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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

उपन्यास ब्याह वेरिएंट में दवा प्रतिरोध करने के लिए संबंधित का पता लगाने के लिए शाही सेना अनुक्रमण का उपयोग Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54714
Automatic Translation
1,2,3, 1, 4, 3, 5, 6, 1,7, *1, *3,8,9
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल ठोस ट्यूमर और कैंसर hematological में दवा प्रतिरोध पर न्यायपालिका splicing के प्रभाव की जांच करने के उद्देश्य का वर्णन है। इस लक्ष्य के लिए, हम शाही सेना seq के माध्यम से माता पिता और इन विट्रो में प्रतिरोधी मॉडल के transcriptomic प्रोफाइल विश्लेषण किया है और उम्मीदवार जीन मान्य करने के लिए एक QRT- पीसीआर आधारित पद्धति की स्थापना की।

Abstract

ड्रग प्रतिरोध दोनों hematological कैंसर और ठोस ट्यूमर के लिए कैंसर के इलाज में एक बड़ी समस्या बनी हुई है। आंतरिक या अधिग्रहण प्रतिरोध वृद्धि की दवा उन्मूलन सहित तंत्र की एक श्रृंखला की वजह से हो सकता है, दवा तेज, दवा निष्क्रियता और नशीली दवाओं के लक्ष्यों के परिवर्तन में कमी आई है। हाल के आंकड़ों से पता चला है कि अन्य की तुलना में अच्छी तरह से जाना जाता है आनुवंशिक (उत्परिवर्तन, प्रवर्धन) और epigenetic (डीएनए hypermethylation, हिस्टोन बाद translational संशोधन) संशोधन के द्वारा, दवा प्रतिरोध तंत्र भी splicing aberrations द्वारा विनियमित किया जा सकता है। यह जांच कि आदेश में और अधिक प्रभावी चिकित्सकीय दृष्टिकोण की योजना बनाने में भविष्य ध्यान देने योग्य है की एक तेजी से बढ़ता क्षेत्र है। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल ठोस ट्यूमर और कैंसर hematological में दवा प्रतिरोध पर न्यायपालिका splicing के प्रभाव की जांच के उद्देश्य से है। इस लक्ष्य के लिए, हम शाही सेना seq और स्थापित के माध्यम से इन विट्रो मॉडल में कई की transcriptomic प्रोफाइल विश्लेषण कियाएड एक QRT- पीसीआर आधारित पद्धति उम्मीदवार जीन मान्य करने के लिए। विशेष रूप से, हम DDX5 और PKM टेप के अंतर splicing मूल्यांकन किया है। न्यायपालिका splicing कम्प्यूटेशनल उपकरण मैट द्वारा पता लगाया leukemic कोशिकाओं में मान्य किया गया था, दिखा रहा है कि विभिन्न DDX5 ब्याह वेरिएंट पैतृक बनाम प्रतिरोधी कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं। इन कोशिकाओं में, हम भी एक उच्च PKM2 / PKM1 अनुपात है, जो माता पिता का Panc-1 कोशिकाओं की तुलना में Panc-1 Gemcitabine प्रतिरोधी समकक्ष में पता नहीं था मनाया, दवा प्रतिरोध Gemcitabine जोखिम से प्रेरित का एक अलग तंत्र का सुझाव दे।

Introduction

कैंसर उपचार, रसायन चिकित्सा के लिए घातक कोशिकाओं की प्रतिरोध, या तो आंतरिक या लंबे समय तक दवा जोखिम पर हासिल कर लिया करने में काफी प्रगति के बावजूद, ल्यूकेमिया और ठोस ट्यूमर 1 की एक विस्तृत श्रृंखला में उपचार विफलता के लिए प्रमुख कारण है।

आदेश अंतर्निहित दवा प्रतिरोध तंत्र, इन विट्रो सेल लाइन मॉडल में चित्रित करने में एजेंटों के लिए प्रतिरोधी कैंसर की कोशिकाओं की चरणबद्ध सेलेक्शन विकसित कर रहे हैं। यह प्रक्रिया नैदानिक ​​सेटिंग में इस्तेमाल किया व्यवस्थाओं mimics और इसलिए प्रासंगिक प्रतिरोध तंत्र की गहराई से जांच में अनुमति देता है। प्रतिरोधी कोशिकाओं जो उपचार के जीवित रहने तब सेल व्यवहार्यता / cytotoxicity assays 2 का उपयोग करके पैतृक संवेदनशील कोशिकाओं से प्रतिष्ठित हैं। प्राथमिक कोशिकाओं की इन विट्रो दवा प्रतिरोध प्रोफाइल में काफी कीमोथेरेपी से 3 नैदानिक प्रतिक्रिया से संबंधित होना दिखाया गया है।

उच्च throughput cytotoxicity assays इन विट्रो में दवा संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका गठन। इस के साथ साथ, कोशिकाओं की व्यवहार्यता द्वारा मूल्यांकन किया है, उदाहरण के लिए 3 [4,5-dimethylthiazol-2-YL] -2,5-diphenyl tetrazolium ब्रोमाइड - MTT परख 4, जो कुछ substrates के चयापचय रूपांतरण (यानी के आधार पर किया जाता है, tetrazolium लवण) रंग उत्पादों में है, जिससे कोशिकाओं के mitochondrial गतिविधि को दर्शाती है। वैकल्पिक रूप से, सेलुलर प्रोटीन सामग्री sulforhodamine बी (एसआरबी) परख 5 का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इधर, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य में मापा के लिए आनुपातिक है, की कोई जरूरत के साथ व्यापक और समय लेने वाली सेल गिनती प्रक्रियाओं। एक निश्चित chemotherapeutic दवा से प्रेरित विकास निषेध कुओं जो कोशिकाओं अनुपचारित नियंत्रण कक्षों के आयुध डिपो के साथ तुलना में एक परीक्षण एजेंट के साथ इलाज किया गया और के आयुध डिपो के आधार पर गणना की जा सकती है। एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र obta हैकोशिकाओं को नियंत्रित करने के रिश्तेदार व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत की तुलना में दवा सांद्रता साजिश रचने के द्वारा ined। अंत में, दवा संवेदनशीलता एकाग्रता अनुपचारित कोशिकाओं (आईसी 50) की तुलना में है कि सेल विकास निषेध के 50% में परिणाम के रूप में सूचना दी जा सकती है।

अंतर्निहित तंत्र दवा प्रतिरोध ऐसी दवा गतिविधि और सेलुलर चयापचय के निर्धारकों के जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने परिवर्तन के रूप में कई अलग अलग असामान्यताओं, शामिल हैं। म्यूटेशन, aberrations एक ट्रांसक्रिप्शनल पर और बाद ट्रांसक्रिप्शनल स्तर के रूप में अच्छी तरह से परेशान epigenetic विनियमन सहित इन आणविक घावों, अक्सर या तो दवा चयापचय या apoptosis 6 में शामिल जीन प्रभावित करते हैं।

वैकल्पिक पूर्व mRNA splicing और अपनी जटिल विनियमन हाल ही में एक उपन्यास इकाई है कि कैंसर कोशिकाओं 7 की दवा प्रतिरोध हुक्म हो सकता है के रूप में काफी ध्यान दिया है। मानव जीन के 95% अप करने के लिए वैकल्पिक रूप से इस के माध्यम से सामान्य कोशिकाओं में spliced ​​रहे हैंकसकर विनियमित प्रक्रिया है जो एक ही जीन से कई अलग अलग प्रोटीन isoforms पैदा करता है। वैकल्पिक splicing अक्सर कैंसर में नियंत्रण मुक्त किया जाता है और कई ट्यूमर दवा चयापचय (यानी, deoxycytidine काइनेज, folylpolyglutamate synthetase, या बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन) 6.8 में शामिल जीनों की बढ़ती संख्या की बदल splicing की विशेषता है। हालांकि, दवा प्रतिरोधी कोशिकाओं की splicing प्रोफाइल के व्यापक विश्लेषण दर्द की कमी है। इसलिए, यह वैकल्पिक splicing विश्लेषण के लिए उच्च तरीकों को विकसित करने के लिए आवश्यक है। यह और अधिक प्रभावी चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने में मदद कर सकता है।

पिछले दशक के दौरान, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्रौद्योगिकियों का तेजी से विकास जीनोम अभिव्यक्ति के नियमन और विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं 9 में उनकी भूमिका के शासी आणविक तंत्र में नए अंतर्दृष्टि के साथ जैव चिकित्सा अनुसंधान को समृद्ध बनाया है। शाही सेना अनुक्रमण (आरएनए-सेक) एक शक्तिशाली उप-अनुप्रयोग हैtranscriptomics के क्षेत्र में NGS की। यह एक जीनोम चौड़ा रूपरेखा (दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक) एक साथ जीनों के हजारों की अभिव्यक्ति पैटर्न की अनुमति देता है और अच्छी तरह से उपन्यास कोडिंग mRNAs के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है और साथ ही लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए है, miRNA, siRNA, और अन्य छोटे आरएनए वर्गों (जैसे, snRNA और Pirna) 10,11।

शाही सेना Seq transcriptome लक्षण वर्णन (जैसे, सेंगर अनुक्रमण और अभिव्यक्ति प्रोटीन) के लिए पिछले प्रौद्योगिकियों पर कई फायदे हैं। यह मौजूदा जीनोम एनोटेशन पर आधारित नहीं है, यह संकल्प की एक एकल न्यूक्लियोटाइड स्तर है और यह अभिव्यक्ति के स्तर के आकलन के लिए एक व्यापक गतिशील रेंज है। संक्षेप में, शाही सेना seq प्रयोगों के बुनियादी प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह polyadenylated प्रतिलेख (mRNA) के चयन और विखंडन, सीडीएनए, पुस्तकालय निर्माण और अंत में, व्यापक समानांतर गहरी अनुक्रमण 12,13 में रूपांतरण के द्वारा पीछा के होते हैं। sequencin का तेजी से गिरावट की वजहपिछले कुछ वर्षों में, शाही सेना seq खत्म जी लागत धीरे-धीरे अन्य प्रौद्योगिकियों की जगह है और महत्वपूर्ण प्रयास पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल में सुधार के लिए किए जा रहे हैं। उदाहरण के लिए, यह अब डिऑक्सीयूरिडीन triphosphate (dUTP) और पीसीआर प्रवर्धन करने से पहले, uracil-डीएनए glycosilase (UDG) से चिह्नित कतरा पचाने के साथ दूसरे कतरा सीडीएनए अंकन द्वारा mRNA टेप का किनारा जानकारी बनाए रखने के लिए संभव है। इस प्रक्रिया जीन एनोटेशन और अभिव्यक्ति के स्तर 14,15 के आकलन की सटीकता को बढ़ाता है।

विश्लेषण और आरएनए seq डेटा की व्याख्या bioinformatic पाइपलाइनों 16,17 के भीतर जटिल और शक्तिशाली कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर संकुल और प्रसंस्करण की आवश्यकता है। सबसे पहले, कच्चे तकनीकी और जैविक कलाकृतियों दृश्यों जो कड़े गुणवत्ता की आवश्यकताओं तक पहुँच नहीं है हटाने और discarding (trimming) द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण से गुजरना पढ़ता है। इसके बाद प्रत्येक नमूना के लिए पढ़ता है एक संदर्भ जीनोम के लिए मैप और अनुक्रमित रहे हैंजीन-स्तर, एक्सॉन-स्तर, या प्रतिलिपि-स्तर में, क्रम में प्रत्येक वर्ग की बहुतायत निर्धारित करने के लिए। आवेदन के आधार पर, परिष्कृत डेटा तो एलील विशिष्ट अभिव्यक्ति, वैकल्पिक splicing है, जीन fusions और एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs) 12 की पहचान के लिए सांख्यिकीय मॉडल के माध्यम से गणना कर रहे हैं। अंत में, चयनित स्तर (यानी, जीन अभिव्यक्ति या वैकल्पिक splicing) पर अंतर विश्लेषण विभिन्न शर्तों के तहत प्राप्त नमूनों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

विभेदक splicing विश्लेषण दो नमूनों के बीच ब्याह साइट के उपयोग में मतभेद का वर्णन है। इस उद्देश्य के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर संकुल की संख्या बढ़ रही विभिन्न सांख्यिकीय मॉडल, प्रदर्शन और यूजर इंटरफेस 18 के आधार पर उपलब्ध हैं। इन के अलावा, मैट (ट्रांसक्रिप्ट splicing की बहुभिन्नरूपी विश्लेषण) एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध और सटीक कम्प्यूटेशनल एक Bayesian सांख्यिकीय ढांचे पर आधारित उपकरण के रूप में उभर रहे हैं और diffe पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गयाया तो एक या बनती अंत शाही सेना seq डेटा से rential splicing घटनाओं। गठबंधन (.bam) फ़ाइलों से शुरू, मैट वैकल्पिक splicing घटनाओं के सभी प्रमुख प्रकार का पता लगाने कर सकते हैं (एक्सॉन लंघन, वैकल्पिक 3 'ब्याह साइट, वैकल्पिक 5' ब्याह साइट, परस्पर अनन्य एक्सॉनों और Intron प्रतिधारण - भी चित्रा 1 देखें)।

पहला, सॉफ्टवेयर को दिखाता है जो एक निश्चित ब्याह घटना का समर्थन है, उदाहरण के एक्सॉन लंघन के लिए पढ़ता है, और उन्हें दो प्रकार में वर्गीकृत किया। "समावेशन पढ़ता है" (विहित ब्याह के आयोजन के लिए) की जांच की एक्सॉन के भीतर नक्शे और कहा कि विशिष्ट एक्सॉन और दो अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम flanking एक्सॉनों के बीच जंक्शनों अवधि। "लंघन पढ़ता है" (वैकल्पिक ब्याह के आयोजन के लिए) दो flanking एक्सॉनों के बीच जंक्शन अवधि। इसके बाद मैट दोनों विहित और वैकल्पिक घटनाओं के लिए सामान्यीकृत शामिल किए जाने के स्तर देता है और नमूने या स्थितियों के बीच मूल्यों तुलना करती है। अंत में, यह गणना पी-मूल्य एकएन डी झूठे खोज दर (एफडीआर) यह सोचते हैं कि दो स्थितियों के बीच एक जीन के संस्करण अनुपात में अंतर प्रत्येक splicing घटना 19,34 के लिए एक दिया उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित सीमा से अधिक है।

शाही सेना seq के साथ संयोजन के रूप में अंतर splicing विश्लेषण के बाद, एक व्यापक प्रायोगिक सत्यापन के क्रम में सच पॉजिटिव जीन उम्मीदवारों में 18 की पहचान करने में warranted है। मात्रात्मक रिवर्स लिखित-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT- पीसीआर) शाही सेना Seq विश्लेषण 20 से प्राप्त उम्मीदवारों के सत्यापन में सबसे अधिक इस्तेमाल किया और इष्टतम तरीका है। इस पेपर का उद्देश्य ठोस ट्यूमर और कैंसर hematological में दवा प्रतिरोध संबंधी splicing प्रोफाइल की जांच करने के लिए एक मजबूत कार्यप्रणाली प्रदान करना है। हमारा दृष्टिकोण दवा प्रतिरोध में फंसा उम्मीदवार जीन की मान्यता के लिए एक स्थापित QRT- पीसीआर विधि के साथ संयोजन में दवा प्रतिरोधी कैंसर के चयनित कक्ष लाइन मॉडल की शाही सेना seq आधारित transcriptome की रूपरेखा का इस्तेमाल करता है।

21,22 और methotrexate (MTX) प्रतिरोधी SUBLINE यूके / R30dm 23। हालांकि वर्तमान जेंटलमैन कैडेट और MTX पर आधारित चिकित्सा मामलों के 90% के बारे में नैदानिक ​​लाभ की स्थापना, जीसी प्रतिरोध के उद्भव अभी भी एक अस्पष्ट आणविक तंत्र के साथ एक अनसुलझी समस्या का प्रतिनिधित्व करता है। जीसी प्रतिरोधी उप क्लोन को अलग-थलग करने के लिए, यूके-WT कोशिकाओं को 2 से 3 सप्ताह के लिए 1 माइक्रोन dexamethasone (डेक्स) में सुसंस्कृत थे। MTX-प्रतिरोधी SUBLINE यूके / R30dm दोहराया लघु अवधि (24 घंटे) नैदानिक ​​प्रोटोकॉल की एक नकल के रूप में 30 माइक्रोन के MTX को यूके-WT कोशिकाओं के संपर्क के माध्यम से विकसित किया गया था। दिलचस्प है, यह सेल लाइन भी है जिसके लिए तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं है (अप्रकाशित परिणाम) डेक्स को पार प्रतिरोध का प्रदर्शन किया।

ठोस Tumया मॉडल वर्तमान अध्ययन में जांच अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता, रसायन चिकित्सा के लिए अपनी असाधारण दुराग्रह के लिए कुख्यात है। यह अंत करने के लिए, हम Panc-1 सेल लाइन और उसके Gemcitabine प्रतिरोधी उप क्लोन Panc-1R दवा 24 से 1 माइक्रोन के साथ निरंतर ऊष्मायन द्वारा प्राप्त का चयन किया। यहाँ हम तीन प्रोटोकॉल के संयोजन से इन विट्रो दवा प्रतिरोध अंतर्निहित उपन्यास तंत्र की खोज के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन: वर्णमिति cytotoxicity assays leukemic कोशिकाओं और ठोस ट्यूमर, शाही सेना seq आधारित पाइपलाइन से कैंसर की कोशिकाओं में दवा संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए संबंधित उपन्यास ब्याह वेरिएंट की पहचान करने के लिए दवा संवेदनशीलता / प्रतिरोध और आरटी पीसीआर और QRT- पीसीआर विश्लेषण संभावित उम्मीदवारों को मान्य।

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Protocol

Cytotoxicity assays के माध्यम से दवा प्रतिरोध प्रोफाइल की विशेषता 1.

  1. लयूकेमिक सेल लाइन संस्कृति
    1. माता पिता का टी सेल सभी सेल लाइन CCRF-यूके (यूके-WT) के साथ ही यूके / R30dm, CEM-R5 और यूके-सी 3 सहित अपनी दवा प्रतिरोधी sublines, 25 सेमी 2 में 10 मिलीलीटर RPMI 1640 मध्यम में युक्त बनाए रखें 2.3 माइक्रोन के फोलिक एसिड 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और 100 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन जी और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
    2. संस्कृति एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified वातावरण में कोशिकाओं।
    3. 3 एक्स 10 6 सेल / एमएल - 2 के बीच सांद्रता के लिए सेल के विकास की अनुमति दें।
    4. 0.3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक प्रारंभिक एकाग्रता में एक सप्ताह में दो बार कोशिकाओं को विभाजित (जैसे, सेल एकाग्रता 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल, 9 मिलीलीटर युक्त ताजा माध्यम से एक नई कुप्पी में स्थानांतरण 1 मिलीलीटर सेल निलंबन है)। लगातार 20 मार्ग के बाद संस्कृति त्यागें।
    अग्नाशय कार्सिनोमा सेल लाइन संस्कृति
    नोट: 10 मिलीलीटर उच्च ग्लूकोज और एल Glutamine 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन जी और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक के साथ DMEM माध्यम में मानव अग्नाशय कार्सिनोमा सेल लाइन Panc-1 75 2 सेमी संस्कृति बोतल में बनाए रखें । दवा प्रतिरोधी संस्करण, Panc-1R, 1 माइक्रोन Gemcitabine बाँझ पानी में भंग युक्त एक ही संस्कृति के माध्यम में सुसंस्कृत है। आगे की जानकारी 24 में प्रदान की जाती हैं।
    1. संस्कृति एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं।
    2. 5 जब कोशिकाओं के बारे में 90% के संगम तक पहुँचने: 1 के अनुपात में 3 दिन - हर 2 कोशिकाओं को विभाजित।
    3. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार धोने प्रति 75 सेमी 2 संस्कृति कुप्पी trypsin / EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. 9 मिलीलीटर मध्यम जोड़ें और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अलग कोशिकाओं फसल। एक नई कुप्पी conta में बीज 2 मिलीलीटर सेल निलंबनining 8 मिलीलीटर मध्यम। लगातार 20 मार्ग के बाद संस्कृति त्यागें।
  2. Leukemic कोशिकाओं के लिए MTT परख
    1. पहले से तैयार MTT समाधान: लगभग 1 घंटे के लिए 500 MTT formazan के 10 मिलीलीटर पीबीएस में और हलचल (प्रकाश से सुरक्षित) एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ मिलीग्राम भंग। एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान जीवाणुरहित। नोट: समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर aliquots में संग्रहित किया जा सकता है। विगलन के बाद प्रत्यक्ष प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    2. पहले से तैयार अम्लीय isopropanol: isopropanol के 2.5 एल के लिए 2 एम एचसीएल के 50 मिलीलीटर जोड़ें। ध्यान दें: उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर कम से कम एक महीने के लिए समाधान स्टोर। isopropanol सही ढंग से अम्लीय नहीं है, तो यह माध्यम के साथ अवक्षेप फार्म और spectrophotometric readout समझौता हो सकता है।
    3. एक अलग 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे तैयार "दिवस 0" (नियंत्रण) प्लेट विकास निषेध के और अधिक सटीक अनुमान सुनिश्चित करने के लिए: सेल लाइन के अनुसार 3 से 6 कुओं को समर्पित है, विकास के 30 μl जोड़नेमध्यम और कारतूस (कोई कोशिकाओं) को इसी कुओं के लिए सेल निलंबन (8,000 कोशिकाओं) मध्यम विकास के प्रत्येक अच्छी तरह से और 150 μl प्रति के 120 μl। इस धारा के 1.3.13 कदम करने के लिए ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने के लिए कदम 1.3.9 से आगे बढ़ें। नोट: अधिक जानकारी 4 में प्रदान की जाती हैं।
    4. एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्रयोगात्मक प्लेट तैयार: दवा सांद्रता के लिए 30 कुओं (10 सांद्रता, तीन प्रतियों में प्रत्येक), कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए 10 कुओं और बिना कोशिकाओं (कारतूस) मध्यम नियंत्रित करने के लिए 10 कुओं को समर्पित और dexamethasone की एक दवा कमजोर पड़ने रेंज तैयार ( डेक्स) डाइमिथाइल sulfoxide एक विलायक के रूप में इस्तेमाल करते हैं।
      नोट: यूके-WT कोशिकाओं के लिए डेक्स कमजोर पड़ने रेंज 2 माइक्रोन और 0.97 एनएम के बीच है। यूके / R30dm, CEM-R5 और यूके-सी 3 कोशिकाओं के लिए डेक्स कमजोर पड़ने रेंज 640 सुक्ष्ममापी और 0.33 एनएम के बीच है।
    5. 96 अच्छी तरह से थाली का एक उचित अच्छी तरह से प्रत्येक में डेक्स कमजोर पड़ने से 30 μl जोड़ें। एक तीन प्रतियों में प्रत्येक एकाग्रता शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें।
    6. करने के लिए मध्यम विकास के 30 μl जोड़े अच्छी तरह सेकोशिकाओं और कारतूस के लिए इसी कुओं के लिए मध्यम विकास के 150 μl को नियंत्रित करने के लिए इसी।
    7. हार्वेस्ट तेजी से उनके इष्टतम बोने एकाग्रता में कोशिकाओं और resuspend बढ़ रहा है।
      नोट: आदेश में इष्टतम शुरू सेल सांद्रता निर्धारित करने के लिए, यह कई सांद्रता में कोशिकाओं को बोने और कम से कम 4 दिनों के लिए दैनिक यह मापने के द्वारा एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक कोशिका लाइन सेल लाइन के विकास के प्रोफ़ाइल का आकलन करने के लिए सिफारिश की है। , एक बोने एकाग्रता जो 72 घंटे के बाद कोशिकाओं के अतिवृद्धि रोकता चुनें के रूप में इस आयुध डिपो मूल्यों को संतृप्त द्वारा प्रयोग को प्रभावित करती है। यूके-गुम्मट, CEM-सी 5 और यूके-R5 के लिए इष्टतम बोने एकाग्रता, 8000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से है, जबकि यूके / R30dm के लिए यह 5,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से है।
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त या तो दवा समाधान या मध्यम विकास के लिए सेल निलंबन के 120 μl जोड़ें (कुओं कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए इसी)। 150 μl पीबीएस के साथ थाली के खाली बाहरी कुओं भरें थाली में अच्छा आर्द्रता सुनिश्चित करने और सेते वींएक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए ई प्लेटें।
    9. प्रत्येक अच्छी तरह से MTT समाधान के 15 μl जोड़ें और 900 हिलाता / मिनट की एक अधिकतम करने के लिए एक थाली-प्रकार के बरतन के साथ 5 मिनट के लिए थाली हिला।
    10. प्लेटों 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें और एक और 4 के लिए सेते - 6 घंटा।
    11. प्रत्येक अच्छी तरह से अम्लीय isopropanol के 150 μl जोड़ें और एक मल्टीचैनल विंदुक के साथ मिश्रण अच्छी तरह से अच्छी तरह से सभी formazan क्रिस्टल resuspend। खाली कुओं से शुरू करें और अच्छी तरह से थाली का एक और पंक्ति के लिए आगे बढ़ने से पहले सुझावों के कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित करें।
    12. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर थाली सेते हैं।
    13. एक microplate रीडर का उपयोग कर, 540 और 720 एनएम पर आयुध डिपो का निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए एक सटीक माप पृष्ठभूमि आयुध डिपो के लिए सही करने से। फिर एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में डेटा को बचाने और यह 4 का विश्लेषण।
  3. अग्नाशय कार्सिनोमा कोशिकाओं के लिए SRB परख
    1. 0.4% की अंतिम एकाग्रता में 1% एसिटिक एसिड में SRB अभिकर्मक भंग (डब्ल्यू / वी)।
    2. 50% की अंतिम एकाग्रता में ultrapure पानी में Trichloroacetic एसिड (टीसीए) भंग (डब्ल्यू / वी)।
    3. 10 मिमी के अंतिम एकाग्रता में ultrapure पानी में Tris (hydroxymethyl) -aminomethane भंग।
    4. उचित बोने एकाग्रता में 100 μl मध्यम में घातीय चरण में बढ़ कोशिकाओं के साथ 6 कुओं बीज और केवल कुओं के लिए इसी के लिए 100 μl के माध्यम जोड़ें: विकास निषेध के और अधिक सटीक अनुमान सुनिश्चित करने के लिए एक अलग से 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे "दिवस 0" नियंत्रण थाली तैयार कारतूस। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते थाली करने के लिए कोशिकाओं के समुचित आसंजन सुनिश्चित करने के लिए। तब सभी कुओं के लिए 100 μl मध्यम जोड़ने और कदम 1.4.8 के लिए आगे बढ़ना - 1.4.16 इस धारा के।
    5. एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्रयोगात्मक प्लेट तैयार: बीज कोशिकाओं घातीय चरण में तीन प्रतियों में 96 कुओं में फ्लैट नीचे प्लेटों उचित घनत्व पर मुझे के 100 μl में बढ़ रहा हैएक मल्टीचैनल pipet का उपयोग करके dium।
      नोट: आदेश में इष्टतम शुरू सेल सांद्रता निर्धारित करने के लिए, यह कई सांद्रता में कोशिकाओं को बोने और कम से कम 4 दिनों के लिए दैनिक यह मापने के द्वारा एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक कोशिका लाइन सेल लाइन के विकास के प्रोफ़ाइल का आकलन करने के लिए सिफारिश की है। , एक बोने एकाग्रता जो 72 घंटे के बाद कोशिकाओं के अतिवृद्धि रोकता चुनें के रूप में इस आयुध डिपो मूल्यों को संतृप्त द्वारा प्रयोग को प्रभावित करती है। Panc-1 और Panc-1R कोशिकाओं के लिए, इष्टतम बोने एकाग्रता 8000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से है।
    6. मध्यम केवल कुओं के लिए 100 μl मध्यम जोड़ें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते थाली करने के लिए कोशिकाओं के समुचित आसंजन सुनिश्चित करने के लिए।
    7. Panc-1 और 1 मिमी और Panc-1R कोशिकाओं के लिए 100 एनएम के लिए 1 माइक्रोन और 10 एनएम के बीच Gemcitabine की एक दवा कमजोर पड़ने रेंज तैयार करें। एक मल्टीचैनल pipet का उपयोग करके 96 अच्छी तरह से थाली का एक उचित अच्छी तरह से में प्रत्येक कमजोर पड़ने से 100 μl जोड़ें। तीन प्रतियों में प्रत्येक एकाग्रता के लिए सुनिश्चित करें। इसके साथ - साथ,मध्यम केवल कुओं और नियंत्रण कक्षों के लिए 100 μl के माध्यम जोड़ें। 72 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. कुओं के लिए 25 μl ठंड टीसीए समाधान आदेश वेग और कुओं के नीचे प्रोटीन को ठीक करने में 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 60 मिनट के लिए एक मल्टीचैनल pipet का उपयोग करके जोड़े और प्लेटें सेते हैं।
    9. एक ऊतक पर मध्यम और सूखी संक्षेप हटाने के द्वारा थाली खाली।
    10. नल के पानी के साथ 5 बार धोएं, तो थाली खाली और कमरे के तापमान पर सूखी।
    11. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक दोहराने-pipet और दाग का उपयोग करके अच्छी तरह से प्रति 50 μl SRB समाधान जोड़ें।
    12. SRB दाग को हटाने के द्वारा थाली खाली।
    13. 1% एसिटिक एसिड के साथ 4 बार धोएं, तो थाली खाली है और यह कमरे के तापमान पर सूखी।
    14. एक मल्टीचैनल pipet का उपयोग करके अच्छी तरह से प्रति 150 μl Tris समाधान जोड़ें और 900 हिलाता / मिनट की एक अधिकतम करने के लिए एक थाली-प्रकार के बरतन पर 3 मिनट के लिए मिश्रण।
    15. 540 एनएम (या 492 एनएम पर अगर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें टीवह आयुध डिपो मूल्यों बहुत अधिक हैं)।
    16. डेटा का विश्लेषण।
  4. MTT और SRB Assays के लिए डेटा विश्लेषण
    1. "दिवस 0" पर कोशिकाओं के आयुध डिपो मूल्यों की गणना निम्न सूत्र का उपयोग: आयुध डिपो दिवस 0 = आयुध डिपो नियंत्रण कक्षों - औसत आयुध डिपो खाली कुओं
    2. निम्न सूत्र के अनुसार प्रत्येक दवा एकाग्रता के लिए जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना:% इलाज किया कोशिकाओं = औसत [आयुध डिपो इलाज किया कोशिकाओं - औसत आयुध डिपो खाली कुओं - आयुध डिपो दिवस 0] / [आयुध डिपो नियंत्रण कक्षों - औसत आयुध डिपो खाली कुओं - आयुध डिपो Day0] * 100
    3. खुराक प्रतिक्रिया वक्र (दवा एकाग्रता बनाम% में विकास निषेध) प्लॉट।
    4. दवा है जो 50% से कोशिकाओं के विकास को रोकता है (आईसी 50) खुराक प्रतिक्रिया वक्र का उपयोग करने की एकाग्रता की गणना।

2. शाही सेना अलगाव और पुस्तकालय तैयारी शाही सेना अनुक्रमण के लिए

  1. नमूना Collection और आरएनए अलगाव
    1. यूके कोशिकाओं के लिए: संस्कृति के माध्यम से सीधे फसल 10 6 कोशिकाओं।
    2. Panc-1 और Panc-1R के लिए: मध्यम हटाने कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोने और trypsin-EDTA जोड़ने और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा अलग। संस्कृति के माध्यम जोड़ें और 10 6 कोशिकाओं फसल।
    3. 3 मिनट के लिए 300 XG पर नमूने स्पिन, तैरनेवाला निकालें और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिका झिल्ली स्पिन स्तंभों का उपयोग निर्माता की प्रोटोकॉल का पालन करते हुए कुल mRNA निकाल सकते हैं।
    4. एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता और कुल शाही सेना की शुद्धता निर्धारित करते हैं।
      नोट: यदि 260 एनएम / 280 एनएम absorbance के अनुपात 1.8 से ऊपर है आरएनए उच्च शुद्धता का माना जाता है। 80 डिग्री सेल्सियस - नमूने संग्रहीत किया जा सकता।
    5. 1% agarose जेल ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग पर नमूने के 200 एनजी के वैद्युतकणसंचलन द्वारा कुल शाही सेना अखंडता का आकलन करें।
      नोट: लगभग स्तनधारी 28S और 18S rRNAs को इसी दो बरकरार बैंड का पता लगाने के2 KB और 1 केबी आकार में अच्छा कुल शाही सेना अखंडता का संकेत है।
  2. अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी
    1. प्रत्येक नमूना प्रति कुल mRNA की 2 माइक्रोग्राम का प्रयोग करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार mRNA पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल का पालन करें।
    2. एक bioanalyzer प्रणाली का उपयोग करके गुणवत्ता और प्रत्येक पुस्तकालय की एकाग्रता का निर्धारण। 10 nmol / एल के अंतिम एकाग्रता के लिए एक भी नमूना अप में पुस्तकालयों पूल और bioanalyzer साथ यह उपाय।
    3. एकल पढ़ें 100 बीपी मोड के साथ उच्च throughput अनुक्रमण प्रणाली का प्रयोग करें।
      नोट:> 80 बीपी की लंबाई पढ़ें ट्रांसक्रिप्शनल isoforms की पहचान करने के लिए आवश्यक है।

3. अंतर Splicing की जांच अनुक्रमण पढ़ता से

  1. के संरेखण संदर्भ के लिए जीनोम और गुणवत्ता की जांच पुस्तकें
    1. UCSC तालिका ब्राउज़र (25,963 जीन) का उपयोग एन सी बी आई refGene मेज से एक जीन एनोटेशन (.gtf फाइल) संकलित करें।
    2. निष्पादित करेंएनोटेशन जागरूक अनुक्रमण के दरारयुक्त संरेखण संदर्भ जीनोम (GRCh37) स्टार का उपयोग करने में पढ़ता है।
    3. क्रमबद्ध और सूचकांक पिकार्ड उपकरणों के साथ जिसके परिणामस्वरूप संरेखण फ़ाइलें।
    4. RSeQC और samtools का उपयोग करके पोस्ट-मानचित्रण गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन करना।
  2. नमूना समूहों के बीच अंतर का पता लगाने Splicing
    1. अजगर और NumPy और SciPy की इसी संस्करणों को स्थापित करें। डाउनलोड करें और samtools स्थापित करें। डाउनलोड करें और bowtie और Tophat स्थापित है,
    2. $ पथ वातावरण चर को अजगर, bowtie, Tophat और samtools निर्देशिका जोड़ें। डाउनलोड पूर्व निर्मित bowtie अनुक्रमित (hg19)। rMATS संस्करण 3.0.9 डाउनलोड।
      नोट: rMATS के बारे में आगे की जानकारी 19 और 34 में प्रदान की जाती हैं।
    3. अलग मैट में Panc-1R को यूके-WT और Panc-1 के लिए प्रत्येक डेक्स प्रतिरोधी सेल लाइन की तुलना द्वारा वैकल्पिक splicing घटनाओं का पता लगाने चित्रा 5 ए के अनुसार चलता है।
    4. previo से अंतर splicing घटनाओं का पता लगाने के लिएusly गठबंधन अनुक्रमण पढ़ता (.bam फ़ाइलें), मैट चलाने CEM-गुम्मट बनाम CEM- सी 3, यूके-WT बनाम यूके-R5, यूके-WT बनाम यूके / R30dm और Panc1 के लिए चित्रा 5 ब से आदेशों का उपयोग करने के लिए Panc- 1R तुलना।
      नोट: मैट splicing घटना के प्रकार का विश्लेषण किया प्रति परिणामों के साथ दो .txt फाइलों के साथ एक आउटपुट फ़ोल्डर पैदा करेगा (एसई - एक्सॉन लंघन, A5SS - वैकल्पिक 5 'ब्याह साइट, A3SS - वैकल्पिक 3' ब्याह साइट, MEX - परस्पर अनन्य एक्सॉनों और आरआई - Intron प्रतिधारण): एक फ़ाइल युक्त परिणाम केवल जंक्शन मायने रखता है और जंक्शन मोर्चों पर आधारित परिणामों के साथ एक दूसरे फ़ाइल पर आधारित है और लक्ष्य पर पढ़ता है। इसके अलावा, एक परिणाम के अवलोकन के साथ एक अतिरिक्त .txt फ़ाइल एक ही फ़ोल्डर में उत्पन्न होता है।
    5. एसई, A5SS, A3SS और आरआई आयात .txt जंक्शन मोर्चों पर आधारित फ़ाइलों स्प्रेडशीट और लक्ष्य पर पढ़ता करने के लिए। MEX लिए .txt जंक्शन मायने रखता है ही पर आधारित फ़ाइलें आयात करते हैं।
      नोट: जीन आईडी, जीन प्रतीक: मैट आउटपुट फ़ाइल पी मूल्यों और आरोही द्वारा हल है कई मानकों में शामिलगुणसूत्र और कतरा स्थिति, वैकल्पिक रूप से spliced ​​टुकड़े के जीनोमिक निर्देशांक, शामिल किए जाने की लंबाई के साथ ही मायने रखता है और दोनों का विश्लेषण किया नमूने के लिए रूपों, शामिल किए जाने की लंबाई लंघन और सामान्य, पी मूल्य, झूठे खोज दर के लिए इस्तेमाल किया रूप लंघन (एफडीआर ), सामान्यीकृत मायने रखता है और अंतर शामिल किए जाने के स्कोर (औसत (IncLevel1) के आधार पर प्रत्येक नमूना के लिए शामिल किए जाने के स्तर - औसत (IncLevel2))।
    6. एक एफडीआर <आगे की मान्यता (जैसे, DDX5 और PKM2) के लिए 10% के साथ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण उम्मीदवार जीन का चयन करें।
    7. एकीकृत जीनोमिक्स दर्शक के साथ वैकल्पिक splicing घटनाओं कल्पना (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), के रूप में चित्रा 5 में सूचना दी।

4. आरटी पीसीआर और QRT- पीसीआर assays के द्वारा परिणाम मान्यकरण

  1. प्रथम डिजाइन
    नोट: bioinformatic पाइप लाइन, mRNA ट्रांस का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के एक विश्वसनीय मान्यता प्रदान करने के लिएवैकल्पिक splicing घटनाओं से उत्पन्न cripts आरटी पीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धित और पीसीआर उत्पादों की agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा कल्पना कर रहे हैं। जाती हरे रंग के इस तरह के SYBR के रूप में हरी QRT- पीसीआर परख विशिष्ट ब्याह यों इस्तेमाल किया जाता है कि एक जीन गृह व्यवस्था के सापेक्ष वेरिएंट। चित्रा 7 रणनीति DDX5 जीन की एक्सॉन 12 लंघन घटना कल्पना करने के लिए और PKM जीन की परस्पर अनन्य एक्सॉन 9 और एक्सॉन 10 यों के लिए आवेदन किया दर्शाया गया है।
    1. आरटी पीसीआर परख के लिए, डिजाइन प्राइमर जोड़े विधान एक्सॉनों (एक्सॉन 10 और एक्सॉन 13) नदी के ऊपर और नीचे की ओर स्थित वैकल्पिक splicing साइटों (चित्रा 7A) के लिए जो पानी रखना।
      नोट: amplicon आकार आदेश agarose जेल पर भविष्यवाणी की पीसीआर उत्पादों की एक स्पष्ट विभाजन सुनिश्चित करने के लिए 100 और 800 के बीच बीपी को कवर करना चाहिए। प्राइमरों की annealing तापमान होना चाहिए 55 और 65 सी और जी सी सामग्री के बीच ° 60% से अधिक नहीं होना चाहिए।
    2. जाती हरी परख (चित्रा 7B)। दो परस्पर अनन्य एक्सॉनों और डिजाइन दो प्राइमर जोड़े जिनमें से प्रत्येक विशेष के अनुक्रम अनुरूपता चेक करें और विशेष रूप से केवल दो ब्याह वेरिएंट में से एक का पता लगाता है।
      नोट: PKM के लिए, रिवर्स प्राइमर 11 दोनों वेरिएंट के लिए आम एक्सॉन के लिए, जबकि anneals आगे प्राइमरों संस्करण विशेष और पानी रखना एक्सॉन के लिए 9 (PKM1) या एक्सॉन 10 (PKM2) कर रहे हैं।
    3. आदेश DDX5 पूर्ण लंबाई जीन का पता लगाने के लिए, छोड़ एक्सॉन (एक्सॉन 12) के भीतर रिवर्स प्राइमर पानी रखना।
      नोट: DDX5 ΔEx12 संस्करण की विशिष्ट पहचान के लिए, रिवर्स प्राइमर exon11 / exon13 सीमा तक फैला है। एक ही आगे प्राइमर जो दोनों प्रतिक्रियाओं के लिए विधान एक्सॉन 10 anneals का प्रयोग करें।
      ध्यान दें: amplicon आकार 80 और 200 बीपी के बीच होना चाहिए।
  • पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण
    1. 200 यू Moloney Murine लेकिमिया वायरस का / μl (एम-MLV) लौ का उपयोग करके सीडीएनए के लिए पृथक शाही सेना के 1 माइक्रोग्राम के रिवर्स प्रतिलेखन सेट अपबाँझ पानी के साथ 5: अपनी प्रतिक्रिया बफर में एसई ट्रांसक्रिप्टेज 1 पतला। डीटीटी 1 माइक्रोन, यादृच्छिक hexamers के 0.05 माइक्रोग्राम, deoxynucleotide मिश्रण (dNTP) 1 मिमी, और 40 यू / ribonuclease अवरोध के μl जोड़ें।
    2. भंवर संक्षिप्त और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
    3. 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते 5 मिनट, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस निष्क्रिय करने के लिए बर्फ पर मिश्रण हस्तांतरण और एक microcentrifuge का उपयोग करके नीचे स्पिन के लिए। नमूने तुरंत इस्तेमाल किया या कम से संग्रहित किया जा सकता है - 20 डिग्री सेल्सियस।
  • आरटी पीसीआर रिएक्शन और agarose जेल
    1. 2x की 12.5 μl मिश्रण से प्रत्येक नमूना प्रति एक पीसीआर ट्यूब में पीसीआर प्रतिक्रिया सेट अप पीसीआर mastermix, 10 माइक्रोन के आगे प्राइमर और बाँझ पानी के साथ 25 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए रिवर्स प्राइमर के लिए एक ही राशि के 1.25 μl ध्यान केंद्रित किया।
    2. मिश्रण करने के लिए सीडीएनए के 1 μl जोड़ें और thermocycler में ट्यूबों की जगह। कार्यक्रम चलाने के लिए इस प्रकार है: प्रारंभिक विकृतीकरण: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।25 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण;: 35 चक्र के लिए निम्नलिखित कदम को दोहराते 35 सेकंड के लिए 52 डिग्री सेल्सियस पर annealing; 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार। 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार सेट करें।
    3. TBE बफर 1x 100 मिलीलीटर में agarose की 1 ग्राम भंग करके 1% agarose जेल तैयार करें। समाधान के लिए ethidium ब्रोमाइड के 2.5 μl जोड़ें। चेतावनी: ethidium ब्रोमाइड कैंसर है, एक रासायनिक धूआं हुड का उपयोग करके देखभाल के साथ संभाल।
    4. नमूने लोड और एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में लगभग 30 मिनट के लिए 100 वी पर 1x TBE बफर में जेल चला रहे हैं।
    5. एक डिजिटल कैमरा के साथ यूवी जेल पता चलता है और छवि को बचाने के।
  • QRT- पीसीआर और डेटा विश्लेषण
    1. ऊपर एक पीसीआर ट्यूब में बाँझ पानी के साथ 15 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए 2x हरी पीसीआर MasterMix की 12.5 μl, 5 माइक्रोन के आगे प्राइमर के 2 μl और रिवर्स प्राइमर के लिए एक ही राशि के मिश्रण से प्रत्येक नमूना प्रति जाती हरी पीसीआर प्रतिक्रिया सेट अप । प्रत्येक विशिष्ट ब्याह के लिए एक मिश्रण तैयार करेंसंस्करण का पता लगाया जा करने के लिए (PKM1, PKM2, DDX5 पूर्ण लंबाई, DDX5 ΔEx12) और गृह व्यवस्था जीन के लिए (गस)।
    2. एक सफेद 96 अच्छी तरह से थाली पर mastermix लोड और प्रत्येक नमूना प्रति डुप्लिकेट तैयार करते हैं।
    3. पानी में सीडीएनए 10x पतला प्रत्येक मिश्रण करने के लिए 5 μl जोड़ें और thermocycler में थाली जगह है। कार्यक्रम चलाने के लिए इस प्रकार है: प्रारंभिक विकृतीकरण: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस। 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण;: 45 चक्र के लिए निम्नलिखित कदम को दोहराते 58 डिग्री सेल्सियस (DDX5 के लिए और DDX5 ΔEx12 घोला जा सकता है) या 20 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस (PKM1 और PKM2 के लिए घोला जा सकता है) पर annealing। 20 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार सेट करें। 65 से 97 डिग्री सेल्सियस के लिए एक ढाल लगाने से वक्र पिघलने सेट करें।
    4. आदेश में अपने लक्ष्य के लिए प्राइमर सेट की विशिष्टता का आकलन करने के लिए, पिघलने घटता जाँच करें और सत्यापित करें कि एक भी चोटी प्रत्येक प्राइमर सेट के अनुसार बनाई है।
    5. प्रवर्धन घटता के दूसरे व्युत्पन्न मूल्यों की गणना और चक्र दहलीज मूल्यों (सीटी) निर्यात।
    6. calculatई mRNA ब्याह के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर (आरईएल) गस हाउसकीपिंग (संदर्भ) "डेल्टा सीटी (ΔCt)" पद्धति का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में जीन की तुलना वेरिएंट। सूत्र है: रिलायंस एनर्जी = 2 - ΔCt, जहां ΔCt = सीटी लक्ष्य ब्याह संस्करण - सीटी संदर्भ जीन
    7. अनुपात रिलायंस एनर्जी अनुपात = रिलायंस एनर्जी ब्याह संस्करण 1 / रिलायंस एनर्जी ब्याह संस्करण 2: आदेश, ब्याह वेरिएंट के रिश्तेदार बहुतायत मात्रा ठहराना सूत्र का उपयोग करके रिलायंस एनर्जी अनुपात की गणना करने के लिए।

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    Representative Results

    Cytotoxicity प्रोटोकॉल में वर्णित assays इन विट्रो में एजेंटों के लिए कैंसर कोशिकाओं के प्रतिरोध का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत विधि प्रदान करते हैं। यूके / R30dm, CEM-R5 और यूके-सी 3: MTT परख के माध्यम से, डेक्स के प्रति संवेदनशीलता डेक्स के प्रति संवेदनशील पैतृक CEM-गुम्मट कोशिकाओं सहित चार टी सभी सेल लाइनों, और तीन डेक्स प्रतिरोधी sublines में निर्धारित किया गया था। डेक्स प्रतिरोधी सेल लाइनों (640 सुक्ष्ममापी - 0.33 एनएम) और - दो अलग एकाग्रता पर्वतमाला बड़े (0.97 एनएम 2 माइक्रोन) CEM-गुम्मट के बीच संवेदनशीलता में अंतर की वजह से किया जा सकता था। MTT परख स्पष्ट रूप से यूके / R30dm (आईसी 50 = 456 ± 49 सुक्ष्ममापी), यूके-R5 (आईसी 50> 640 सुक्ष्ममापी) और यूके-सी 3 (आईसी 50 = 386 ± 98 माइक्रोन) के डेक्स में प्रतिरोध दिखाया CEM- की तुलना में WT कोशिकाओं (आईसी 50 = 0.028 ± 0.003 माइक्रोन) के। इसी तरह SRB परख Panc-1R सेल लाइन में उच्च Gemcitabine प्रतिरोध का प्रदर्शन (आईसी 50 = 3।16 ± 0.01 माइक्रोन) के माता पिता का Panc-1 कोशिकाओं की तुलना में (चित्रा 2 में दिखाया के रूप में आईसी 50 = 0.077 ± 0.03 सुक्ष्ममापी)।

    सभी माना सेल लाइनों में दवा प्रतिरोध की पुष्टि के बाद, हम अगले mRNA अलगाव, पुस्तकालय तैयारी और आरएनए अनुक्रमण के लिए रवाना हुए। सिलिका झिल्ली स्पिन कॉलम का उपयोग करके कुल mRNA की निकासी के अन्य तरीकों पर पसंदीदा विकल्प है क्योंकि यह फिनोल और प्रोटीन संदूषण से बचा जाता है और 260 एनएम / 280 एनएम absorbance अच्छी तरह से 1.8 ऊपर अनुपात के साथ नमूना के उच्च शुद्धता प्रदान करता है। यह एक ऐसी गहरी अनुक्रमण के रूप में जटिल बहाव के अनुप्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। Agarose द्वारा शाही सेना के नमूने की अखंडता की जाँच करने के लिए 1% इस्तेमाल किया विधि हौसले से अलग कक्षों (चित्रा 3) के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। चूंकि इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य वैकल्पिक ब्याह वेरिएंट aberrantly दवा प्रतिरोधी सेल लाइनों में व्यक्त पता लगाने के लिए है, हम सकारात्मक selectio चुनेंअनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के लिए polyadenylated mRNA की एन, असहाय mRNA किट का उपयोग करके। एकल और जमा पुस्तकालयों की Electropherograms चित्रा 4 में चित्रित कर रहे हैं, के बारे में 300 बीपी के एक औसत टुकड़ा आकार, अनुक्रमण प्रणाली आवश्यकताओं के अनुरूप दिखा। तैयार पुस्तकालयों तो एकल पढ़ें 100 बीपी मोड के साथ एक चिप का उपयोग कर अनुक्रम थे। अनुक्रमण के चुनाव पढ़ता के 100 बीपी नीचे की ओर bioinformatic पाइपलाइनों के माध्यम से वैकल्पिक splicing का पता लगाने के लिए आवश्यक है।

    प्रारंभिक प्रसंस्करण कदम और गुणवत्ता नियंत्रण के बाद, स्वच्छ मानव जीनोम (hg19) के लिए गठबंधन पढ़ता मैट का उपयोग कर splicing विश्लेषण करने के लिए अंतर अधीन थे। इस विश्लेषण में हम दवा संवेदनशील पैतृक सेल लाइन और इसकी दवा से प्रत्येक के बीच तुलना प्रतिरोधी sublines अलग से बना है (यानी, यूके गुम्मट बनाम यूके / R30dm, यूके गुम्मट बनाम यूके-सी 3, आदि)। मैट एक लचीला और सटीक सांख्यिकीय मॉडल पर निर्भर करता हैनमूने के बीच अंतर splicing पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया। डिफ़ॉल्ट विश्लेषण विकल्प और एक एफडीआर मूल्य <एक कट ऑफ (चित्रा 5 ब में दिखाया गया है) के रूप में 10% का उपयोग करके, हम तुलना वैकल्पिक splicing घटना के प्रकार के आधार पर खरीदी प्रति 38 ± 12 महत्वपूर्ण विभिन्न spliced जीन उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए, सबसे सफल फिल्मों के साथ में सक्षम थे एक्सॉन लंघन के रूप में वर्गीकृत। चित्रा 6 तुलना Panc-1 बनाम Panc-1R के लिए एक विशिष्ट विश्लेषण उत्पादन को दिखाता है।

    एक्सॉन लंघन और नीचे वर्णित श्रेणी के प्रति एक प्रतिनिधि उम्मीदवार के साथ परस्पर अनन्य एक्सॉन घटनाओं: हम आगे वैकल्पिक splicing घटनाओं के दो सबसे आम प्रकार पर हमारे अध्ययन ध्यान केंद्रित किया। DDX5 (मृत बॉक्स helicase 5) तुलना CEM-गुम्मट बनाम यूके-सी 3 और यूके-R5 में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण के रूप में मैट विश्लेषण से पता लगाया गया है, लेकिन इसकी तुलना CEM-गुम्मट बनाम यूके / R30dm में महत्वपूर्ण नहीं है। ल्यूकेमिया 25,26 में अपने ख्यात भूमिका को देखते हुए, हमआगे की मान्यता के लिए इस पद के उम्मीदवार का चयन करें। यह अत्यधिक एक जीनोम ब्राउज़र की तरह उपकरण में शाही सेना seq डेटा कल्पना करने के लिए सिफारिश की है। IGV के रूप में जीन उम्मीदवार DDX5 के लिए चित्रा 7 में दिखाया गया है, इस उद्देश्य के लिए एक बहुमुखी और उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस प्रदान करता है। PKM (पाइरूवेट काइनेज पेशी आइसोजाइम) एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण तुलना में परस्पर अनन्य एक्सॉन घटना है CEM-गुम्मट बनाम सभी डेक्स प्रतिरोधी sublines, लेकिन नहीं तुलना Panc-1 बनाम Panc-1R में। ठोस ट्यूमर चयापचय 27,28 में इस एंजाइम की प्रासंगिकता और उभरते टी सभी 29 में glucocorticoid प्रतिरोध में सेल चयापचय की भूमिका को देखते हुए, हम आगे की मान्यता आरटी पीसीआर प्रयोग करने के लिए इस पद के उम्मीदवार का चयन करें।

    प्राइमर डिजाइन आदेश सही amplicon बढ़ाना, प्राइमरों पानी रखना एक्सॉन-एक्सॉन के लिए विशेष रूप से जब सीमाओं या जब टी (रिवर्स प्राइमर का पता लगाने के DDX5 ΔEx12 संस्करण के मामले में) में चरम देखभाल के साथ आयोजित किया जाना चाहिएअरे पानी रखना उच्च अनुक्रम अनुरूपता (एक्सॉन 9 और एक्सॉन PKM का 10) के साथ परस्पर अनन्य एक्सॉनों करने के लिए। जबकि 9 चित्रा DDX5 जीन उम्मीदवार के लिए एक आरटी पीसीआर के परिणामों से पता चलता चित्रा 8, प्रथम डिजाइन रणनीति से पता चलता। DDX5 ΔEx12 नमूना CEM-WT और यूके / R30dm लेकिन यूके-सी 3 और यूके-R5 में नहीं में पाया जाता है, इस प्रकार एक गुणात्मक फैशन में मैट डेटा की पुष्टि। जाती हरी QRT- पीसीआर परख सही रूप में चित्रा 10 और 11 चित्रा में दिखाया गया है, क्रमशः, DDX5 और PKM ब्याह वेरिएंट की mRNA अभिव्यक्ति के स्तर quantifies।

    आकृति 1
    आकृति 1: वैकल्पिक splicing घटनाक्रम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक जीन की वैकल्पिक splicing के संभावित पैटर्न के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। बक्से असतत एक्सॉनों कि स्वतंत्र रूप से शामिल किया जा सकता है या श्री से बाहर रखा गया हैएनए प्रतिलेख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2: cytotoxicity assays के परिणाम। (ए) लयूकेमिक सेल लाइनों के लिए MTT परख यूके-सी 3 में dexamethasone प्रतिरोध के उच्च स्तर (आईसी 50 = 386 ± 98), यूके-R5 (आईसी 50> 640 सुक्ष्ममापी) और यूके / R30dm (आईसी 50 = 456 ± 49 सुक्ष्ममापी से पता चलता ) पैतृक CEM-डब्ल्यूटी (आईसी 50 = 0.028 ± 0.003 माइक्रोन) के रूप में की तुलना। अग्नाशय कार्सिनोमा सेल लाइनों के लिए (बी) SRB assays उच्च Panc-1R में Gemcitabine प्रतिरोध की (आईसी 50 = 3.16 ± 0.01 माइक्रोन) के रूप में माता पिता का Panc-1 की तुलना में (आईसी 50 = 77.22 ± 2.76 एनएम) के स्तर का पता चलता है। रेखांकन तीन indep के SEM ± रिपोर्ट मतलब सेल के विकास%endent प्रयोगों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्र तीन: आरएनए गुणवत्ता मूल्यांकन एक agarose जेल का उपयोग कर। कुल mRNA की दो सौ एनजी 1% agarose जेल ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग पर चलाए जा रहे थे। ribosomal शाही सेना (rRNA) प्रजाति 18S और 28S और कम आणविक भार पर स्मीयर के अभाव के लिए इसी बरकरार बैंड की उपस्थिति अच्छी गुणवत्ता शाही सेना के संकेत हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: <strong> अनुक्रमण पुस्तकालय के Bioanalyzer निशान। (ए) अनुक्रमण पुस्तकालयों की Electropherograms लगभग चोटियों दिखाने 300 बीपी, जो अच्छी गुणवत्ता का सूचक है। नमूना 1 से 6 = CEM-गुम्मट, यूके-सी 3, यूके-R5, यूके / R30dm, Panc-1 और Panc-1R। (बी) जमा नमूनों की electropherogram (फू, प्रतिदीप्ति इकाइयों)।

    चित्रा 5
    चित्रा 5: मैट के साथ अंतर Splicing की जांच। (ए) समूह की तुलना और (बी) मैट चलाने के लिए इस्तेमाल स्क्रिप्ट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6: मैट आउटपुट की सूची। चित्रा स्प्रेडशीट के साथ एक सॉफ्टवेयर में मैट विश्लेषण का एक विशिष्ट उत्पादन को दर्शाया गया है: यहाँ एक्सॉन लंघन घटनाओं (एफडीआर <10%) के लिए तुलना Panc-1 बनाम Panc-1R में विभिन्न spliced उम्मीदवारों रिपोर्ट कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 7
    चित्रा 7: IGV जीनोम ब्राउज़र के माध्यम से DDX5 उम्मीदवार जीन की विभेदक Splicing के दृश्य। गठबंधन के साथ फ़ाइलों को पढ़ता है (.bam) leukemic कोशिकाओं को इसी IGV जीनोम ब्राउज़र पर अपलोड किया गया है और sashimi भूखंडों का उपयोग कर (न्यूनतम जंक्शन मायने रखता मूल्य = 10 महत्वपूर्ण घटनाओं splicing कल्पना करने के लिए) द्वारा कल्पना। ब्याह जंक्शन मायने रखता है लाइनें जोड़ने के द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं औरएक नंबर आरएनए-सेक करने के लिए इसी एक्सॉनों फैले पढ़ता है। यूके-WT और यूके / R30dm एक्सॉन 11 फैले 13 एक्सॉन को यूके-सी 3 और यूके-R5 जो किसी भी एक्सॉन 12 लंघन नहीं दिखा की तुलना लंघन मायने रखता दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    आंकड़ा 8
    8 चित्रा: आरटी पीसीआर और जाती ग्रीन QRT- पीसीआर के लिए प्राइमर डिजाइन। (ए) आरटी पीसीआर: प्राइमर जोड़े विधान एक्सॉनों (एक्सॉन 10 और एक्सॉन 13) वैकल्पिक रूप से spliced एक्सॉनों से अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम स्थित DDX5 पानी रखना का अंतर splicing का पता लगाने। (बी) QRT- पीसीआर परख: विहित टेप की तुलना में एक्सॉन लंघन घटनाओं से उत्पन्न टेप के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए, रिवर्स प्राइमर anneals या तो छोड़ दिया एक्सॉन (वैकल्पिक संस्करण) के भीतर याDDX5 जीन की exon11 / exon13 सीमा (विहित संस्करण) के लिए। परस्पर अनन्य एक्सॉनों की मात्रा का ठहराव के लिए, रिवर्स प्राइमर 11 दोनों isoforms के लिए आम एक्सॉन के लिए है, जबकि आगे प्राइमर पानी रखना या तो 9 (PKM1) एक्सॉन या एक्सॉन 10 (PKM2) को anneals। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    9 चित्रा
    चित्रा 9: आरटी पीसीआर DDX5 विभेदक Splicing के मान्यकरण। 1% agarose जेल leukemic कोशिकाओं में जीन DDX5 का अंतर splicing पता चलता है। टुकड़ा पूरी लंबाई amplicon (650 बीपी) DDX5 करने के लिए इसी सभी नमूनों में परिलक्षित होता है, जबकि DDX5 ΔEx12 (430 बीपी) संस्करण यूके-WT और यूके / R30dm में परिलक्षित होता है नमूने और आकार एक्सॉन 12 लंघन से मेल खाती है। यह यूके-सी 3 और यूके-R5 कोशिकाओं में पता नहीं है रोकते के रूप मेंमैट विश्लेषण द्वारा खनन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 10
    चित्रा 10: यूके प्रकोष्ठों में DDX5 ब्याह वेरिएंट की mRNA अभिव्यक्ति के स्तर। (ए) QRT- पीसीआर परख। रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर और मतलब दो स्वतंत्र प्रयोगों के (रिलायंस एनर्जी ± SEM) के मानक त्रुटि मतलब। (बी) के ब्याह वेरिएंट की रिलायंस एनर्जी का अनुपात (± SEM)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    11 चित्रा
    चित्रा 11: mRNA अभिव्यक्ति के स्तरयूके में PKM ब्याह वेरिएंट और Panc-1 कोशिकाओं के एस। (ए) QRT- पीसीआर परख। रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर और मतलब दो स्वतंत्र प्रयोगों के (रिलायंस एनर्जी ± SEM) और यूके की कोशिकाओं के लिए ब्याह वेरिएंट की रिलायंस एनर्जी के अनुपात के मानक त्रुटि मतलब। (बी) QRT- पीसीआर परख। मतलब रिलायंस एनर्जी ± Panc-1 कोशिकाओं के लिए ब्याह वेरिएंट की दो स्वतंत्र प्रयोगों और रिलायंस एनर्जी (± SEM) के अनुपात के SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    यहाँ हम एक उपन्यास दृष्टिकोण है कि अच्छी तरह से स्थापित cytotoxicity स्क्रीनिंग तकनीक और शक्तिशाली NGS आधारित transcriptomic दवा प्रतिरोध के संबंध में अंतर splicing घटनाओं की पहचान करने के लिए विश्लेषण को जोड़ती है का वर्णन है। Spectrophotometric assays में इन विट्रो कैंसर मॉडल में दवा संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए सुविधाजनक और मजबूत उच्च throughput तरीके हैं और cytotoxicity स्क्रीनिंग प्रदर्शन कर कई प्रयोगशालाओं के लिए पहली पसंद प्रतिनिधित्व करते हैं। समस्या निवारण के साथ ही इस विधि के लिए संभव रूपांतरों बड़े पैमाने पर अन्यत्र 4,5 वर्णित किया गया।

    उच्च throughput जीनोमिक वर्तमान में दवा प्रतिरोध तंत्र SNPs पता लगाने पर मुख्य रूप से निर्भर का पता लगाने और एक निश्चित दवा प्रतिरोधी phenotype के साथ जुड़े जीन की अभिव्यक्ति के आकलन के लिए अंतर करने के लिए इस्तेमाल विश्लेषण करती है। इस अध्ययन में, हम शाही सेना अनुक्रमण तरीकों का उपयोग करते हैं, एक साथ mRNA टेप की सटीक एनोटेशन और अलग का पता लगाने के लिए मजबूत जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइनों के साथ वर्णनferential splicing। वर्णित प्रोटोकॉल की एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण विशेषता अलग दवा संवेदनशीलता प्रोफाइल के साथ दो समूहों के बीच नमूना उपन्यास ब्याह वेरिएंट की पहचान करने की क्षमता है। एक सही और निष्पक्ष विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक शाही सेना के अलगाव है, जो उच्च शुद्धता और ईमानदारी का होना चाहिए।

    मैट सॉफ्टवेयर उपलब्ध समान जैव सूचना विज्ञान उपकरणों की एक श्रृंखला के बीच में हम चुनते है (जैसे, Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice और splicing कम्पास) वैकल्पिक splicing 18 का पता लगाने के लिए। मुख्य प्रमुख विशेषताएं है कि यह पसंदीदा विकल्प बनाने के अपने बेहतर परिशुद्धता और सटीकता के साथ ही संभावना उपन्यास घटनाओं की पहचान करने के लिए कर रहे हैं। मैट उत्पादन युक्त अंतर splicing विश्लेषण के दो प्रकार उत्पन्न करता है: पहले ही एक्सॉन जंक्शन मोर्चों पर आधारित है और दूसरा जंक्शन मोर्चों पर आधारित है के रूप में अच्छी तरह से लक्ष्य पर पढ़ता है। उत्तरार्द्ध घटनाओं लंघन एक्सॉन का पता लगाने के लिए पसंद किया जाता है, वहीं यह करने के लिए सिफारिश की हैपरस्पर अनन्य एक्सॉनों के विश्लेषण के लिए पहला विकल्प का उपयोग के रूप में इस दृष्टिकोण splicing परिवर्तन के इस विशेष प्रकार के लिए झूठी सकारात्मक उम्मीदवारों की संख्या कम कर देता है।

    इसके अलावा, Intron प्रतिधारण पर ध्यान केंद्रित विश्लेषण के लिए, वैकल्पिक 3 'और 5' ब्याह साइट घटनाओं, एनोटेट इंट्रोन्स के साथ एक .gtf फ़ाइल इस्तेमाल किया जाना चाहिए। अंत में, आदेश नमूना समूहों के भीतर जैविक और तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करने और उच्च सच सकारात्मक दरों को सुनिश्चित करने में, यह दृढ़ता से दृश्य करने के लिए सिफारिश की है कम से कम तीन प्रतिकृति 34। विभिन्न spliced ​​जीन मैट उत्पादन के आधार पर उम्मीदवारों के चयन आरटी पीसीआर का उपयोग कर एक मान्यता कदम के साथ जोड़ दिया गया था। यह सांख्यिकीय महत्वपूर्ण उम्मीदवारों की एक बड़ी सूची के बीच सच सकारात्मक वेरिएंट के चयन के लिए महत्वपूर्ण है। एक सटीक मान्यता के लिए महत्वपूर्ण कारक oligonucleotides के डिजाइन और आणविक जीव विज्ञान के मानकों के अनुसार पीसीआर प्रतिक्रियाओं का अनुकूलन है। विशेष देखभालजब ऐसी सेंगर विधि द्वारा amplicons की अनुक्रमण के रूप में एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों और अतिरिक्त सत्यापन कदम, फैले प्राइमरों डिजाइनिंग लिया जाना चाहिए, ताकि उनकी विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए warranted रहे हैं।

    मैट द्वारा पता लगाया DDX5 और PKM टेप के अंतर splicing एक न्यायपालिका दवा प्रतिरोध से संबंधित splicing के दो उदाहरण प्रतिनिधित्व करते हैं। DDX5 ΔEx12 जीसी प्रतिरोधी सेल लाइनों (यूके-सी 3 और R5) है, जो लंबे समय तक डेक्स प्रदर्शन के बाद चयनित किया गया है में व्यक्त नहीं किया गया था। DDX5 ΔEx12 पैतृक सेल लाइन में बल्कि subclone यूके / R30dm, जो कीमोथेरेपी एजेंट MTX बजाय डेक्स के प्रतिरोध के लिए चयनित किया गया था में व्यक्त की गई थी। कैंसर की कोशिकाओं में, PKM2 अत्यधिक अपनी ब्याह संस्करण PKM1 की तुलना में व्यक्त की गई थी, लेकिन अनुपात PKM2 / PKM1 के रूप में NGS परिणामों ने सुझाव दिया है डेक्स प्रतिरोधी कोशिकाओं में अधिक था। इस Panc-1 नमूना के लिए अपने Gemcitabine प्रतिरोधी समकक्ष की तुलना में नहीं मनाया गया और, वास्तव में, इस उम्मीदवार जीन के बीच में नहीं थामैट विश्लेषण में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण घटनाओं। यह अलग सेल प्रकार और दवा प्रतिरोध Gemcitabine जोखिम से प्रेरित का तंत्र प्रतिबिंबित हो सकता है।

    अंत में, इस प्रोटोकॉल ब्याह वेरिएंट जो दवा प्रतिरोध कायम कर सकते हैं और या तो leukemic कोशिकाओं 30 या ठोस ट्यूमर कोशिकाओं को 31 के लिए लागू किया जा सकता है की खोज के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण का गठन किया। एक स्पष्ट सीमा है कि ट्यूमर सेल लाइनों केवल कैंसर विविधता के एक छोटे से हिस्से पर कब्जा है। इसके अलावा, सबसे सेल लाइनों विकास को बढ़ावा देने के मीडिया में monolayers में कई वर्षों के लिए बनाए रखा गया है। इन शर्तों सेलुलर विशेषताओं को प्रभावित, उप-जनसंख्या है कि प्राथमिक ट्यूमर से जो वे आरंभ की कोशिकाओं से नाटकीय रूप से अलग के चयन में जिसके परिणामस्वरूप। हालांकि, जीन है कि दवा प्रतिरोध में शामिल कर रहे हैं के कई लोग भी इस तरह के सेल के विकास और apoptosis कि लंबी अवधि के culturin से प्रभावित हो सकता है के रूप में अन्य निर्णायक सेल कार्यों में शामिल हैं प्लास्टिक में छ। इसलिए, दवा प्रतिरोध के अध्ययन में सुधार करने के क्रम में, इस तरह के और अधिक प्रयास प्राथमिक संस्कृतियों और xenografts के रूप में उपन्यास preclinical मॉडल, के विकास की ओर निर्देशित किया जाना चाहिए, कि और अधिक बारीकी विवो कैंसर microenvironment नकल इतनी के रूप में सेलुलर विशेषताओं में प्रासंगिक परिवर्तन से बचने के लिए सेल संस्कृति और संस्कृति की स्थिति की विस्तारित अवधि के कारण होता है। 32 उल्लेखनीय है, हमारे प्रोटोकॉल भी प्राथमिक कोशिकाओं के क्रम में cytotoxicity assays का उपयोग पूर्व vivo आईसी 50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए लागू किया जा सकता है। एक और सीमा के बाद से प्रतिरोध के कई तंत्र प्रत्येक कैंसर विरोधी दवा के लिए मौजूद हैं, प्रतिरोध के समान या अलग तंत्र समान है, लेकिन स्वतंत्र उपचार के संपर्क में कोशिकाओं में विकास कर सकते है। इसलिए, एक तुलनात्मक चयन रणनीति समानांतर चयन और विश्लेषण, splicing वेरिएंट पर आनुवंशिक विश्लेषण, एक ही कीमोथेरेपी एजेंट के साथ इलाज एक ही माता-पिता की कोशिकाओं के सहित शामिल करना चाहिए।

    jove_content "> कार्यात्मक सत्यापन के लिए अतिरिक्त दृष्टिकोण सेल लाइनों में ब्याज की ब्याह संस्करण overexpressing या विशेष रूप से शाही सेना के हस्तक्षेप या ब्याह स्विचिंग ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स 33 का उपयोग करके उनकी अभिव्यक्ति downregulate करने के उद्देश्य से किया जाना चाहिए।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

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    References

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    कैंसर रिसर्च अंक 118 कीमोथेरेपी प्रतिरोध cytotoxicity वैकल्पिक splicing है शाही सेना seq transcriptomics
    उपन्यास ब्याह वेरिएंट में दवा प्रतिरोध करने के लिए संबंधित का पता लगाने के लिए शाही सेना अनुक्रमण का उपयोग<em&gt; इन विट्रो</em&gt; कैंसर मॉडल
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    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A.,… More

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

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