من ذلك في الخلايا الطبيعية عن طريق هذابإحكام عملية التنظيم التي تنتج العديد من الأشكال الإسوية بروتين مختلفة من نفس الجين. وغالبا ما حررت الربط البديلة في السرطان وتتميز العديد من الأورام عن طريق الربط غيرت من عدد متزايد من الجينات المسؤولة عن استقلاب الدواء (أي كيناز deoxycytidine، مخلقة folylpolyglutamate، أو البروتينات المقاومة للأدوية المتعددة) 6،8. ومع ذلك، تحليلا شاملا لمحات الربط من خلايا مقاومة للأدوية غير متوفرة بشكل مؤلم. لذلك، لا بد من تطوير أساليب إنتاجية عالية للتحليل الربط البديلة. هذا يمكن أن يساعد في تطوير أساليب علاجية أكثر فعالية.

خلال العقد الماضي، والتطور السريع لتقنيات الجيل القادم التسلسل (خ ع) قد أثرت البحوث الطبية الحيوية مع رؤى جديدة في الآليات الجزيئية التي تحكم تنظيم التعبير الجينوم ودورها في مختلف العمليات البيولوجية 9. RNA التسلسل (RNA وما يليها) يعد مصدرا قويا لتطبيق الفرعيةمن خ ع في مجال transcriptomics. لأنها تتيح التنميط على نطاق الجينوم (كما ونوعا) من أنماط التعبير الآلاف من الجينات في وقت واحد ومناسب تماما لتوصيف من mRNAs الترميز جديدة وطويلة الحمض النووي الريبي غير الترميز، ميرنا، سيرنا، وغيرها من الحمض النووي الريبي الصغيرة فصول (على سبيل المثال، snRNA وبيرنا) 10،11.

RNA تسلسل لديه العديد من المزايا أكثر من التقنيات السابقة لتوصيف Transcriptome على (على سبيل المثال، سانجر تسلسل وميكروأرس التعبير). وهو لا يقوم على الشرح الجينوم الحاليين، أن لديها مستوى النووية المنفردة القرار ولها مجموعة ديناميكية أوسع لتقدير مستوى التعبير. لفترة وجيزة، وسير العمل التجريبي الأساسي من التجارب الحمض النووي الريبي وما يليها يتكون من نص مذيل بعديد الأدينيلات (مرنا) اختيار والتشرذم، تليها تحويلها إلى كدنا]، بناء مكتبة وأخيرا، وبالتوازي مع نطاق واسع تسلسل عميق 12،13. بسبب الانخفاض السريع للsequencinتكاليف ز على مدى السنوات القليلة الماضية، RNA وما يليها وتحل تدريجيا محل غيرها من التقنيات، وتبذل جهودا كبيرة لتحسين بروتوكولات إعداد المكتبة. على سبيل المثال، فمن الممكن الآن الاحتفاظ بالمعلومات حبلا من النصوص مرنا عن طريق وضع علامة على كدنا] الشق الثاني مع ثلاثي deoxyuridine (dUTP)، وقبل PCR التضخيم، وهضم حبلا ملحوظ مع اليوراسيل-DNA-glycosilase (UDG). هذه العملية تعزز دقة الشرح الجينات وتقدير مستويات التعبير 14،15.

تحليل وتفسير البيانات RNA وما يليها تتطلب حزم البرامج الحسابية المعقدة وقوية ومعالجة داخل أنابيب بيوينفورمتيك 16،17. أولا، الخام يقرأ الخضوع لمراقبة الجودة عن طريق إزالة التحف الفنية والبيولوجية ونبذ (تقليم) تسلسل التي لا تصل متطلبات الجودة الصارمة. بعد ذلك يقرأ في كل عينة يتم تعيينها إلى الجينوم إشارة وفهرستهافي المستوى الجيني، على مستوى اكسون، أو على مستوى النص، من أجل تحديد وفرة من كل فئة. اعتمادا على التطبيق، ثم يتم احتساب البيانات المكررة من خلال النماذج الإحصائية لتحديد التعبير عن أليل معين، الربط البديلة، اندماج الجينات والنوكليوتيدات المفردة (النيوكلوتايد) (12). وأخيرا، التحليل التفاضلي على مستوى مختارة (أي التعبير الجيني أو الربط البديلة) يمكن استخدامها لمقارنة العينات التي تم الحصول عليها تحت ظروف مختلفة.

يصف تحليل الربط التفاضلية الاختلافات في استخدام الموقع وصلة بين اثنين من العينات. يتوفر عدد متزايد من حزم البرمجيات المخصصة لهذا الغرض على أساس النماذج الإحصائية المختلفة والعروض واجهة المستخدم (18). ومن بين هذه، والفرش (تحليل متعدد المتغيرات من نسخة الربط) تبرز بوصفها أداة الحسابية المتاحة بحرية ودقيقة تستند إلى إطار إحصائي النظرية الافتراضية ومصممة للكشف عن زراعية مختلفةأحداث الربط rential من أي بيانات الحمض النووي الريبي وما يليها نهاية واحدة أو المقترنة. بدءا من ملفات الانحياز (.bam)، يمكن الحصير كشف جميع أنواع رئيسية من الأحداث بديلة الربط (اكسون الطفر، بديلا 3 "لصق موقع بديل لل5" لصق موقع، الإكسونات يستبعد بعضها بعضا والاحتفاظ إنترون - أيضا انظر الشكل 1).

أولا، يحدد البرنامج يقرأ التي تدعم الحدث لصق معين، على سبيل المثال تخطي اكسون، وتصنفها إلى نوعين. "إدراج ما يلي:" (لهذا الحدث الكنسي لصق) الخريطة داخل اكسون التحقيق وتمتد تقاطعات بين أن اكسون محددة واثنين من الإكسونات المرافقة المنبع والمصب. "الطفر يقرأ" (لهذا الحدث لصق البديل) تمتد من تقاطع بين البلدين المرافقة الإكسونات. وفي وقت لاحق، والفرش إرجاع مستوى إدراج تطبيع للاحداث الكنسي والبديلة ويقارن القيم بين العينات أو شروط. في نهاية المطاف، فإنه يحسب ف قيمة الثانية معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت) على افتراض أن الفرق في نسبة البديل من الجينات بين شرطين يتجاوز عتبة المعرفة من قبل مستخدم معين لكل حدث الربط 19،34.

بعد تحليل الربط التفاضلية بالتزامن مع الحمض النووي الريبي بعدها، له ما يبرره على التحقق التجريبي واسعة النطاق من أجل تحديد المرشحين الجينات إيجابي صحيح (18). الكمي عكس كتب-البلمرة المتسلسل (QRT-PCR) هو الأسلوب الأكثر استخداما والأمثل في المصادقة على المرشحين الحصول عليها من تحليل الحمض النووي الريبي يليها 20. والهدف من هذه الورقة هو تقديم منهجية قوية لتحقيق المخدرات المتعلقة المقاومة ملامح الربط في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. نهجنا يستخدم الحمض النووي الريبي وما يليها على أساس Transcriptome على التنميط من نماذج خط الخلية المحددة من المخدرات السرطانات المقاومة في تركيبة مع طريقة QRT-PCR للتحقق من صحة الجينات المرشحة المتورطين في مقاومة المخدرات المعمول بها.

الصورة = "jove_content"> وتضمنت نماذج خط خلية سرطان الدم البشري المستخدم في هذه الدراسة للأطفال تي خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL) خط الخلية مدونة السلوك-CEM (CEM-WT)، وهما الاستيرويد (GC) المقاوم subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) وCEM-C7R5 (CEM-R5) 21،22 والميثوتريكسيت (MTX) المقاوم subline CEM / R30dm 23. على الرغم من أن العلاجات الحالية القائمة على GCS وMTX تضع فائدة سريرية في حوالي 90٪ من الحالات، وظهور GC-المقاومة لا يزال يمثل مشكلة لم تحل بعد مع الآلية الجزيئية غير واضحة. لعزل الحيوانات المستنسخة دون مقاومة للGC، كانت خلايا CEM-WT مثقف في 1 ميكرومتر ديكساميثازون (ديكس) لمدة 2 إلى 3 أسابيع. وقد وضعت subline مقاومة للMTX CEM / R30dm خلال المدى القصير المتكررة (24 ساعة) تعرض خلايا CEM-WT إلى 30 ميكرومتر MTX بمثابة تقليد من البروتوكولات السريرية. ومن المثير للاهتمام، عرض هذا الخط الخلية أيضا عبر المقاومة إلى التنفيذ المباشر (نتائج غير منشورة) التي لم يتم فهم الآلية بشكل كامل.

وتوم الصلبةأو نموذج التحقيق في هذه الدراسة هو غدية الأقنية البنكرياس، تشتهر حران الاستثنائي للعلاج الكيميائي. تحقيقا لهذه الغاية، اخترنا خط Panc-1 الخلية ولها مقاومة للجيمسيتابين دون استنساخ Panc-1R التي حصلت عليها الحضانة مستمرة مع 1 ميكرومتر من المخدرات (24). نحن هنا وصف نهج لاكتشاف آليات جديدة الكامنة في المختبر مقاومة المخدرات عن طريق الجمع بين ثلاثة بروتوكولات: فحوصات السمية الخلوية اللونية لتقييم حساسية المخدرات في خلايا اللوكيميا والخلايا السرطانية من الأورام الصلبة، خط أنابيب الحمض النووي الريبي استنادا وما يليها إلى تحديد المتغيرات لصق جديدة تتعلق حساسية العقاقير / المقاومة وRT-PCR وتحليل QRT-PCR للتحقق من صحة المرشحين المحتملين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توصيف التشكيلات المقاومة المخدرات من خلال السمسة فحوصات

  1. اللوكيميا ثقافة خط الخلية
    1. الحفاظ على الوالدين تي خلية ALL خط الخلية مدونة السلوك-CEM (CEM-WT)، وكذلك sublines المقاومة للأدوية، بما في ذلك CEM / R30dm، CEM-R5 وCEM-C3، في 25 سم 2 في المتوسط 10 مل RPMI-1640 تحتوي على 2.3 ميكرومتر حمض الفوليك تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين و 100 وحدة / مل البنسلين G و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
    2. ثقافة الخلايا في جو مرطب عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. سماح نمو الخلايا لتركيزات بين 2-3 × 10 6 خلية / مل.
    4. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع على تركيز الأولي من 0.3 × 10 6 خلية / مل (على سبيل المثال، إذا كان تركيز الخلية 3 × 10 6 خلية / مل، ونقل تعليق خلية 1 مل في قارورة جديدة تحتوي على 9 مل متوسطة جديدة). تجاهل الثقافة بعد 20 فقرات متتالية.
    البنكرياس سرطان الخلايا الخط الثقافة
    ملاحظة: الحفاظ على خط خلية سرطان البنكرياس البشري Panc-1 في 75 قوارير الثقافة سم 2 في 10 مل المتوسطة DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز ولام الجلوتامين تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري و 100 وحدة / البنسلين مل G و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل . البديل المقاومة للأدوية، Panc-1R، هو مثقف في مستنبت نفسه يحتوي على 1 ميكرومتر جيمسيتابين الذائبة في الماء المعقم. يتم توفير مزيد من التفاصيل في 24 ساعة.
    1. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    2. انقسام الخلايا كل 2-3 أيام في نسبة 1: 5 عندما تصل خلايا التقاء حوالي 90٪.
    3. لتقسيم الخلايا، وغسل مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إضافة 1 مل من التربسين / EDTA لكل 75 سم 2 الثقافة قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    4. إضافة 9 مل المتوسطة وحصاد خلايا منفصلة في أنبوب 15 مل. البذور تعليق خلية 2 مل في حساب المشترك قارورة جديدةining 8 مل المتوسطة. تجاهل الثقافة بعد 20 فقرات متتالية.
  2. MTT الفحص لخلايا اللوكيميا السرطانية
    1. إعداد مقدما الحل الإنتقالي العسكري: حل 500 ملغ من الإنتقالي العسكري formazan في 10 مل برنامج تلفزيوني ويقلب (محمية من الضوء) مع محرك مغناطيسي لحوالي 1 ساعة. تعقيم الحل مع مرشح 0.22 ميكرون. ملاحظة: يمكن تخزين الحل في 10 مل aliquots في -20 درجة مئوية. بعيدا عن الضوء المباشر بعد ذوبان الجليد.
    2. إعداد مقدما الأيزوبروبانول المحمضة: إضافة 50 مل من 2 M حمض الهيدروكلوريك إلى 2.5 لتر من الأيزوبروبانول. ملاحظة: تخزين الحل لمدة شهر واحد على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. إذا لم يتم المحمضة الأيزوبروبانول بشكل صحيح، قد تشكل رواسب مع المتوسط ​​وتؤثر سلبا على قراءات طيفية.
    3. إعداد منفصل 96-جيدا مسطحة القاع "يوم 0" (مراقبة) لوحة لضمان تقدير أكثر دقة من تثبيط النمو: أهدي 3-6 الآبار في خط الخلية، إضافة 30 ميكرولتر من النمومتوسطة، و 120 ميكرولتر من تعليق خلية (8،000 خلية) في كل بئر و 150 ميكرولتر من متوسط ​​النمو إلى الآبار الموافق الفراغات (أي خلايا). ننطلق من خطوة 1.3.9 إلى الخطوة 1.3.13 هذا القسم لقياس الكثافة الضوئية (OD). ملاحظة: يتم توفير المزيد من التفاصيل في 4.
    4. إعداد لوحة التجريبية 96-جيدا مسطحة القاع: أهدي 30 بئرا لتركيزات المخدرات (10 تركيزات، كل في ثلاث نسخ)، و 10 بئرا للسيطرة على الخلايا و10 بئرا للسيطرة على وسيط وبدون خلايا (الفراغات) وإعداد مجموعة التخفيف المخدرات من ديكساميثازون ( التنفيذ المباشر) باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد كمذيب.
      ملاحظة: للحصول على خلايا CEM-WT نطاق التخفيف التنفيذ المباشر ما بين 2 ميكرومتر و 0.97 نانومتر. لCEM / R30dm، CEM-R5 وCEM-C3 خلايا نطاق التخفيف التنفيذ المباشر ما بين 640 ميكرومتر و 0.33 نانومتر.
    5. إضافة 30 ميكرولتر من كل تخفيف التنفيذ المباشر في بئر المناسب من لوحة 96-جيدا. تأكد من تضمين كل التركيز في ثلاث نسخ.
    6. إضافة 30 ميكرولتر من متوسط ​​النمو إلى ماالصورة المقابلة للسيطرة على الخلايا و 150 ميكرولتر من متوسط ​​النمو إلى الآبار الموافق الفراغات.
    7. حصاد أضعافا مضاعفة تزايد الخلايا و resuspend في تركيز بذر الأمثل لها.
      ملاحظة: من أجل تحديد تركيز خلية البداية المثلى، فمن المستحسن لتقييم الشخصية نمو كل خلية خط خط الخلية في لوحة 96-جيدا قبل البذر الخلايا في عدة تجمعات وقياس ذلك يوميا لمدة 4 أيام على الأقل. اختيار تركيز البذر الذي يمنع فرط نمو الخلايا بعد 72 ساعة، حيث سيؤدي ذلك إلى التأثير على التجربة التي تشبع القيم OD. لCEM-WT، CEM-C5 وCEM-R5 تركيز بذر الأمثل هو 8000 خلية / جيدا، في حين أن لCEM / R30dm هو 5000 خلية / جيدا.
    8. إضافة 120 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل إما حل المخدرات التي تحتوي على بئر أو وسط النمو (الآبار المقابلة للسيطرة على الخلايا). ملء الآبار الخارجي فارغة من لوحة مع 150 ميكرولتر PBS لضمان رطوبة جيدة في لوحة واحتضان عشرلوحات ه لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 في حاضنة الثقافة الخلية.
    9. إضافة 15 ميكرولتر من الحل الإنتقالي العسكري إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 5 دقائق مع لوحة-شاكر تصل إلى حد أقصى قدره 900 الهزات / دقيقة.
    10. وضع لوحات مرة أخرى في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 في حاضنة الثقافة الخلية واحتضان لمدة 4 أخرى - 6 ساعات.
    11. إضافة 150 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المحمضة إلى كل بئر وتخلط جيدا مع ماصة الأقنية ل resuspend بدقة كل البلورات formazan. نبدأ مع آبار فارغة والتأكد من شطف النصائح جيدا قبل الشروع في صف آخر من لوحة.
    12. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقيقة.
    13. باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية، وتحديد OD في 540 و 720 نانومتر لضمان القياس الدقيق عن طريق تصحيح لOD الخلفية. ثم حفظ البيانات في ملف البيانات وتحليلها 4.
  3. تعتبر الدار الفحص لخلايا البنكرياس سرطان
    1. حل كاشف SRB في حامض الخليك 1٪ عند تركيز النهائي من 0.4٪ (ث / ت).
    2. حل حامض الخليك ثلاثي الكلور (TCA) في الماء عالى النقاء في تركيز النهائي من 50٪ (ث / ت).
    3. حل تريس (hydroxymethyl) -aminomethane في الماء عالى النقاء في تركيز النهائي من 10 ملم.
    4. إعداد منفصلة 96-جيدا مسطحة لوحة أسفل "يوم 0" الرقابة لضمان تقدير أكثر دقة من تثبيط النمو: البذور 6 آبار مع نمو الخلايا في مرحلة الأسي في 100 المتوسطة ميكرولتر في تركيز البذر المناسب وإضافة 100 متوسطة ميكرولتر فقط إلى الآبار المقابلة ل الفراغات. احتضان ليلا 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لضمان الالتصاق السليم للخلايا لوحة. ثم إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة لجميع الآبار، والشروع في خطوات 1.4.8 - 1.4.16 من هذا القسم.
    5. إعداد لوحة التجريبية 96-جيدا مسطحة القاع: خلايا البذور تنمو في مرحلة الأسي في ثلاث نسخ في 96 بئرا لوحات مسطحة القاع في الكثافة المناسبة في 100 ميكرولتر من ليdium باستخدام الماصة متعدد القنوات.
      ملاحظة: من أجل تحديد تركيز خلية البداية المثلى، فمن المستحسن لتقييم الشخصية نمو كل خلية خط خط الخلية في لوحة 96-جيدا قبل البذر الخلايا في عدة تجمعات وقياس ذلك يوميا لمدة 4 أيام على الأقل. اختيار تركيز البذر الذي يمنع فرط نمو الخلايا بعد 72 ساعة، حيث سيؤدي ذلك إلى التأثير على التجربة التي تشبع القيم OD. لخلايا Panc-1 وPanc-1R، وتركيز بذر الأمثل هو 8000 خلية / جيدا.
    6. إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة والمتوسطة فقط الآبار واحتضان ليلا 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لضمان الالتصاق السليم للخلايا لوحة.
    7. إعداد مجموعة التخفيف المخدرات من جيمسيتابين بين 1 ميكرومتر و 10 نانومتر لPanc-1 و 1 ملم و 100 نانومتر لخلايا Panc-1R. إضافة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في بئر المناسب من لوحة 96-جيدا باستخدام الماصة متعدد القنوات. تأكد من أن يكون كل التركيز في ثلاث نسخ. بالإضافة الى،إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة إلى الآبار المتوسطة فقط والخلايا السيطرة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 72 ساعة.
    8. إضافة 25 ميكرولتر حل TCA البارد لالآبار باستخدام الماصة متعدد القنوات واحتضان لوحات لمدة 60 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية لتسريع وإصلاح البروتينات في الجزء السفلي من الآبار.
    9. تفريغ لوحة عن طريق إزالة لفترة وجيزة المتوسط ​​والجاف على الأنسجة.
    10. يغسل 5 مرات مع ماء الصنبور، ثم إفراغ لوحة واسمحوا الجافة في درجة حرارة الغرفة.
    11. إضافة 50 ميكرولتر حل SRB لكل بئر باستخدام تكرار-الماصة وصمة عار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    12. تفريغ لوحة عن طريق إزالة وصمة عار SRB.
    13. تغسل 4 مرات مع حمض الخليك 1٪، ثم إفراغ لوحة واتركها لتجف في درجة حرارة الغرفة.
    14. إضافة 150 ميكرولتر حل تريس لكل بئر باستخدام الماصة متعدد القنوات وتخلط لمدة 3 دقائق على لوحة شاكر تصل إلى حد أقصى قدره 900 الهزات / دقيقة.
    15. قراءة الكثافة البصرية في 540 نانومتر (أو 492 نانومتر إذا رانه OD قيم مرتفعة جدا).
    16. تحليل البيانات.
  4. تحليل البيانات لالإنتقالي العسكري وتعتبر الدار فحوصات
    1. حساب القيم OD من الخلايا في "يوم 0" باستخدام الصيغة التالية: OD يوم 0 الخلايا = السيطرة OD - متوسط الآبار فارغة التطوير التنظيمي
    2. حساب النسبة المئوية من الخلايا على قيد الحياة لكل تركيز الدواء وفقا للمعادلة التالية:٪ الخلايا المعالجة = متوسط [OD الخلايا المعالجة - متوسط الآبار فارغة التطوير التنظيمي - يوم OD 0] / [الخلايا السيطرة OD - متوسط الآبار فارغة التطوير التنظيمي - OD Day0] * 100
    3. رسم منحنى الاستجابة للجرعة (تركيز الدواء مقابل تثبيط نمو٪).
    4. حساب تركيز الدواء الذي يمنع نمو الخلايا بنسبة 50٪ (IC 50) باستخدام منحنى الاستجابة للجرعة.

2. عزل الحمض النووي الريبي وإعداد مكتبة للRNA التسلسل

  1. عينة كولection وعزل الحمض النووي الريبي
    1. لخلايا CEM: حصاد 10 6 الخلايا مباشرة من مستنبت.
    2. لPanc-1 وPanc-1R: إزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وفصل بإضافة التربسين- EDTA ويحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. إضافة مستنبت وحصاد 10 6 خلايا.
    3. تدور باستمرار عينات في 300 x ج لمدة 3 دقائق، وإزالة طاف واستخراج مرنا الكلي باستخدام المتاحة تجاريا الأعمدة تدور غشاء السيليكا، وذلك باتباع بروتوكول الشركة المصنعة `.
    4. تحديد تركيز ونقاوة الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مطياف أشعة فوق البنفسجية فيس.
      ملاحظة: يعتبر RNA عالية النقاء إذا كانت نسبة الامتصاصية 260 نانومتر / 280 نانومتر فوق 1.8. العينات يمكن تخزينها في - 80 درجة مئوية.
    5. تقييم إجمالي سلامة الحمض النووي الريبي الكهربائي من 200 نانوغرام من العينة على 1٪ هلام الاغاروز ملطخة بروميد إيثيديوم.
      ملاحظة: الكشف عن شريطين سليمة الموافق الثدييات 28S و 18S rRNAs في حوالي الساعة2 كيلوبايت و 1 كيلوبايت في الحجم يدل على حسن الإجمالية سلامة الحمض النووي الريبي.
  2. إعداد مكتبة التسلسل
    1. استخدام 2 ميكروغرام من إجمالي مرنا في كل عينة. اتبع مرنا بروتوكول إعداد المكتبة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. تحديد نوعية وتركيز كل مكتبة باستخدام نظام bioanalyzer. تجمع المكتبات في عينة واحدة تصل إلى تركيز النهائي من 10 نانومول / لتر وقياسه مع bioanalyzer.
    3. استخدام نظام التسلسل الإنتاجية العالية مع واحدة مقروءة وضع 100 نقطة أساس.
      ملاحظة: قراءة طول> 80 نقطة أساس ضروري لتحديد الأشكال الإسوية النسخي.

3. الكشف عن التفاضلية الربط من تسلسل القراءات

  1. محاذاة يقرأ على مرجع المجين البشري وفحص الجودة
    1. تجميع الشرح الجين (ملف .gtf) من الجدول NCBI refGene باستخدام متصفح UCSC الجدول رقم (25963 الجينات).
    2. نفذالشرح علم المواءمة شق التسلسل يقرأ لجينوم المرجعية (GRCh37) باستخدام النجوم.
    3. نوع ومؤشر الناتج الملفات المواءمة مع أدوات بيكار.
    4. أداء مراقبة الجودة بعد رسم الخرائط باستخدام RSeQC وsamtools.
  2. كشف الربط الفارق بين المجموعات عينة
    1. تثبيت بيثون والإصدارات المقابلة من NumPy وSciPy. تحميل وتثبيت samtools. تحميل وتثبيت ربطة العنق وtophat،
    2. إضافة بيثون، ربطة العنق، tophat وsamtools الدلائل إلى المتغير $ PATH البيئة. تحميل بنيت قبل فهارس ربطة (hg19). تحميل rMATS النسخة 3.0.9.
      ملاحظة: يتم توفير المزيد من التفاصيل حول rMATS في 19 و 34.
    3. كشف الأحداث الربط بديلة بمقارنة كل خط الخلية مقاومة للالتنفيذ المباشر لCEM-WT وPanc 1 إلى Panc-1R في الفرش مستقل يدير وفقا لالشكل 5A.
    4. للكشف عن أحداث الربط التفاضلية من previously تسلسل محاذاة يقرأ (ملفات .bam)، تشغيل الفرش باستخدام الأوامر من الشكل 5B عن CEM-WT مقابل CEM- C3، CEM-WT مقابل CEM-R5، CEM-WT مقابل CEM / R30dm وPanc1 إلى Panc- مقارنات 1R.
      ملاحظة: سوف MATS بإنشاء مجلد الإخراج مع اثنين من ملفات .txt مع النتائج حسب نوع الحدث الربط تحليلها (SE - اكسون الطفر، A5SS - البديل 5 "لصق موقع، A3SS - البديل 3" لصق موقع، المكسيك - الإكسونات يستبعد بعضها بعضا وRI - الاحتفاظ إنترون): ملف واحد يحتوي على النتائج على أساس التهم تقاطع فقط والملف الثاني مع النتائج على أساس التهم تقاطع ويقرأ على الهدف. وعلاوة على ذلك، يتم إنشاء ملف txt إضافي لمحة نتيجة في نفس المجلد.
    5. لSE، A5SS، A3SS وRI الاستيراد لجداول البيانات وملفات .txt على أساس التهم تقاطع ويقرأ على الهدف. لMEX استيراد ملفات .txt على أساس التهم تقاطع فقط.
      ملاحظة: يتم فرز ملف الإخراج الفرش التي كتبها تصاعدي ف القيم وتحتوي على العديد من المعلمات: معرف الجينات، رمز الجين، كروموسوم وموقف حبلا، الإحداثيات الجينوم من شظايا تقسم بدلا من ذلك، تعول فضلا عن طول إدراج وتخطي أشكال لكل من العينات التي تم تحليلها، وطول إدراج وتخطي النموذج المستخدم للتطبيع، ص القيمة، ومعدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت )، ومستوى إدراج لكل عينة بناء على التهم تطبيع والنتيجة إدراج التفاضلي (متوسط ​​(IncLevel1) - المتوسط ​​(IncLevel2)).
    6. تحديد الجينات المرشحة ذات دلالة إحصائية مع روزفلت <10٪ لمزيد من التحقق من صحة (على سبيل المثال، DDX5 وPKM2).
    7. تصور الأحداث الربط البديلة مع التكاملية الجينوم عارض (IGV، https://www.broadinstitute.org/igv/)، كما ورد في الشكل (5).

4. التحقق من النتائج حسب RT-PCR وQRT-PCR فحوصات

  1. التصميم التمهيدي
    ملاحظة: من أجل توفير التحقق من صحة موثوق من النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام خط أنابيب بيوينفورمتيك، مرنا العابرةوتتضخم cripts الناتجة عن أحداث الربط بديلة باستخدام RT-PCR وتصور من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز من المنتجات PCR. Cyanine صبغة خضراء مثل SYBR يستخدم الأخضر QRT-فحص PCR لتحديد لصق خاص المتغيرات نسبة إلى الجينات التدبير المنزلي. يصور الشكل 7 الاستراتيجية المطبقة لتصور اكسون 12 حالة تخطي هذا الجين DDX5 ولتحديد يتعارضان اكسون 9 واكسون 10 من الجينات PKM.
    1. لRT-PCR الفحص، التصميم التمهيدي أزواج الذي يصلب لالإكسونات التأسيسية (اكسون 10 واكسون 13) الواقعة المنبع والمصب مواقع الربط البديلة (7A الشكل).
      ملاحظة: يجب أن تغطي حجم amplicon بين 100 و 800 نقطة أساس لضمان فصل واضح للمنتجات PCR توقع على هلام الاغاروز. يجب أن تكون درجة الحرارة الصلب من الاشعال بين 55 و 65 درجة مئوية ومحتوى GC يجب أن لا تتجاوز 60٪.
    2. فحص الأخضر Cyanine (7B الشكل). تحقق تسلسل تناظر اثنين من الإكسونات يستبعد بعضها بعضا وتصميم اثنين من أزواج التمهيدي كل واحدة منها على وجه التحديد، ويكشف حصريا فقط واحد من المتغيرات لصق اثنين.
      ملاحظة: للحصول على PKM، التمهيدي العكسي anneals لاكسون 11 مشترك لكلا الخيارين، في حين أن الاشعال إلى الأمام هي متفاوتة محددة ويصلب لاكسون 9 (PKM1) أو اكسون 10 (PKM2).
    3. من أجل الكشف عن DDX5 كامل طول الجين، يصلب التمهيدي العكسي داخل اكسون تخطي (اكسون 12).
      ملاحظة: للكشف محدد من البديل DDX5 ΔEx12، التمهيدي العكسي يمتد الحدود exon11 / exon13. استخدام نفس التمهيدي إلى الأمام التي anneals لاكسون التأسيسي 10 لكل من ردود الفعل.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم amplicon بين 80 و 200 نقطة أساس.
  • الشكل الأول كدنا] التجميعي
    1. إعداد النسخ العكسي من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي معزولة إلى كدنا] باستخدام 200 U / ميكرولتر من مولوني الفئران فيروس ابيضاض الدم (M-MLV) ترحد ذاته الناسخ العازلة في رد فعلها المخفف 1: 5 مع الماء المعقم. إضافة DTT 1 ميكرومتر، 0.05 ميكروغرام من hexamers عشوائي، مزيج deoxynucleotide (dNTP) 1 ملم، و 40 U / ميكرولتر من المانع ريبونوكلياز.
    2. دوامة لفترة وجيزة واحتضان مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    3. احتضان مزيج التفاعل عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإبطال نشاط الناسخ العكسي، ونقل المزيج على الجليد وتدور أسفل باستخدام microcentrifuge ل. عينات يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في - 20 درجة مئوية.
  • RT-PCR التفاعل والاغاروز جل
    1. إعداد تفاعل PCR في أنبوب PCR لكل عينة عن طريق خلط 12.5 ميكرولتر من 2X تتركز PCR mastermix، 1.25 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام ونفس المبلغ للالتمهيدي العكسي تصل إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر مع الماء المعقم.
    2. إضافة 1 ميكرولتر من [كدنا إلى هذا المزيج، ووضع أنابيب في thermocycler. تشغيل البرنامج على النحو التالي: تمسخ الأولي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.نكرر الخطوات التالية لمدة 35 دورات: تمسخ في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 25 ثانية؛ الصلب عند 52 درجة مئوية لمدة 35 ثانية؛ تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. تعيين ملحق النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إعداد 1٪ agarose هلام عن طريق إذابة 1 غرام من الاغاروز في 100 مل 1X عازلة TBE. إضافة 2.5 ميكرولتر من بروميد إيثيديوم إلى الحل. تنبيه: بروميد إيثيديوم غير مسرطنة، امسكها بعناية باستخدام غطاء الدخان الكيميائية.
    4. تحميل العينات وتشغيل هلام في المخزن TBE 1X في 100 فولت لمدة 30 دقيقة في نظام الكهربائي.
    5. كشف الجل مع كاميرا الأشعة فوق البنفسجية الرقمية وحفظ الصورة.
  • QRT-PCR وتحليل البيانات
    1. إعداد Cyanine الأخضر PCR رد فعل في كل عينة عن طريق خلط 12.5 ميكرولتر من 2X PCR Mastermix الأخضر، 2 ميكرولتر من 5 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام ونفس المبلغ للالتمهيدي العكسي تصل إلى الحجم النهائي من 15 ميكرولتر مع الماء المعقم في أنبوب PCR . إعداد المزيج لكل لصق محددالبديل ليتم الكشف عن (PKM1، PKM2، DDX5 طول كامل، DDX5 ΔEx12) والجينات التدبير المنزلي (المكتب المركزي للاحصاءات).
    2. تحميل mastermix على البيضاء لوحة 96 جيدا وإعداد التكرارات في كل عينة.
    3. تمييع كدنا] 10X في الماء، وإضافة 5 ميكرولتر إلى كل المزيج ووضع لوحة في thermocycler. تشغيل البرنامج على النحو التالي: تمسخ الأولي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نكرر الخطوات التالية لمدة 45 دورات: تمسخ في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية؛ الصلب في 58 ° C (لDDX5 وDDX5 ΔEx12 يمزج) أو 60 درجة مئوية (لPKM1 وPKM2 يمزج) لمدة 20 ثانية. تعيين ملحق النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية. تعيين ذوبان منحنى عن طريق تطبيق التدرج 65-97 درجة مئوية.
    4. من أجل تقييم خصوصية مجموعات التمهيدي إلى هدفهم، والتحقق من منحنيات ذوبان وتحقق من أن يتم تشكيل ذروة واحدة في كل مجموعة التمهيدي.
    5. حساب القيم المشتقة الثانية من منحنيات التضخيم وتصدير القيم عتبة دورة (CT).
    6. Calculatالبريد مستويات التعبير النسبية (REL) من لصق مرنا المتغيرات بالمقارنة مع التدبير المنزلي المكتب المركزي للاحصاءات (المرجع) الجينات في كل عينة باستخدام "دلتا ط م (ΔCt)" الأسلوب. الصيغة: REL = 2 - ΔCt، حيث ΔCt = ط الهدف لصق البديل - الجينات ط المرجعية
    7. من أجل تحديد الوفرة النسبية للمتغيرات لصق، وحساب نسبة REL باستخدام الصيغة: نسبة REL نسبة = REL لصق البديل 1 / REL لصق البديل 2.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    المقايسات السمسة هو موضح في البروتوكول توفر طريقة موثوق بها وقوية لتقييم مقاومة الخلايا السرطانية إلى وكلاء العلاج الكيميائي في المختبر. عن طريق الفحص الإنتقالي العسكري، تم تحديد حساسية إلى التنفيذ المباشر في أربعة خطوط T-ALL الخلايا بما في ذلك خلايا CEM-WT الوالدين التنفيذ المباشر الحساسة، وثلاثة sublines مقاومة للالتنفيذ المباشر: CEM / R30dm، CEM-R5 وCEM-C3. كان لا بد من استخدامه نظرا إلى اختلاف كبير في حساسية بين CEM-WT (2 ميكرومتر - 0.97 نانومتر) نطاقين تركيز مختلفة، والتنفيذ المباشر خطوط الخلايا مقاومة (640 ميكرومتر - 0.33 نانومتر). وأظهر الفحص الإنتقالي العسكري بشكل واضح المقاومة التنفيذ المباشر في CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 ميكرومتر)، CEM-R5 (IC 50> 640 ميكرون) وCEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 ميكرومتر) بالمقارنة مع CEM- خلايا WT (IC 50 = 0.028 ± 0.003 ميكرومتر). وبالمثل أظهر فحص SRB المقاومة جيمسيتابين عالية في خط الخلية Panc-1R (IC 50 = 3.16 ± 0.01 ميكرومتر) مقارنة مع الوالدين الخلايا Panc 1 (IC 50 = 0.077 ± 0.03 ميكرومتر) أظهرت كما في الشكل (2).

    بعد تأكيد المقاومة للأدوية في جميع خطوط الخلايا في الاعتبار، أننا تقدمنا ​​إلى جانب العزلة مرنا، وإعداد مكتبة والحمض النووي الريبي التسلسل. استخراج مجموع مرنا باستخدام الأعمدة تدور غشاء السيليكا هو الخيار المفضل عبر أساليب أخرى لأنه يتجنب الفينول والبروتين التلوث ويوفر نقاء عالية من العينة مع 260 نانومتر / 280 نسبة نانومتر الامتصاصية أعلى بكثير من 1.8. هذا هو شرط حاسم لتطبيقات المصب معقدة مثل تسلسل عميق. الطريقة المستخدمة للتحقق من سلامة عينات الحمض النووي الريبي التي كتبها الاغاروز 1٪ هو مناسبة خاصة لخلايا معزولة حديثا (الشكل 3). وبما أن الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن المتغيرات لصق بديلة أعرب aberrantly في خطوط الخلايا مقاومة للأدوية، نختار selectio إيجابين مرنا مذيل بعديد الأدينيلات لإعداد مكتبة التسلسل، وذلك باستخدام عدة مرنا الذين تقطعت بهم السبل. وصفت Electropherograms المكتبات واحدة وتجمع في الشكل (4)، والتي تبين أن متوسط حجم جزء من حوالي 300 سنة مضت، بما يتفق مع متطلبات نظام التسلسل. وبعد ذلك التسلسل المكتبات التي تعد باستخدام رقاقة واحدة مع وضع القراءة 100 نقطة أساس. اختيار التسلسل يقرأ من 100 نقطة أساس ضروري للكشف عن الربط البديلة من خلال خطوط أنابيب بيوينفورمتيك المصب.

    بعد خطوات المعالجة الأولية ومراقبة الجودة، ويقرأ نظيفة الانحياز إلى الجينوم البشري (hg19) تعرضوا للالتفاضلية تحليل الربط باستخدام الفرش. في هذا التحليل يمكننا إجراء مقارنات بين حساسة خط الخلية الوالدين المخدرات وكل من المخدرات في sublines مقاومة بشكل منفصل (أي، CEM WT مقابل CEM / R30dm، CEM WT مقابل CEM-C3، الخ). تعتمد MATS على نموذج إحصائي مرن ودقيقتستخدم لكشف الربط الفرق بين العينات. باستخدام خيارات التحليل الافتراضي وقيمة روزفلت <10٪ كحد قطع (كما هو مبين في الشكل 5B)، تمكنا من تحديد 38 ± 12 مرشحا الجينات كبير تقسم تفاضلي في المقارنة التي أمر بها نوع من الحدث الربط البديلة، مع معظم الزيارات تصنف على أنها تخطي اكسون. يوضح الشكل (6) إخراج تحليل نموذجي للمقارنة Panc-1 مقابل Panc-1R.

    ركزنا مزيد من دراستنا على اثنين من الأنواع الأكثر شيوعا من الأحداث الربط البديلة: اكسون الطفر والأحداث اكسون تبادلية مع مرشح ممثل واحد لكل فئة موضح أدناه. تم الكشف عن DDX5 (DEAD مربع هيليكاز 5) من خلال تحليل الحصير كما دلالة إحصائية في المقارنة CEM-WT مقابل CEM-C3 و CEM-R5، ولكن لم تكن كبيرة في المقارنة CEM-WT مقابل CEM / R30dm. ونظرا لدور المفترض في سرطان الدم 25،26، نحناختيار هذا المرشح لمزيد من التحقق من الصحة. يوصى بدرجة كبيرة لتصور البيانات RNA وما يليها في الجينوم مثل متصفح أداة. يوفر IGV واجهة تنوعا وسهلة الاستعمال لهذا الغرض، كما هو مبين في الشكل (7) لDDX5 مرشح الجينات. PKM (البيروفات كيناز العضلات ايزوزيم) هو حدث اكسون يتعارضان ذات دلالة إحصائية في المقارنة CEM-WT مقابل كل sublines التنفيذ المباشر مقاومة، ولكن ليس في المقارنة Panc-1 مقابل Panc-1R. ونظرا لأهمية هذا الإنزيم في الأورام الصلبة الأيض 27،28 والدور المتنامي للاستقلاب الخلية في مقاومة القشرية السكرية في 29 T-ALL، نختار هذا المرشح لمزيد من التحقق من صحة باستخدام RT-PCR.

    يجب أن تتم التصميم التمهيدي مع الحذر الشديد من أجل تضخيم amplicon الصحيح، وخصوصا عندما الاشعال يصلب لاكسون-اكسون الحدود (في حالة التمهيدي العكسي كشف DDX5 ΔEx12 البديل) أو عندما ريا يصلب لبعضها البعض الإكسونات حصرية مع ارتفاع تسلسل تناظر (اكسون 9 و 10 من اكسون PKM). ويبين الشكل 8 استراتيجية التصميم التمهيدي، بينما يظهر الرقم 9 نتائج من RT-PCR لمرشح DDX5 الجينات. تم الكشف عن DDX5 ΔEx12 في عينة CEM-WT وCEM / R30dm ولكن ليس في CEM-C3 و CEM-R5، مؤكدة بذلك البيانات الفرش بطريقة النوعي. Cyanine الأخضر QRT-فحص PCR الكمي بدقة مستويات التعبير مرنا من DDX5 ولصق PKM المتغيرات، كما هو مبين في الشكل 10 والرقم 11، على التوالي.

    شكل 1
    شكل 1: التمثيل التخطيطي من الربط الفعاليات البديلة. التمثيل التخطيطي من الأنماط الممكنة من الربط بديلة من الجين. مربعات والإكسونات المنفصلة التي يمكن تضمينها بشكل مستقل أو استبعادها من السيدNA نسخة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: نتائج السمسة فحوصات. (أ) فحص MTT لخطوط الخلايا اللوكيميا يظهر مستويات عالية من المقاومة ديكساميثازون في CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98)، CEM-R5 (IC 50> 640 ميكرون) وCEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 ميكرومتر ) بالمقارنة مع الوالدين CEM-WT (IC 50 = 0.028 ± 0.003 ميكرومتر). المقايسات (ب) تعتبر الدار للخطوط الخلايا السرطانية في البنكرياس تكشف عن مستويات عالية من المقاومة جيمسيتابين في Panc-1R (IC 50 = 3.16 ± 0.01 ميكرومتر) بالمقارنة مع الوالدين Panc 1 (IC 50 = 77.22 ± 2.76 نانومتر). تقرير الرسوم البيانية متوسط ​​نمو الخلايا٪ ± SEM من ثلاثة INDEPتجارب endent. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الشكل (3): تقييم جودة RNA باستخدام هلام الاغاروز. تم تشغيل مائتي نانوغرام من إجمالي مرنا في 1٪ agarose هلام ملطخة بروميد إيثيديوم. وجود عصابات سليمة الموافق 18S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الأنواع و28S وعدم وجود لطخات على أوزان جزيئية منخفضة تدل على الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)
    الشكل (4): <قوية> آثار Bioanalyzer المكتبات التسلسل. (A) Electropherograms المكتبات التسلسل تظهر قمم في حوالي 300 سنة مضت، مما يدل على نوعية جيدة. عينة 1-6 = CEM-WT، CEM-C3، CEM-R5، CEM / R30dm، Panc-1 وPanc-1R. (ب) رحلاني من العينات المجمعة (FU، الإسفار وحدات).

    الرقم 5
    الشكل (5): الكشف عن التفاضلية الربط مع الفرش. (A) مقارنات المجموعة و (ب) النصوص المستخدمة لتشغيل الفرش. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (6)
    الشكل (6): MATS قائمة الإخراج. الرقم يصور الانتاج نموذجية من تحليل الفرش في برنامج مع جداول البيانات: هنا يتم الإبلاغ عن المرشحين تقسم تفاضلي في المقارنة Panc-1 مقابل Panc-1R للأحداث اكسون تخطي (روزفلت <10٪). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 7
    الرقم 7: تصور التفاضلية الربط من DDX5 المرشح الجينات من خلال متصفح IGV الجينوم. الملفات مع الانحياز يقرأ (.bam) المقابلة لخلايا اللوكيميا تم تحميلها على المتصفح IGV الجينوم وتصور باستخدام قطع الساشيمي (العدد الأدنى تقاطع قيمة = 10 لتصور الأحداث الربط كبيرة). وتتمثل التهم لصق تقاطع طريق ربط الخطوط وعدد المقابلة لRNA وما يليها يقرأ تغطي الإكسونات. CEM-WT وCEM / R30dm تظهر تخطي التهم تمتد اكسون 11 إلى 13 اكسون مقارنة CEM-C3 و CEM-R5 التي لا تظهر أي اكسون 12 الطفر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    شكل 8
    الرقم 8: التصميم التمهيدي لRT-PCR وCyanine الخضراء QRT-PCR. (A) RT-PCR: أزواج التمهيدي الكشف عن الربط التفاضلية من DDX5 يصلب لالإكسونات التأسيسية (اكسون 10 واكسون 13) الواقعة المنبع والمصب من الإكسونات تقسم بدلا من ذلك. (ب) QRT-فحص PCR: لتقدير نسبي النصوص الناتجة عن أحداث اكسون تخطي مقارنة النصوص الكنسي، التمهيدي العكسي anneals سواء داخل اكسون تخطي (البديل البديل) أوإلى حدود exon11 / exon13 (الكنسي البديل) من الجين DDX5. لتقدير الإكسونات يستبعد بعضها بعضا، التمهيدي العكسي anneals لاكسون 11 مشتركا لكل من الأشكال الإسوية، في حين أن التمهيدي يصلب الأمام إما إلى اكسون 9 (PKM1) أو اكسون 10 (PKM2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 9
    الرقم 9: RT-PCR التحقق من DDX5 التفاضلية الربط. يظهر agarose هلام 1٪ الربط التفاضلية من الجين DDX5 في خلايا اللوكيميا. يتم تضخيمه جزء الموافق DDX5 amplicon كامل طول (650 بي بي) في جميع العينات في حين يتم تضخيمه DDX5 ΔEx12 (430 بي بي) البديل في CEM-WT وCEM / R30dm العينات وحجم يتوافق مع اكسون 12 الطفر. لم يتم الكشف عن هذا في الخلايا CEM-C3 و CEM-R5، وردعتستخرجه تحليل الفرش. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 10
    الرقم 10: مستويات التعبير مرنا من DDX5 لصق المتغيرات في خلايا CEM. (A) QRT-فحص PCR. يعني مستويات التعبير النسبية والخطأ المعياري للمتوسط ​​(REL ± SEM) من تجربتين مستقلة. (ب) نسبة REL (± SEM) من المتغيرات لصق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 11
    الشكل 11: مرنا مستوى التعبيرالصورة من PKM لصق المتغيرات في CEM وPanc-1 الخلايا. (A) QRT-فحص PCR. يعني مستويات التعبير النسبية والخطأ المعياري للمتوسط ​​(REL ± SEM) من تجربتين مستقلة ونسبة REL من المتغيرات لصق لخلايا CEM. (ب) QRT-فحص PCR. يعني REL ± SEM من تجربتين مستقلة ونسبة REL (± SEM) من المتغيرات لصق لPanc-1 الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    نحن هنا وصف نهجا جديدا يجمع بين تقنيات فحص السمية الخلوية راسخة وقوية transcriptomic أساس خ ع و تحليلات لتحديد الأحداث الربط التفاضلية فيما يتعلق المقاومة للأدوية. المقايسات طيفية وطرق الإنتاجية العالية مريحة وقوية لتقييم حساسية المخدرات في المختبر في نماذج السرطان وتمثل الخيار الأول للعديد من المختبرات أداء الفحوص السمية الخلوية. وقد وصفت استكشاف الأخطاء وإصلاحها وكذلك الاختلافات المحتملة لهذه الطريقة على نطاق واسع في أماكن أخرى 4،5.

    الإنتاجية العالية الجينومية التحليلات المستخدمة حاليا لاستكشاف آليات المقاومة للأدوية تعتمد أساسا على الكشف عن تعدد الأشكال والتفاضلية تقدير التعبير عن الجينات المرتبطة النمط الظاهري معين المقاوم للأدوية. في هذه الدراسة، ونحن تصف استخدام أساليب الحمض النووي الريبي التسلسل، جنبا إلى جنب مع خطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية القوية لشرح دقيق لالنصوص مرنا والكشف عن DIFالربط ferential. وهناك ميزة مهمة بشكل خاص للبروتوكول وصفها هو القدرة على تحديد المتغيرات لصق جديدة بين مجموعتين عينة مع التشكيلات حساسية العقاقير متميزة. واحدة من الخطوات الحاسمة لإجراء تحليل دقيق وغير متحيز هو عزل الحمض النووي الريبي، التي يجب أن تكون عالية النقاء والنزاهة.

    MATS هو البرنامج نختار بين سلسلة من أدوات المعلوماتية الحيوية المماثلة المتوفرة (على سبيل المثال، Cuffdiff 2، DEXseq، DiffSplice والربط البوصلة) للكشف عن الربط البديلة 18. الملامح الرئيسية الرئيسية التي تجعل منه الخيار المفضل هي الدقة الفائقة ودقتها وكذلك إمكانية تحديد أحداث الرواية. MATS يولد نوعين من الناتج يتضمن تحليلا التفاضلية الربط: يستند أولا فقط على التهم تقاطع اكسون ويقوم الثاني على التهم تقاطع وكذلك يقرأ على الهدف. بينما يفضل هذا الأخير للكشف عن اكسون تخطي الأحداث، فمن المستحسناستخدام الخيار الأول للتحليل الإكسونات متبادل الخالصة، وهذا النهج يقلل من عدد المرشحين ايجابية كاذبة لهذا نوع معين من تغيير الربط.

    وعلاوة على ذلك، لالتحليلات التي تركز على الاحتفاظ إنترون بديلة، أحداث 3 'و 5' لصق موقع، يجب استخدام ملف .gtf مع إنترونات المشروح. في نهاية المطاف، من أجل الحد من التباين البيولوجي والتقني ضمن مجموعات عينة وضمان ارتفاع معدلات إيجابية حقيقية، فمن المستحسن أن تسلسل لا يقل عن ثلاثة يعيد 34. وكان الجمع بين اختيار المرشحين الجين تقسم بشكل مختلف على أساس انتاج الحصير مع مصادقة خطوة باستخدام RT-PCR. هذا مهم للغاية لاختيار من المتغيرات الإيجابية الحقيقية بين قائمة كبيرة من المرشحين ذات دلالة إحصائية. العامل الرئيسي لإثبات دقة هو تصميم [أليغنوكليوتيد وتعظيم الاستفادة من ردود الفعل PCR وفقا للمعايير البيولوجيا الجزيئية. عناية خاصةينبغي أن تؤخذ عند تصميم الاشعال تمتد تقاطعات اكسون-اكسون وخطوات التحقق من صحة إضافية، مثل تسلسل amplicons بطريقة سانجر، هناك ما يبرر من أجل تأكيد خصوصيتها.

    الربط التفاضلية من DDX5 وPKM محاضر الكشف عنها بواسطة الفرش تمثل مثالين من الربط الشاذة المتعلقة المقاومة للأدوية. لم يكن أعرب DDX5 ΔEx12 في خطوط الخلايا مقاومة للGC (CEM-C3 و R5)، التي تم اختيارها بعد التعرض التنفيذ المباشر لفترة طويلة. وأعرب عن DDX5 ΔEx12 في خط الخلية الوالدية ولكن أيضا في subclone CEM / R30dm، الذي تم اختياره لمقاومة كيل العلاج الكيميائي MTX بدلا من التنفيذ المباشر. في الخلايا السرطانية، وأعرب عن PKM2 للغاية مقارنة PKM1 لصق البديل لها، ولكن PKM2 نسبة / PKM1 كانت أعلى في الخلايا المقاومة للالتنفيذ المباشر، كما اقترحت النتائج خ ع. وهذا لم يلاحظ لPanc-1 عينة مقارنة بنظيره مقاومة للجيمسيتابين و، في الواقع، كان هذا الجين مرشح ليس بينأحداث ذات دلالة إحصائية في تحليل الفرش. وقد يعكس هذا نوع من الخلايا المختلفة، وآلية من المخدرات المقاومة الناجمة عن التعرض جيمسيتابين.

    في الختام، يشكل هذا البروتوكول نهج مناسبة لاكتشاف المتغيرات لصق والتي قد تكمن وراء مقاومة الجراثيم للأدوية ويمكن تطبيقها على أي خلايا اللوكيميا 30 أو الخلايا السرطانية الصلبة 31. وجود قيود واضحة هي أن خطوط الخلايا السرطانية التقاط سوى جزء صغير من عدم التجانس السرطان. وعلاوة على ذلك، فقد تم الحفاظ على معظم خطوط الخلايا لسنوات عديدة في الطبقات الوحيدة في وسائل الإعلام تعزيز النمو. هذه الظروف تؤثر على الخصائص الخلوية، مما أدى إلى اختيار القطعان التي تختلف بشكل كبير من خلايا الأورام الأولية التي تنشأ. ومع ذلك، وتشارك العديد من الجينات التي تشارك في مقاومة المخدرات أيضا في وظائف الخلية محورية أخرى مثل نمو الخلايا والخلايا التي قد تتأثر culturin على المدى الطويل ز في البلاستيك. ولذلك، من أجل تحسين دراسة مقاومة الجراثيم للأدوية، وينبغي توجيه المزيد من الجهود نحو تطوير نماذج ما قبل السريرية الجديدة، مثل الثقافات الأولية وxenografts، التي تحاكي بشكل وثيق في الجسم الحي السرطان المكروية وذلك لتجنب التغييرات ذات الصلة في الخصائص الخلوية الناجمة عن فترات طويلة من زراعة الخلايا والظروف والثقافة. 32 اللافت للنظر، ويمكن تطبيق بروتوكول لدينا أيضا إلى الخلايا الأولية، وذلك باستخدام فحوصات السمية الخلوية من أجل تحديد المجراة سابقا IC 50 القيم. الحد الآخر هو أنه منذ عدة آليات المقاومة موجودة لكل دواء مضاد للسرطان، وآليات مماثلة أو مختلفة من المقاومة يمكن أن تتطور في الخلايا المعرضة للعلاجات مماثلة ولكن مستقلة. ولذلك، ينبغي أن استراتيجية اختيار المقارنة تنطوي على اختيارات والتحليلات الموازية، بما في ذلك تحاليل وراثية على المتغيرات الربط، من الخلايا الأبوية نفسها تعامل مع نفس وكيل العلاج الكيميائي.

    jove_content "> يجب أن يهدف النهج إضافية للتحقق من صحة وظيفية في overexpressing البديل لصق من الاهتمام في خطوط الخلايا أو على وجه التحديد downregulate التعبير عنها باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي أو أليغنوكليوتيد تبديل لصق 33.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
    2. McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
    3. Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
    4. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
    5. Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
    6. Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
    7. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
    8. Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
    9. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
    10. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
    11. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
    12. Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
    13. Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
    14. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
    15. Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
    16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
    17. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
    18. Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
    19. Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
    20. Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
    21. Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
    22. Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
    23. McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
    24. Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
    25. Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
    26. Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
    27. Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
    28. Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
    29. Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
    30. Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
    31. Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
    32. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
    33. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
    34. Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).

    Tags

    أبحاث السرطان، العدد 118، والعلاج الكيميائي والمقاومة والسمية الخلوية، الربط البديلة، RNA وما يليها، transcriptomics
    باستخدام الحمض النووي الريبي لكشف التسلسل رواية لصق المتغيرات ذات الصلة لمقاومة المخدرات في<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج السرطان
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A.,… More

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter