Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.
Abstract
עמידות לתרופות נשארת אחת בעיות עיקריות לטיפול בסרטן הוא ממאירויות המטולוגיות וגידולים מוצקים. התנגדות פנימית או נרכש יכולה להיגרם על ידי מגוון של מנגנונים, כולל חיסול סמים עלה, ירד ספיגת התרופה, איון התרופה ושינויים של מטרות תרופה. נתונים אחרונים הראו כי מלבד על ידי (מוטציה, הגברה) גנטי ידוע אפיגנטיים (היפר-מתילציה DNA, שינוי שלאחר translational היסטון) שינויים, מנגנוני עמידות לתרופות עשוי גם להיות מוסדר על ידי סטיות שחבור. זהו תחום הולך וגדל במהירות של חקירה ראויה לתשומת לב בעתיד על מנת לתכנן גישות טיפוליות יעילות יותר. הפרוטוקול המתואר במאמר זה נועד על מנת לבדוק את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, ניתחנו את הפרופילים transcriptomic מכמה דגמים במבחנה באמצעות RNA-seq ולהקיםed שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גנים מועמדים. בפרט, אנו הערכנו את שחבור ההפרש של תמלילי DDX5 ו PKM. השחבור הסוטה זוהה על ידי כלי חישובי המחצלות שקבל תוקף בתאי leukemic, מראה כי וריאנטים אחוי שונים DDX5 באים לידי ביטוי בתאים העמידים לעומת ההורים. בתאים אלה, אנחנו גם ציינו PKM2 גבוה / יחס PKM1, אשר לא זוהה עמיתו Panc-1 עמיד gemcitabine בהשוואה לתאים Panc-1 הוריים, דבר המצביע על מנגנון שונה של עמידות לתרופות מושרות על ידי חשיפת gemcitabine.
Introduction
למרות התקדמות ניכרה בטיפול בסרטן, התנגדות של תאים ממאירים לכימותרפיה, בין אם פנימי או רכש בחשיפה ממושכת בסמים, הוא הסיבה העיקרית לכישלון טיפול במגוון רחב של לוקמיה וגידולים מוצקים 1.
על מנת להתוות את המנגנונים עמידים לתרופות, במודלי שורת תאים במבחנה מפותח על ידי בחירה בשלבים של תאים סרטניים עמידים בפני תרופות כימותרפיות. הליך זה מחקה את המשטרים בשימוש במסגרות קליניות ולכן מאפשר חקירה מעמיקה של מנגנוני עמידות רלוונטי. תאים עמידים אשר לשרוד את הטיפול נבדלים אז מתאי הורים רגישים באמצעות מבחני כדאיויות תא / cytotoxicity 2. בשנת פרופילים עמידות לתרופות במבחנה של תאים ראשוניים הוכח להיות קשור באופן מובהק תגובה קלינית לכימותרפיה 3.
cytoto תפוקה גבוההמבחני xicity מהווים שיטה נוחה לקבוע רגישות לתרופה במבחנה. בזאת, את הכדאיות של תאים נבחנת על ידי למשל 3- [4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.] -2,5-diphenyl tetrazolium ברומיד - MTT assay 4, אשר מבוססת על המרה מטבולית של מצעים מסוימים (כלומר, מלחי tetrazolium) לתוך מוצרים צבעוניים, המשקפים את פעילות המיטוכונדריה של תאים. לחלופין, את תכולת החלבון הסלולר ניתן לכמת באמצעות B sulforhodamine (SRB) assay 5. כאן, מספר תאי קיימא הוא יחסי הצפיפות האופטית (OD) נמדדה באורך גל מתאים ספקטרופוטומטר, ללא צורך של נרחב ונדרש זמן רב נהלי ספירת תאים. עיכוב הצמיחה המושרה על ידי תרופת כימותרפיות מסוימת ניתן לחשב על בסיס OD של הבארות שבו תאים טופלו עם סוכן בדיקה בהשוואת OD לתאי קבוצת ביקורת. עקומת מנה-תגובה היא obtaשאינו עומד ידי התוויית ריכוז תרופה לעומת אחוזי תאי קיימא ביחס לשלוט תאים. לבסוף, רגישות התרופה ניתן כפי שדווח ריכוז שתוצאתו 50% של עיכוב צמיחת תאים לעומת בתאים שלא טופלו (IC 50).
המנגנונים עמידות לתרופות כוללים ליקויים רבים ושונים, כגון שינויים המשפיעים ביטוי גנים הקובעים פעילות התרופה ועל חילוף החומרים בתאים. נגעים מולקולריים אלה, כוללים מוטציות, סטיות בכל תעתיק ורמה שלאחר תעתיק וכן תקנה אפיגנטיים מופרעת לעתים קרובות להשפיע גנים המעורבים גם במטבוליזם תרופה או אפופטוזיס 6.
שחבור מראש mRNA אלטרנטיבי הרגולציה הסבוכה שלה קבלו תשומת לב רבה לאחרונה כישות רומן שעשוי להכתיב עמידות לתרופות של תאים סרטניים 7. עד 95% של גנים אנושיים הם שחבור חלופי תאים נורמלים באמצעות זהבחוזקה תהליך מוסדר מייצר isoforms חלבון שונה מאותו הגן. שחבור אלטרנטיבי הוא deregulated לעתים קרובות סרטן וכמה גידולים מאופיינים שחבור שונה של מספר הולך וגדל של גנים המעורבים במטבוליזם התרופה (כלומר, קינאז deoxycytidine, synthetase folylpolyglutamate, או חלבונים התנגדות multidrug) 6,8. עם זאת, ניתוח מקיף של פרופילי שחבור של תאי תרופה עמידים חסר עד כאב. לכן, קיים הכרח לפתח שיטות תפוקה גבוהות לניתוח שחבור חלופי. זה יכול לעזור לפתח גישות טיפוליות יעילות יותר.
במהלך העשור האחרון, ההתפתחות המהירה של טכנולוגיות רצף הדור הבא (NGS) העשירה מחקר ביו עם תובנות חדשות על המנגנונים המולקולריים השולטים בקרת הביטוי הגנום ותפקידם תהליכים ביולוגיים שונים 9. RNA-רצף (RNA-seq) הוא יישום משנה עוצמהשל NGS בתחום transcriptomics. היא מאפשרת יצירת פרופיל רחב של הגנום (הן מבחינה איכותית וכמותית) של דפוסי הביטוי של אלפי גנים בו זמנית הוא גם מתאים לאפיון mRNAs קידוד הרומן וכן RNA ללא קידוד ארוך, מירנה, siRNA, ו- RNA קטנים אחרים כיתות (למשל, snRNA ו Pirna) 10,11.
יש RNA-seq יתרונות רבים על פני טכנולוגיות קודמות לאפיון transcriptome (למשל, רצף סנגר ו microarrays הביטוי). הוא אינו מבוסס על ביאור הגנום קיים, הוא ברמת נוקלאוטיד יחיד של רזולוציה ויש לו טווח דינמי רחב יותר לאמידת רמת ביטוי. בקצרה, העבודה הניסיונית הבסיסית של ניסויים-seq RNA מורכבת תמליל polyadenylated (mRNA) מבחר ופיצול, ואחריו והפיכתן cDNA, בניית ספרייה ולבסוף, רצף מקביל עמוק מסיבי 12,13. בשל ירידה מהירה של sequencinעלויות גרמו במשך כמה השנים, RNA-seq האחרונים מחליפות טכנולוגיות אחרות בהדרגת מאמצים משמעותיים נעשים כדי לשפר את הפרוטוקולים כני ספרייה. לדוגמה, ניתן כיום כדי לשמור את המידע קווצת תעתיקי mRNA על ידי סימון cDNA גדיל השני עם אדנוזין deoxyuridine (dUTP) ו, לפני PCR הגברה, לעכל את גדיל המסומנות אורציל-DNA-glycosilase (UDG). תהליך זה משפר את הדיוק של ביאור גן ואמידה של רמות ביטוי 14,15.
הניתוח ופרשנות של נתונים seq-RNA דורשים חבילות תוכנה חישובית מורכבת ורבת עוצמה ועיבוד בתוך צינורות bioinformatic 16,17. ראשית, גלם קורא עובר בקרת איכות על ידי הסרת חפצים טכניים וביולוגיים והשלכת (זמירה) הרצפים אשר אינו מגיעים דרישות איכות מחמירות. החל מאותו מועד, קורא עבור כל דגימה ממופים הגנום התייחסות באינדקסאל-רמת גן, אקסון-רמה, או ברמת תעתיק, על מנת לקבוע את השפע של כל קטגוריה. בהתאם ליישום, נתונים מעודנים אז מחושבים באמצעות מודלים סטטיסטיים לזיהוי ביטוי אלל הספציפי, השחבור חלופי, בשילובי גני פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד (SNPs) 12. לבסוף, ניתוח ההפרש על הרמה הנבחרת (כלומר, ביטוי גנים או שחבור חלופי) שניתן להשתמש בהם כדי להשוות דגימות שהתקבלו בתנאים שונים.
ניתוח שחבור הפרש מתאר בדלי שימוש באתר אחוי בין שתי דגימות. מספר גדל והולך של חבילות תוכנה מוקדשות למטרה זו זמין על בסיס מודלים סטטיסטיים שונים, הופעות ממשק משתמש 18. בין אלה, מחצלות (ניתוח רב המשתנה של תמליל שחבור) מתגלות ככלי חישובית בחופשיות זמין ומדויק המבוסס על מסגרת סטטיסטית בייס ו נועדו לזהות diffeאירועי שחבור rential מנתונים סוף יחיד או זיווג או seq-RNA. החל מ הקבצים (.bam) המיושרים, מחצלות יכולות לזהות את כל הסוגים העיקריים של אירועי שחבור חלופיים (דילוג אקסון, 3 חלופי "אתר שחבור, 5 חלופי" אחוי באתר, אקסונים ושימור אינטרון סותרים - גם ראו איור 1).
ראשית, מזדהה התוכנה קוראת התומכים אירוע אחוי מסוים, מדלגי אקסון למשל, ומסווג אותן לשני סוגים. "הכללה קוראת" (עבור אירוע אחוי הקנונית) למפות בתוך אקסון חקר span צומת בין כי אקסון ספציפי שני אקסונים האיגוף במעלה או במורד זרם. "דילוג קורא" (עבור האירוע אחוי החלופי) משתרע על פני הצומת בין שני אקסונים האיגוף. בהמשך לכך, מחצלות מחזירות את רמת ההכללה המנורמלת עבור שני האירועים הקנונית ואלטרנטיביים ומשווות ערכים בין דגימות או תנאים. בסופו של דבר, היא מחשבת P-ערך nd שיעור תגליות שגוי (FDR) בהנחה כי הבדל היחס וריאנט של גן בין שני תנאים עובר סף המוגדר על ידי משתמש שניתן עבור כל אירוע שחבור 19,34.
בעקבות ניתוח שחבור הפרש בשיתוף עם-seq RNA, אימות ניסיון נרחבת היא מוצדקת כדי לזהות מועמדי גן נכונים חיוביים 18. הפכו כמוני תגובת השרשרת עבד-פולימראז (qRT-PCR) היא השיטה הנפוצה ביותר ואופטימלית באימות של מועמדים המתקבלים מניתוח RNA-seq 20. מטרת מאמר זה היא לספק מתודולוגיה חזק כדי לחקור פרופילי שחבור הקשורה לסמי התנגדות בגידולים מוצקים דם ממאירות. הגישה שלנו מנצלת פרופיל transcriptome מבוסס RNA-seq של מודלי קו התא נבחרים של סרטן עמיד לתרופות בשילוב עם שיטת qRT-PCR הוקמה עבור האימות של גני המועמדים מעורבים עמידות לתרופות.
s = "jove_content"> המודלים שורת תאים לוקמיה השתמשו במחקר זה כללו לוקמיה לימפובלסטית חריפה T-cell ילדים (T-ALL) תא קו CCRF-CEM (CEM-WT), שני שלה בסטרואידים (GC) -resistant subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) ו CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 ואת methotrexate (MTX) -resistant SubLine CEM / R30dm 23. למרות הטיפולים הקיימים כיום מבוססים על GCS ו MTX להקים תועלת קלינית בכ- 90% מהמקרים, את הופעתה של עמידות GC עדיין מהווה בעיה לא פתורה עם מנגנון מולקולרי ברור. GC-עמיד תת-שיבוטים כדי לבודד, CEM-WT התאים היו בתרבית 1 dexamethasone מיקרומטר (דקס) עבור 2 עד 3 שבועות. MTX העמיד SubLine CEM / R30dm פותח באמצעות לזמן קצר חזר (24 שעות) חשיפה של תאי CEM-WT 30 מיקרומטר MTX כמו חקיין של פרוטוקולים קליניים. מעניין, את שורות תאים גם מוצגות עמידות צולבת דקס (תוצאות לא פורסמו) עבורו המנגנון לא מובנת לחלוטין.
Tum המוצקאו מודל נחקר במסגרת המחקר הנוכחי הוא אדנוקרצינומה ductal לבלב, לשמצת עמידותו בפני חום גבוה יוצא דופן לכימותרפיה. לשם כך, בחרנו Panc-1 תאים קו-השיבוט תת gemcitabine העמיד שלה Panc-1R מתקבל על ידי דגירה רציפה עם 1 מיקרומטר של התרופה 24. כאן אנו מתארים גישה לגלות מנגנוני הרומן שבבסיס חוץ גופית עמידות לתרופות ידי שילוב שלושה פרוטוקולים: מבחני רעילות colorimetric להעריך רגישות התרופה בתאים leukemic ותאי סרטן מגידולים מוצקים, RNA-seq מבוססי צינור לזהות וריאנטים אחוי הרומן הקשורים רגישות / עמידות לתרופות ו RT-PCR וניתוח qRT-PCR כדי לאמת מועמדים פוטנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אפיון של פרופילים עמידים לתרופות באמצעות מבחני Cytotoxicity
- תרבות שורת תאים leukemic
- לשמור על המדיום ALL T-cell הורית התא קו CCRF-CEM (CEM-WT) וכן שלה סמים עמיד sublines, כולל CEM / R30dm, CEM-R5 ו- CEM-C3, ב 25 ס"מ 2 ב 10 מ"ל RPMI-1640 המכיל 2.3 מיקרומטר חומצה פולית בתוספת 10% בסרום עוברית עגל ו -100 יחידות / G פניצילין מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין.
- התרבות התאים באווירה humidified על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2.
- אפשר צמיחת תאים לריכוזים בין 2 - 3 x 10 6 תאים / מ"ל.
- פיצול התאים פעמיים בשבוע בבית בריכוז ההתחלתי של 0.3 x 10 מ"ל 6 תאים / (למשל, אם את ריכוז התאים הוא 3 x 10 ההשעיה תא 6 תאים / מ"ל, להעביר 1 מ"ל בבקבוק חדש המכיל 9 מ"ל בינוני טרי). מחק את התרבות לאחר 20 קטעים רצופים.
הערה: גם לשמר את שורת תאי קרצינומה אדם לבלב Panc-1 ב 75 צלוחיות תרבות סנטימטר 2 ב 10 מיליליטר DMEM בינוני עם גלוקוז גבוה ו- L-Glutamine בתוספת 10% בסרום שור עובריים 100 יחידות / פניצילין מיליליטר G ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין . גרסת הסמים העמידה, Panc-1R, היא בתרבית באותו מדיום התרבות המכיל 1 מיקרומטר gemcitabine מומס במים סטריליים. לפרטים נוספים ראה ב -24.- התרבות התאים על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2.
- פיצול התאים כל 2 - 3 ימים ביחס של 1: 5 כאשר התאים מגיעים למפגש של 90% על.
- כדי לפצל את התאים, לשטוף את פעמיים עם בופר פוספט (PBS), להוסיף 1 מ"ל של EDTA טריפסין / לכל 75 בקבוק תרבות ס"מ 2 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
- הוסף 9 בינוני מ"ל ו לקצור את התאים מנותקים בתוך שפופרת 15 מ"ל. Seed 2 ההשעיה תא מ"ל בתוך conta בבקבוק חדשבינוני מ"ל ining 8. מחק את התרבות לאחר 20 קטעים רצופים.
- Assay MTT עבור תאים leukemic
- הכן מראש הפתרון MTT: להמיס 500 מ"ג של formazan MTT ב 10 מ"ל PBS ומערבבים (מוגן מפני אור) עם בוחש מגנטי למשך כ 1 שעה. לעקר את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר. הערה: הפתרון ניתן לאחסן 10 aliquots מ"ל ב -20 ° C. להגן מפני אור ישיר לאחר ההפשרה.
- הכן מראש את isopropanol acidified: להוסיף 50 מ"ל של 2 M HCl 2.5 L של isopropanol. הערה: אחסן את הפתרון עבור חודש אחד לפחות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. אם isopropanol אינו acidified כראוי, זה עלול ליצור משקעים עם המדיום ופשר את הודעת spectrophotometric.
- כן תחתי שטוח 96-היטב נפרד "יום 0" (שליטה) צלחת כדי להבטיח הערכה מדויקת יותר של עיכוב צמיחה: להקדיש 3 עד 6 בארות לכל קו תא, להוסיף 30 μl של צמיחהבינוני ו -120 μl של השעית תא (8,000 תאים) לכל היטב 150 μl של מדיום גידול בארות המתאימות חסרים (לא תאים). המשך משלב 1.3.9 לשלב 1.3.13 סעיף זה כדי למדוד את הצפיפות האופטית (OD). הערה: פרטים נוספים ראו 4.
- הכן צלחת ניסיוני תחתית שטוח 96-היטב: להקדיש 30 בארות ריכוז תרופה (10 ריכוזים, כל אחד בשלושה עותקים), 10 בארות לשלוט תאים ו -10 בארות לשלוט בינוני ללא תאים (חסרים) ולהכין מגוון דילול תרופה של dexamethasone ( דקס) באמצעות דימתיל sulfoxide כממיס.
הערה: עבור תאים CEM-WT בטווח דילול דקס הוא בין 2 מיקרומטר ו 0.97 ננומטר. לקבלת CEM / R30dm, CEM-R5 ו- CEM-C3 תאים בטווח דילול דקס הוא בין 640 מיקרומטר ו 0.33 ננומטר. - הוסף 30 μl מכל דילול דקס לתוך באר מתאים של צלחת 96-היטב. הקפד לכלול כל ריכוז בתוך בשלושה עותקים.
- הוסף 30 μl של מדיום הגידול היטבהים מקביל לשלוט תאים 150 μl של מדיום גידול בארות המתאימות חסרים.
- קציר אקספוננציאלית גידול תאים ו resuspend בריכוז הזריעה האופטימלי שלהם.
הערה: כדי לקבוע ריכוזי תא מוצא אופטימליים, מומלץ להעריך את פרופיל הצמיחה של כל תא שורת תאי קו בצלחת 96-היטב על ידי זריעת תאים בכמה ריכוזים לבין מדידה יומית לפחות 4 ימים. בחר ריכוז זריעה המונע צמיחת יתר של תאים לאחר 72 שעות, כמו זה ישפיע על הניסוי על ידי להרוות את ערכי OD. לקבלת CEM-WT, CEM-C5 ו CEM-R5 ריכוז זריעת האופטימלי הוא 8,000 תאים / היטב, ואילו עבור CEM / R30dm זה 5,000 תאים / היטב. - להוסיף 120 μl של השעית תא היטב כל המכיל גם פתרון סמים או מדיום הגידול (בארות מתאימות לשלוט תאים). מלא את הבארות חיצוניות הריקות של הצלחת עם 150 μl PBS על מנת להבטיח לחות טובה בצלחת דגירת הדואר צלחות במשך 72 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באינקובטור תרבית תאים.
- הוסף 15 μl של פתרון MTT זה היטב ולנער את הצלחת במשך 5 דקות עם צלחת-שייקר עד למקסימום של 900 שייקים / min.
- מניחים את הצלחות בחזרה 37 ° C עם 5% CO 2 באינקובטור תרבית תאים דגירה לעוד 4 - שעות 6.
- להוסיף 150 μl של isopropanol acidified היטב כל ומערבבים היטב עם טפטפת רב כדי resuspend ביסודיות כל הגבישים formazan. התחל עם הבארות הריקות הקפד לשטוף את הטיפים היטב לפני שתמשיך עוד שורה של הצלחת.
- דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 דקות.
- שימוש בקורא microplate, לקבוע את OD ב 540 ו 720 ננומטר כדי להבטיח מדידה מדויקת על ידי תיקון עבור OD ברקע. ואז לשמור את הנתונים בקובץ גיליון אלקטרוני לנתח את זה 4.
- SRB Assay עבור קרצינומה של תאי הלבלב
- ממסים מגיבים SRB ב 1% חומצה אצטית בריכוז סופי של 0.4% (w / v).
- ממסי חומצת trichloroacetic (TCA) במי ultrapure בריכוז סופי של 50% (w / v).
- ממיסים טריס (hydroxymethyl) -aminomethane במים ultrapure בריכוז סופי של 10 מ"מ.
- הכן צלחת מלאה התחתון נפרדת 96-גם שטוחה "יום 0" כדי להבטיח הערכה מדויקת יותר של עיכוב צמיחה: זרע 6 בארות עם תאי גדלי שלב מעריכי 100 בינוני μl בריכוז זריעה מתאים ולהוסיף 100 בינוני μl רק בארות מתאימות חסר. דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2 כדי להבטיח הדבקה נאותה של תאים הצלחת. לאחר מכן להוסיף 100 בינוני μl לכל הבארות והמשך צעדים 1.4.8 - 1.4.16 סעיף זה.
- הכן צלחת ניסיוני תחתית שטוח 96-היטב: תאי זרע גדלו בשלב מעריכים בשלושה עותקים ב -96 בארות צלחות תחתיות שטוחות בצפיפות המתאימה 100 μl של ליdium באמצעות pipet הרב ערוצית.
הערה: כדי לקבוע ריכוזי תא מוצא אופטימליים, מומלץ להעריך את פרופיל הצמיחה של כל תא שורת תאי קו בצלחת 96-היטב על ידי זריעת תאים בכמה ריכוזים לבין מדידה יומית לפחות 4 ימים. בחר ריכוז זריעה המונע צמיחת יתר של תאים לאחר 72 שעות, כמו זה ישפיע על הניסוי על ידי להרוות את ערכי OD. לקבלת Panc-1 ותאי Panc-1R, ריכוז הזריעה האופטימלי הוא 8000 תאים / היטב. - הוספת 100 בינוני μl לבארות בינוניות רק דגירת הלילה בשעת 37 ° C עם 5% CO 2 כדי להבטיח הדבקה נאותה של תאי הצלחת.
- הכינו מגוון דילול התרופה של gemcitabine בין 1 מיקרומטר ו -10 ננומטר עבור Panc-1 ו -1 מ"מ ו 100 ננומטר עבור תאים Panc-1R. הוספת 100 μl מכל דילול לתוך באר מתאים של צלחת 96-היטב באמצעות pipet רב ערוצית. ודא שיש כל ריכוז בשלושה עותקים. בנוסף,להוסיף 100 בינוני μl על הבארות בינוניות רק ותאי השליטה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 72 שעות.
- הוסף פתרון TCA קר 25 μl על בארות באמצעות pipet הרב ערוצית דגירה צלחות במשך דקות 60 לפחות ב 4 ° C כדי לזרז ולתקן את החלבונים בתחתית הבארות.
- רוקן את הצלחת על ידי הסרת בקצרה בינוני ויבש על רקמה.
- לשטוף 5 פעמים עם מי ברז, ולאחר מכן רוקן את הצלחת ולתת להתייבש בטמפרטורת חדר.
- הוסף 50 פתרון SRB μl לכל טוב באמצעות החזרה repeat-pipet כתם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- רוקן את הצלחת על ידי הסרת כתם SRB.
- לשטוף 4 פעמים עם חומצה אצטית 1%, ולאחר מכן רוקן את הצלחת ולתת לו להתייבש בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 150 μl טריס פתרון לכל טוב באמצעות pipet הרב ערוצית ומערבבים במשך 3 דקות על צלחת-שייקר עד למקסימום של 900 שייקים / min.
- קראו את הצפיפות האופטית ב 540 ננומטר (או 492 ננומטר אם tהוא OD ערכים גבוהים מדי).
- לנתח את הנתונים.
- ניתוח נתונים של מבחני MTT ו SRB
- חשב את ערכי OD של תאים ב "יום 0" לפי הנוסחא הבאה: יום OD 0 = לתאי קבוצת OD - בארות ממוצעות OD ריק
- חישוב אחוזי התאים ששרדו עבור כל ריכוז תרופה על פי הנוסחא הבאה: תאי מטופלי% = הממוצע [בתאים שטופלו OD - בארות ריקות OD הממוצעים - יום OD 0] / [לתאי קבוצה OD - בארות ריקות OD הממוצעים - OD יום 0] * 100
- שרטט את עקומת מנה-תגובה (ריכוז התרופה לעומת עיכוב הצמיחה%).
- חשב את הריכוז של התרופה אשר מעכב את הצמיחה של תאים על ידי 50% (IC 50) באמצעות עקומת מנה-תגובה.
בידוד RNA 2. הכנת הספרייה-רצף RNA
- לדוגמא Collבידוד שיקוף ו- RNA
- עבור תאי CEM: למסוק 10 6 תאים ישירות בינוני תרבות.
- לקבלת Panc-1 ו Panc-1R: להסיר בינוני, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולנתק ידי הוספת טריפסין-EDTA ו דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הוסף בינוני תרבות למסוק 10 6 תאים.
- ספין למטה דגימות XG ב 300 במשך 3 דקות, להסיר supernatant ולחלץ mRNA הכולל באמצעות עמודות ספין קרום סיליקה זמינות מסחרי, על ידי ביצוע פרוטוקול manufacturer`s.
- קבע את הריכוז ואת טוהר RNA סך באמצעות ספקטרופוטומטר Vis-UV.
הערה: RNA נחשב בעלי טוהר מיוחד אם 260 ננומטר / 280 ננומטר יחס ספיגת הוא מעל 1.8. דוגמאות ניתן לאחסן ב - 80 ° C. - להעריך שלמות RNA הכולל ידי אלקטרופורזה של 200 ננוגרם של המדגם על ג'ל 1% agarose מוכתם ברומיד ethidium.
הערה: זיהוי של שתי להקות שלמות המתאימה rRNAs 28S ו 18S יונק בכ2 קילו ו 1 KB בגודל מעיד על שלמות RNA הכולל טובה.
- כנת ספריית רצף
- השתמש 2 מיקרוגרם של ה- mRNA הכולל לכל מדגם זה. עקוב פרוטוקול הכנה הספרייה mRNA על פי הוראות היצרן.
- לקבוע איכות וריכוז כל ספריה באמצעות מערכת bioanalyzer. פינת הספריות יחידות מדגם עד לריכוז סופי של 10 nmol / L ומודד אותו עם bioanalyzer.
- השתמש במערכת ההזמנות המקוונות רצף תפוקה גבוהה עם סינגל קרא 100 במצב נ"ב.
הערה: קרא אורך> 80 נ"ב יש צורך לזיהוי isoforms תעתיק.
3. איתור של שחבור דיפרנציאל מן הרצף קורא
- מערך של קורא על הפניה בדוקה הגנום ואיכות
- לקמפל ביאור גן (קובץ .gtf) משולחן צמח השדה refGene באמצעות דפדפן שולחן UCSC (25,963 גנים).
- לְבַצֵעַיישור של רצף ביאור-מודע ומרווחות מקריא הגנום הפניה (GRCh37) באמצעות STAR.
- מיין ואינדקס קבצי יישור וכתוצאה עם כלים פיקארד.
- לבצע בקרת איכות שלאחר מיפוי באמצעות RSeQC ו samtools.
- איתור שחבור הפרש בין קבוצות המדגמות
- תקן פייתון והגירסות מקבילות של numpy ו SciPy. הורד והתקן samtools. הורד והתקן עניבת פרפר ו tophat,
- מוסיפים את פייתון, עניבת פרפר, ספריות tophat ו samtools למשתנה הסביבה PATH $. אינדקסי עניבת פרפר שנבנה מראש להורדה (hg19). הורד rMATS גרסה 3.0.9.
הערה: פרטים נוספים על rMATS ניתנים 19 ו -34. - זיהוי אירועים שחבור חלופי על ידי השוואת כל קו התא דקס עמיד CEM-WT ו Panc-1 עד Panc-1R ב נפרד מחצלות פועל על פי איור 5 א.
- כדי לזהות אירועי שחבור הפרש מ previously רצף מיושר קורא (קבצים .bam), לרוץ מחצלות באמצעות הפקודות מתרשים 5B עבור CEM-WT לעומת CEM- C3, CEM-WT לעומת CEM-R5, CEM-WT לעומת CEM / R30dm ו Panc1 כדי Panc- השוואות 1R.
הערה: מחצלות תיצור תיקיית הפלט עם שני קבצי txt עם תוצאות בכל סוג של אירוע שחבור ניתח (SE - דילוג על אקסונים, A5SS - 5 חלופי "אחוי באתר, A3SS - 3 חלופי" אחוי באתר, MEX - אקסונים סותרים ו RI - שימור אינטרון): אחד קובץ תוצאות המכילות מבוסס על ספירת צומת רק וקובץ השני עם תוצאות המבוססות על ספירת צומת וקורא על היעד. יתר על כן, קובץ .txt נוסף עם סקירת תוצאה נוצר באותה התיקייה. - עבור SE, A5SS, A3SS וייבוא RI לגליונות אלקטרוניים של הקבצים .txt מבוסס על ספירת צומת וקורא על היעד. עבור MEX לייבא את קבצי txt מבוססים על ספירת צומת בלבד.
הערה: קובץ פלט מחצלות ממוין לפי סוג עולה P-ערכיים ומכילה מספר פרמטרים: גן זהות, סמל גן, כרומוזום ומצבת גדיל, קואורדינטות הגנומי של שברי שחבור החלופי, נחשבים גם את האורך של כלת דילוג צורות הן דגימות מנותחות, האורך של כלת דילוג טופס המשמש נורמליזציה, p-value, שיעור תגליות שגוי (FDR , רמה) הכללה עבור כל דגימה מבוססת על ספירה מנורמלת ואת ציון הכללת הפרש (ממוצע (IncLevel1) - ממוצע (IncLevel2)). - בחר גנים מועמדים מובהק סטטיסטית עם FDR <10% עבור לתיקוף נוסף (למשל, DDX5 ו PKM2).
- דמיינו אירועים שחבור חלופי עם Viewer ג'נומיקס אינטגרטיבית (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), כפי שדווח באיור 5.
אימות 4. של תוצאות ידי RT-PCR ו qRT-PCR מבחני
- עיצוב פריימר
הערה: כדי לספק אימות אמינה של תוצאות שהושגה באמצעות צינור bioinformatic, הטרנס mRNAcripts כתוצאה מאירועים שחבור חלופי הם מוגבר באמצעות RT-PCR ו דמיינו ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose של מוצרי ה- PCR. צבע ירוק Cyanine כגון SYBR ירוק assay qRT-PCR משמש לכמת שחבור מסוים גרסאות ביחס גן משק הבית. איור 7 מציג את האסטרטגיה המופעלת לדמיין את אירוע דילוג 12 אקסון של גן DDX5 ו לכמת את אקסון אקסון 9 ו מוציא 10 של גן PKM.- עבור assay RT-PCR, זוגות פריימר עיצוב אשר לחשל אקסונים מכוננים (אקסון 10 ו אקסון 13) ממוקמים במעלה או במורד באתרי השחבור החלופיים (איור 7 א).
הערה: גודל amplicon אמור לכסות בין 100 ל 800 נ"ב כדי להבטיח הפרדה ברורה של מוצרי ה- PCR ניבא על ג'ל agarose. טמפרטורת החישול של פריימרים צריכה להיות בין 55 ל 65 מעלות צלזיוס ואת תוכן GC לא יעלה על 60%. - Assay הירוק Cyanine (איור 7).
הערה: לקבלת PKM, פריימר ההפוכה anneals כדי אקסון 11 משותפים לשני הגירסות, בעוד פריימרים קדימה הם גרסה ספציפית לחשל אקסון 9 (PKM1) או אקסון 10 (PKM2). - על מנת לזהות גנים באורך מלא DDX5, לחשל פריימר הפוכה בתוך אקסון דלג (אקסון 12).
הערה: עבור זיהוי הספציפי של גרסת DDX5 ΔEx12, פריימר ההפוכה החובקת את exon11 / exon13 הגבול. השתמש באותו פריימר קדימה אשר anneals כדי אקסון המכונן 10 עבור שתי תגובות.
הערה: גודל amplicon צריך להיות בין 80 ל 200 נ"ב.
- עבור assay RT-PCR, זוגות פריימר עיצוב אשר לחשל אקסונים מכוננים (אקסון 10 ו אקסון 13) ממוקמים במעלה או במורד באתרי השחבור החלופיים (איור 7 א).
- הגדרת שעתוק לאחור של 1 מיקרוגרם של RNA בודד כדי cDNA באמצעות 200 U / μl של וירוס לוקמיה Moloney Murine (M-MLV) reverse transcriptase בתגובת החיץ שלה מדולל 1: 5 עם מים סטריליים. להוסיף DTT 1 מיקרומטר, 0.05 מיקרוגרם של hexamers אקראי, תמהיל deoxynucleotide (dNTP) 1 מ"מ, ו -40 U / μl של מעכב ריבונוקלאז.
- וורטקס בקצרה דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- דגירת תערובת התגובה על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית transcriptase ההפוכה, להעביר את התערובת על קרח ומסובב באמצעות microcentrifuge. דוגמאות ניתן להשתמש מיד או לאחסן ב - 20 ° C.
- הגדר את תגובת PCR בתוך שפופרת PCR לכל מדגם ידי ערבוב 12.5 μl של 2x מרוכזים mastermix PCR, 1.25 μl של 10 פריימר מיקרומטר קדימה ואת אותה כמות של פריימר הפוכה עד לנפח סופי של 25 μl עם מים סטריליים.
- הוסף 1 μl של cDNA לתערובת ומקום הצינורות ב thermocycler. הפעל את התכנית כדלקמן: denaturation ראשונית: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.לחזור על השלבים הבאים עבור 35 מחזורים: denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות; חישול ב 52 מעלות צלזיוס למשך 35 שניות; הארכה ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. גדר רחבה סופי על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הכן ג'ל agarose 1% על ידי המסת 1 גרם של agarose ב 100 מ"ל 1x חיץ TBE. להוסיף 2.5 μl של ברומיד ethidium לפתרון. זהירות: ברומיד ethidium הוא מסרטנים, להתמודד עם טיפול באמצעות במנדף כימי.
- טען את הדגימות ולהפעיל את הג'ל במאגר 1x TBE ב -100 V עבור כ 30 דקות מערכת אלקטרופורזה.
- לחשוף את הג'ל עם מצלמת UV דיגיטלית ולשמור את התמונה.
- הגדר את תגובת PCR ירוק Cyanine לכל מדגם ידי ערבוב 12.5 μl של mastermix PCR ירוק 2x, 2 μl של פריימר 5 מיקרומטר קדימה ואת אותה כמות של פריימר הפוכה עד לנפח סופי של 15 μl עם מים סטריליים צינור PCR . להכין תערובת לכל שחבור מסויםגרסה כדי להתגלות (PKM1, PKM2, באורך מלא DDX5, DDX5 ΔEx12) ועבור גן משק (גאס).
- טענתי את mastermix על צלחת 96-גם לבנה ולהכין כפילויות לכל מדגם.
- לדלל את 10x cDNA במים, מוסיפים 5 μl לכל שילוב ומניחים את הצלחת thermocycler. הפעל את התכנית כדלקמן: denaturation ראשונית: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לחזור על השלבים הבאים במשך 45 מחזורים: denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; חישול ב 58 ° C (DDX5 ו DDX5 ΔEx12 מתערבב) או 60 ° C (PKM1 ו PKM2 מתערבב) במשך 20 שניות. גדר רחבה סופי על 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. הגדר נמס עקומת ידי החלת שיפוע 65 כדי 97 ° C.
- על מנת להעריך את הספציפיות של קבוצות פריימר כדי היעד שלהם, לבדוק את עקומות ההיתוך ולוודא כי שיא יחיד נוצר לכל קבוצת פריימר.
- חשב את הערכים הנגזרים שנייה של עקומות ההגברה ולייצא את ערכי סף מחזור (CT).
- calculatדואר רמות הביטוי היחסי (REL) של אחוי mRNA גרסאות לעומת משק גאס (הפניה) גנים כל דגימה באמצעות "דלתא CT (ΔCt)" השיטה. הנוסחה היא: REL = 2 - ΔCt, שבו ΔCt = גרסה אחוי היעד CT - התייחסות Ct הגן
- על מנת לכמת את השפע היחסי של וריאנטים אחוי, לחשב את יחס REL באמצעות נוסחא: אחוי 1 / REL גרסת אחוי היחס REL יחס = REL הגרסה 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבחני הרעילות כמתוארים בפרוטוקול לספק שיטה אמינה ויציבה כדי להעריך את ההתנגדות של תאים סרטניים תרופות כימותרפיות במבחנה. באמצעות מבחן MTT, רגישות דקס נקבע בארבעה T-ALL שורות תאים, כולל דקס רגיש תאים CEM-WT הורים, ושלושה sublines דקס עמיד: CEM / R30dm, CEM-R5 ו- CEM-C3. שני טווחי ריכוז שונים היו צריך לשמש עקב ההפרש הגדול ברגישות בין CEM-WT (2 מיקרומטר - 0.97 ננומטר) ואת שורות תאים העמידות דקס (640 מיקרומטר - 0.33 ננומטר). מבחן MTT הראו בבירור התנגדות דקס ב CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 מיקרומטר), CEM-R5 (IC 50> 640 מיקרומטר) CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 מיקרומטר) לעומת CEM- תאי WT (IC 50 = 0.028 ± 0.003 מיקרומטר). בדומה לכך assay SRB הפגין התנגדות gemcitabine גבוהה שורת תאי Panc-1R (IC 50 = 3.16 ± 0.01 מיקרומטר) לעומת התאים Panc-1 ההוריים (IC 50 = 0.077 ± 0.03 מיקרומטר) כפי הראה באיור 2.
בעקבות אישור של עמידות לתרופות בכל שורות התאים הנחשבות, אנחנו הבאים המשכנו בידוד mRNA, כנת ספרייה-רצף RNA. הפקת mRNA הכולל באמצעות עמודות ספין קרום סיליקה היא הבחירה המועדפת על פני שיטות אחרות מאז זה ימנע זיהום פנול וחלבון ומספק טוהר גבוה של המדגם עם יחס ספיג 260 ננומטר / 280 ננומטר הרבה מעל 1.8. זוהי דרישה חיונית עבור יישומים מורכבים במורד כגון רצף עמוק. השיטה משמשת כדי לבדוק את תקינות הדגימות רנ"א על ידי agarose 1% היא מתאימה במיוחד עבור תאים מבודדים טרי (איור 3). כיוון שמטרת פרוטוקול זה היא לזהות וריאנטים אחוי חלופיים הביעו aberrantly בשורות תאי תרופה עמידות, אנו בוחרים selectio החיוביתn של mRNA polyadenylated לעריכת ספריית רצף, באמצעות ערכת mRNA תקועה. Electropherograms של ספריות יחידות ונקוו מתואר באיור 4, מראה גודל שבר ממוצע של כ -300 נ"ב, עולה בקנה אחד עם דרישות מערכת רצף. הספריות המוכנות היו רצף מכן באמצעות שבב עם סינגל קראו 100 במצב נ"ב. הבחירה של רצף קורא של 100 נ"ב יש צורך לזהות שחבור חלופי דרך צינורות bioinformatic במורד הזרם.
לאחר צעדי עיבוד ראשוניים ובקרת איכות, הנקי קוראת מיושר הגנום האנושי (hg19) היו נתונים דיפרנציאלי ניתוח שחבור באמצעות מחצלות. בניתוח זה עשינו השוואות בין שורת תאים רגישים סמים הורים וכל אחד התרופה שלה עמיד sublines בנפרד (כלומר, CEM WT לעומת CEM / R30dm, CEM WT לעומת CEM-C3, וכו '). מחצלות מסתמכות על מודל סטטיסטי גמיש ומדויקהמשמש לאיתור שחבור הפרש בין דגימות. באמצעות אפשרויות ניתוח מחדל ערך FDR <10% כמו חתוכים (מתואר באיור 5 ב), הצלחנו לזהות 38 ± 12 מועמדי גן משמעותיים שחבור דיפרנציאלי לכל השוואה המסודרת על פי סוג אירוע שחבור חלופי, עם רוב הלהיטים המסווגים דילוג אקסון. איור 6 מציג פלט ניתוח אופייני ההשוואה Panc-1 לעומת Panc-1R.
בנוסף, אנו מתמקדים במחקר שלנו על שני הסוגים הנפוצים ביותר של אירועי שחבור חלופי: דילוג אקסון ואירועים אקסון סותרים עם המועמדים נציג אחד לכל קטגוריה כמתואר להלן. DDX5 (helicase-box DEAD 5) זוהה על ידי ניתוח מחצלות כמו מובהק סטטיסטית בהשוואה CEM-WT לעומת CEM-C3 ו- CEM-R5, אבל לא משמעותי השוואה CEM-WT לעומת CEM / R30dm. בהתחשב התפקיד המשוער שלה ללוקמיה 25,26, אנולבחור מועמד זה עבור אימות נוספת. מומלץ מאוד לדמיין נתוני seq-רנ"א כלי דפדפן דמוי הגנום. IGV מספק ממשק צדדי וידידותי למשתמש למטרה זו, כפי שמוצג באיור 7 עבור DDX5 מועמד הגן. PKM (איזואנזים שריר קינאז פירובט) הוא אירוע אקסון בלעדי מובהק סטטיסטי הדדית ההשוואה CEM-WT לעומת כל דקס עמיד sublines, אבל לא ההשוואה Panc-1 לעומת Panc-1R. בהתחשב הרלוונטי של אנזים זה במטבוליזם גידולים מוצק 27,28 והתפקיד המתעורר של חילוף חומרים בתא בהתנגדות בסטרואידים ב T-ALL 29, אנו בוחרים מועמד זה עבור אימות נוספת באמצעות RT-PCR.
חייב להתנהל עיצוב פריימר בזהירות רבה על מנת להגביר את amplicon הנכונה, במיוחד כאשר לחשל פריימרים כדי אקסון-אקסון גבולות (במקרה של פריימר הפוכה באיתור חלופה DDX5 ΔEx12) או כאשר tהיי לחשל אקסונים סותרים עם הומולוגיה ברצף גבוהה (אקסון 9 ו אקסון 10 של PKM). איור 8 מציג את אסטרטגית עיצוב פריימר, בעוד איור 9 מציג את התוצאות של מועמד גן RT-PCR עבור DDX5. DDX5 ΔEx12 מזוהה במדגם CEM-WT ו CEM / R30dm אך לא CEM-C3 ו- CEM-R5, ובכך אישר נתונים מחצלות בצורה איכותית. Cyanine ירוק assay qRT-PCR מכמת את רמות ביטוי mRNA במדויק של וריאנטים DDX5 ו PKM אחוי, כפי שמוצג באיור 10 ואיור 11, בהתאמה.
איור 1: ייצוג סכמטי של אירועים שחבור חלופי. ייצוג סכמטי של דפוסים האפשריים של שחבור החלופי של גן. קופסות הן אקסונים דיסקרטיים שיכול להיכלל באופן עצמאי או מחוץ מרתמליל NA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תוצאות של מבחני Cytotoxicity. (א) assay MTT עבור שורות תאים leukemic מראה רמות גבוהות של התנגדות dexamethasone ב CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98), CEM-R5 (IC 50> 640 מיקרומטר) CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 מיקרומטר כמו) לעומת CEM-WT (IC 50 = 0.028 ± 0.003 מיקרומטר הורים). (ב) מבחני SRB עבור שורות תאי קרצינומה הלבלב לחשוף רמות גבוהות של התנגדות gemcitabine ב Panc-1R (IC 50 = 3.16 ± 0.01 מיקרומטר) לעומת Panc-1 ההורי (IC 50 = -77.22 ± 2.76 ננומטר). הגרפים לדווח% צמיחת תאים ממוצעים ± SEM של שלושה indepניסויי endent. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: להערכת איכות RNA באמצעות ג'ל agarose. מאתיים ng בסך הכל mRNA נוהלו על ג'ל 1% agarose מוכתם ברומיד ethidium. הנוכחות של להקות שלמות המתאימות RNA ריבוזומלי (rRNA) מינים 18S ו -28 והיעדרי מריחות ב משקל מולקולרי נמוך מעידה על RNA באיכות טוב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: <עקבות strong> Bioanalyzer של ספריות רצף. (א) Electropherograms של ספריות רצף להראות פסגות בכ -300 נ"ב, אשר מעיד על איכות טובה. לדוגמא 1 עד 6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 ו Panc-1R. (ב) electropherogram של דגימות ותקווינה (FU, יחידות קרינה).
איור 5: איתור של שחבור דיפרנציאל עם מחצלות. (א) השוואות קבוצה (B) סקריפטים המשמשים להפעלת מחצלות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:
איור 7: ויזואליזציה של שחבור דיפרנציאל מועמד DDX5 ג'ין דרך דפדפן הגנום IGV. קבצים עם מיושר הקורא (.bam) מתאים תאי leukemic הועלה על דפדפן הגנום IGV ו מדמיין באמצעות מגרשי סשימי (ערך ספירת צומת מינימום = 10 לדמיין אירועי שחבור משמעותיים). אחוי ספירת צומת מיוצגת על ידי חיבור קוויםמספר התואם את-seq RNA קורא פורש את האקסונים. CEM-WT ו CEM / R30dm להראות ספירת דילוג פורש אקסון 11 עד אקסון 13 לעומת CEM-C3 ו- CEM-R5 אשר לא מראים שום דילוג אקסון 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8: עיצוב פריימר עבור RT-PCR ו Cyanine הירוק qRT-PCR. (א) RT-PCR: זוגות פריימר גילוי שחבור ההפרש של לחשל DDX5 כדי אקסונים המכונן (אקסון 10 ו אקסון 13) ממוקם במורד הזרם מן אקסונים שחבור חלופי. (ב) assay qRT-PCR: כימות היחסית של תמלילי הנובעים מאירועים דילוג אקסון לעומת תמלילי קנוני, פריימר הפוכה anneals או בתוך (גרסה חלופית) אקסון לדלג אואל גבול exon11 / exon13 (גרסה הקנונית) של גן DDX5. עבור כימות של אקסונים סותרים, פריימר הפוכה anneals כדי אקסון 11 המשותפים לשני isoforms, בעוד לחשל פריימר קדימה או כדי אקסון 9 (PKM1) או אקסון 10 (PKM2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9: RT-PCR תיקוף DDX5 דיפרנציאל שחבור. 1% ג'ל agarose מראה שחבור הפרש של גן DDX5 בתאי leukemic. שהבר המתאים DDX5 amplicon באורך מלא (650 נ"ב) מוגבר בכל הדגימות תוך DDX5 ΔEx12 (430 נ"ב) גרסה מוגברת CEM-WT ו CEM / R30dm המדגמת ואת הגודל מתאים מדלג 12 אקסונים. זה לא זוהה CEM-C3 ותאי CEM-R5, כמו להרתיעממוקש ידי ניתוח מחצלות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 10: רמות ביטוי mRNA של DDX5 אחוי נוסחים שונים בתאי CEM. (א) assay qRT-PCR. ממוצע רמות הביטוי היחסי ואת סטיית התקן של הממוצע (SEM ± REL) של שני ניסויים בלתי תלויים. יחס (B) של REL (± SEM) של גרסאות אחוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 11: רמת ביטוי mRNAים של PKM אחוי וריאנטים CEM ו Panc-1 תאים. (א) assay qRT-PCR. ממוצע רמות הביטוי היחסי ואת סטיית התקן של הממוצע (SEM ± REL) של שני ניסויים בלתי תלויים ויחס של REL של וריאנטים אחוי עבור תאים CEM. (ב) assay qRT-PCR. Mean REL ± SEM של שני ניסויים בלתי תלויים ויחס של REL (± SEM) של גרסאות אחוי עבור תאים Panc-1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים גישה חדשנית המשלבת טכניקות הקרנת cytotoxicity ומבוססות transcriptomic NGS החזק המבוססים מנתח לזהות אירועי שחבור הפרש ביחס עמידות לתרופות. מבחני spectrophotometric שיטות נוחות ויציבות תפוקה גבוהה כדי להעריך רגישות תרופה במודלי סרטן במבחנה ולייצג את הבחירה הראשונה למעבדות רבות ביצוע הקרנות cytotoxicity. פתרון בעיות כמו גם וריאציות אפשריות עבור שיטה זו תוארו בהרחבה במקום אחרת 4,5.
גנומי התפוקה גבוהה ניתוחי המשמש כיום כדי לחקור מנגנונים עמידים לתרופות להסתמך בעיקר על זיהוי SNPs ו דיפרנציאלי ביטוי להערכת גנים הקשורים פנוטיפ עמיד לתרופות מסוים. במחקר זה, אנו מתארים את השימוש בשיטות רצף RNA, יחד עם צינורות ביואינפורמטיקה חזקים ביאור מדויק של תעתיקי mRNA וזיהוי של DIFשחבור ferential. תכונה חשובה במיוחד של הפרוטוקול המתואר היא היכולת לזהות וריאנטים אחוי רומן בין שתי קבוצות מדגמות עם פרופילים רגישים לתרופה ברורים. אחד הצעדים הקריטיים עבור ניתוח מדויק ובלתי משוחד הוא הבידוד של RNA, אשר חייב להיות של טוהר ושלמות גבוהים.
מחצלות היא התוכנה שאנו בוחרים מבין סדרת כלים ביואינפורמטיקה דומה זמין (למשל, 2 Cuffdiff, DEXseq, DiffSplice שחבור מצפן) לצורך זיהוי של שחבור חלופי 18. התכונות העיקריות העיקריות שהופכות אותו האופציה המועדפת הן הדיוק והדיוק המעולה שלה, כמו גם את האפשרות לזהות אירועי רומן. מחצלות מייצרות שני סוגים של ניתוח שחבור פלט המכיל הפרש: הראשון מבוססות רק על ספירת צומת אקסון ואת השני מבוססות על ספירת צומת כמו גם קורא על היעד. בעוד השני הוא העדיף לאיתור אקסון דילוג אירועים, מומלץלהשתמש באפשרות הראשונה לניתוח של אקסונים שדוחות כמו גישה זו מפחיתה את מספר מועמדים חיוביים כוזבים עבור סוג מסוים של שינוי שחבור.
יתר על כן, עבור ניתוחי התמקדות שימור אינטרון, 3 אלטרנטיבה 'ו -5 אירועי אחוי אתר, קובץ .gtf עם אינטרונים מבוארים אמורים לשמש. בסופו של דבר, על מנת להפחית השתנות ביולוגית וטכנית בתוך קבוצות המדגם ולהבטיח שיעור גבוה נכון חיובי, מומלץ מאוד כדי רצף לפחות שלושה משכפל 34. הבחירה של מועמדי גן שחבור דיפרנציאלי מבוססים על פלט מחצלות אוחדה עם צעד אימות באמצעות RT-PCR. זה חשוב ביותר עבור הבחירה של וריאנטים חיובי אמיתי בין רשימה גדולה של מועמדים משמעותיים סטטיסטי. הגורם המרכזי עבור אימות מדויקת הוא העיצוב של oligonucleotides ואת אופטימיזציה של PCR תגובות על פי סטנדרטי ביולוגיה מולקולריים. זהירות מיוחדתיש לנקוט בעת תכנון פריימרים פורש צומת אקסון-אקסון וצעדי אימות נוספים, כגון רצף של amplicons בשיטת סנגר, הם ערובה כדי לאשר הספציפי שלהם.
שחבור ההפרש של תמלילי DDX5 ו PKM זוהו על ידי מחצלות מייצגות שתי דוגמאות של שחבור סוטה הקשורות עמידים לתרופות. DDX5 ΔEx12 לא באה לידי ביטוי שורות תאים עמידים GC (CEM-C3 ו- R5), אשר נבחרו לאחר חשיפה ממושכת דקס. DDX5 ΔEx12 התבטא הקו הסלולרי ההורים אלא גם subclone CEM / R30dm, אשר נבחר להתנגדות לסוכן כימותרפיות MTX ולא דקס. בתאים סרטניים, PKM2 התבטאה בהשוואה מאוד PKM1 גרסת אחוי שלה, אבל PKM2 היחס / PKM1 היה גבוה יותר תאים עמידים דקס, כפי שהוצע על ידי תוצאות NGS. זה לא נצפה למדגם Panc-1 לעומת עמיתו gemcitabine העמיד שלה, ואכן, גן המועמד זה לא היה ביןהאירועים המשמעותיים סטטיסטית בניתוח מחצלות. זה עשוי לשקף את סוג מנגנון תאים השונים של עמידות לתרופות מושרות על ידי חשיפת gemcitabine.
לסיכום, פרוטוקול זה מהווה פתרון ראוי על גילוי גרסאות אחוי אשר עשוי בבסיס עמידות לתרופות ויכול להיות מיושם גם לתאים leukemic 30 או תאים סרטניים מוצקים 31. מגבלה ברורה היא כי שורות תאים סרטניים ללכוד רק חלק קטן של ההטרוגניות סרטן. יתר על כן, שורות התאים ביותר קוימו במשך שנים רבות monolayers במדיה מקדם גדילה. תנאים אלה משפיעים מאפיינים הסלולר, וכתוצאה מכך הבחירה של תת-אוכלוסיות שונות באופן דראמטי מן התאים של הגידולים הראשוניים שממנו הם נובעים. עם זאת, רבים מהגנים המעורבים עמידות לתרופות מעורבים גם פונקציות תא מרכזיות אחרות כגון גדילת התא אפופטוזיס שעשוי להיות מושפע culturin לטווח ארוך g בפלסטיק. לכן, על מנת לשפר את המחקר של עמידות לתרופות, צריכים להשקיע יותר מאמצים להיות מכוונים לפיתוח של במודלים פרה רומן, כגון תרבויות xenografts עיקריות, כי לחקות באופן הדוק יותר במייקרו-הסביבה של סרטן vivo ב כדי למנוע שינויים רלוונטיים מאפיינים הסלולר הנגרם על ידי תקופות ממושכות של תרבות תאים ותנאי תרבות. 32 למרבה הפלא, פרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם גם תאים ראשוניים, באמצעות מבחני cytotoxicity כדי לקבוע vivo לשעבר ערכים 50 IC. מגבלה נוספת היא שמאז מנגנונים רבים של התנגדות להתקיים עבור כל תרופה נגד סרטן, מנגנונים דומים או שונים של התנגדות יכולים להתפתח בתאים שנחשפו טיפולים זהים אך עצמאיים. לכן, אסטרטגית מבחר השוואתית צריכה לערב בחירות במקביל וניתוחים, כוללים אנליזה גנטית על גרסות שחבור, של אותם תאים ההורים שטופלו באותו סוכן כימותרפיה.
jove_content "> גישות נוספות עבור אימות פונקציונלית צריכה להיות מכוונות overexpressing גרסת אחוי של עניין שורות תאים או downregulate הביטוי שלהם במיוחד באמצעות התערבות RNA או oligonucleotides מיתוג-אחוי 33.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
References
- Gottesman, M. M.
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
- Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
- Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
- Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
- Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
- Shendure, J., Ji, H.
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
- Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
- Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
- Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
- Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
- Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
- Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
- Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
- Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
- McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
- Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
- Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
- Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
- Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
- Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
- Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
- Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
- Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
- Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).
