Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54714
Automatic Translation
1,2,3, 1, 4, 3, 5, 6, 1,7, *1, *3,8,9
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Abstract

Geneesmiddelenresistentie blijft een groot probleem in de behandeling van kanker voor zowel hematologische maligniteiten en vaste tumoren. Intrinsiek of verworven resistentie kan worden veroorzaakt door een aantal mechanismen, waaronder verhoogde eliminatie van het geneesmiddel, verminderde geneesmiddelopname, drug inactivatie en veranderingen van drug targets. Recente gegevens toonden aan dat anders dan door bekende genetische (mutatie, versterking) en epigenetische (DNA Hypermethylering, histone post-translationele modificatie) modificaties, resistentie tegen geneesmiddelen mechanismen kan ook worden gereguleerd door splicing aberraties. Dit is een snel groeiend gebied van onderzoek dat toekomstige aandacht om meer effectieve therapeutische benaderingen plannen verdient. De in dit document beschreven protocol is gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splitsing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van verschillende in vitro modellen door middel van RNA-seq en stellened een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren. In het bijzonder, evalueerden we de differentiële splicing van DDX5 en PKM transcripties. De afwijkende splitsing gedetecteerd door de rekenkundige functie MATS werd gevalideerd in leukemische cellen, wat aantoont dat verschillende DDX5 splice varianten zijn tot expressie gebracht in de ouderlijke vs. resistente cellen. In deze cellen zagen we ook meer PKM2 / PKM1 verhouding, die niet werd gedetecteerd in de Panc-1 gemcitabine-resistente tegenhanger in vergelijking met ouderlijke Panc-1-cellen, suggereert een ander mechanisme van resistentie geïnduceerd door blootstelling gemcitabine.

Introduction

Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de behandeling van kanker, resistentie van kwaadaardige cellen voor chemotherapie, intrinsiek of bij langdurige blootstelling aan het geneesmiddel verkregen, is de belangrijkste oorzaak van falen van de behandeling in een breed scala van leukemie en vaste tumoren 1.

Om de onderliggende mechanismen resistentie, in vitro cellijn modellen bakenen ontwikkeld door stapsgewijze selectie van kankercellen resistent zijn tegen chemotherapeutica. Deze procedure bootst de regimes worden gebruikt in de klinische settings en maakt daarom een ​​diepgaand onderzoek van de relevante mechanismen weerstand. Resistente cellen die de behandeling overleven worden vervolgens uit ouderlijke gevoelige cellen gekenmerkt met cellevensvatbaarheid / cytotoxiciteitassays 2. In vitro resistentie profielen van primaire cellen bleken significant gerelateerd aan klinische respons op chemotherapie 3 te zijn.

High-throughput cytotoxiciteit testen vormen een geschikte methode om geneesmiddelgevoeligheid in vitro bepalen. Hierin wordt de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld door bijvoorbeeld de 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromide - MTT assay 4, die is gebaseerd op de metabole omzetting van bepaalde substraten (dwz tetrazoliumzouten) in gekleurde producten, waardoor de mitochondriale activiteit van cellen weerspiegelt. Als alternatief kan de cellulaire eiwitten worden gekwantificeerd met behulp van de sulforhodamine B (SRB) test 5. Hier is het aantal levensvatbare cellen is evenredig met de optische dichtheid (OD) gemeten bij een geschikte golflengte in een spectrofotometer, zonder behoefte uitgebreide en tijdrovende procedures celtellingen. De groeiremming veroorzaakt door een bepaald chemotherapeutisch geneesmiddel kan worden berekend op basis van de buitendiameter van de putjes die cellen werden behandeld met een testmiddel en vergeleken met de OD van onbehandelde controlecellen. Een dosis-response curve OBTAined door het uitzetten geneesmiddelconcentratie versus percentage levensvatbare cellen ten opzichte van controle cellen. Tenslotte kan geneesmiddelgevoeligheid worden gerapporteerd als de concentratie die resulteert in 50% van de celgroei remming vergeleken met onbehandelde cellen (IC 50).

De onderliggende mechanismen geneesmiddelresistentie omvatten vele verschillende afwijkingen zoals veranderingen beïnvloeden genexpressie determinanten medicijnactiviteit en cellulaire metabolisme. Deze moleculaire laesies, met inbegrip van mutaties, afwijkingen bij een transcriptionele en post-transcriptionele niveau als gestoorde epigenetische regulatie vaak van invloed op genen die betrokken zijn, hetzij in het metabolisme van geneesmiddelen of apoptose 6.

Alternatieve pre-mRNA splicing en zijn ingewikkelde regelgeving hebben onlangs veel aandacht als een nieuwe entiteit die geneesmiddelen resistentie van kankercellen 7 kan dicteren. Tot 95% van de menselijke genen alternatief gesplitste in normale cellen door middel van dezestrak gereguleerd proces waarbij verschillende isovormen eiwit produceert uit hetzelfde gen. Alternatieve splicing is vaak gedereguleerd bij kanker en verscheidene tumoren worden gekenmerkt door veranderde splicing van steeds meer genen betrokken bij geneesmiddelmetabolisme (dwz desoxycytidinekinase, folylpolyglutamaat synthetase of Multidrug resistentie eiwitten) 6,8. Echter, uitgebreide analyse van splicing profielen van geneesmiddelen resistente cellen pijnlijk ontbreekt. Daarom is het noodzakelijk om hoge doorvoer werkwijzen voor alternatieve splicing analyse ontwikkelen. Dit zou kunnen helpen om meer effectieve therapeutische benaderingen te ontwikkelen.

Tijdens het laatste decennium heeft de snelle ontwikkeling van de volgende generatie sequencing (NGS) technologieën voor biomedisch onderzoek met nieuwe inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag regulatie van het genoom meningsuiting en hun rol in verschillende biologische processen 9 verrijkt. RNA-sequencing (RNA-seq) is een krachtige sub-applicatievan NGS op het gebied van transcriptomics. Het kan een genoom-brede profilering (kwalitatief en kwantitatief) van de expressiepatronen van duizenden genen tegelijkertijd is zeer geschikt voor de karakterisering van nieuwe coderende mRNAs als lange niet-coderende RNA, miRNA, siRNA en andere kleine RNA klassen (bijv snRNA en Pirna) 10,11.

RNA-Seq heeft vele voordelen ten opzichte van eerdere technieken voor transcriptoom karakterisering (bijvoorbeeld Sanger sequentiebepaling en expressie microarrays). Het is niet gebaseerd op bestaande genoomannotatie, het heeft een enkele nucleotide resolutieniveau en een breder dynamisch bereik voor expressieniveau schatting. In het kort, de basis experimentele workflow van RNA-seq experimenten bestaat uit gepolyadenyleerd transcript (mRNA) selectie en fragmentatie, gevolgd door omzetting in cDNA, bibliotheek bouw en ten slotte, massaal parallelle deep sequencing 12,13. Door snelle daling van sequencinkosten g in de afgelopen jaren, RNA-seq wordt geleidelijk vervangen door andere technologieën en aanzienlijke inspanningen worden gedaan om de bibliotheek voorbereiding protocollen te verbeteren. Zo is het mogelijk om de streng informatie van mRNA transcripten behouden door het markeren van de tweede cDNA-streng met deoxyuridine trifosfaat (dUTP) en voorafgaand aan PCR amplificatie, digereren de gemerkte streng met uracil-DNA-glycosilase (UDG). Dit proces verbetert de nauwkeurigheid van gen-annotatie en de schatting van de expressie levels 14,15.

Het analyseren en interpreteren van RNA-seq data vereisen complexe en krachtige computationele softwarepakketten en verwerking in bioinformatica pijpleidingen 16,17. Ten eerste, de rauwe leest kwaliteitscontrole ondergaan door het wegnemen van technische en biologische artefacten en weggooien (trimmen) de sequenties die geen strenge kwaliteitseisen niet bereiken. Vervolgens wordt het bed voor elk monster worden toegewezen aan een referentie genoom en geïndexeerdin gen-niveau, exon-niveau of transcript niveau, teneinde de overvloed van elke categorie bepalen. Afhankelijk van de toepassing, zijn verfijnde data vervolgens berekend door middel van statistische modellen voor de identificatie van allel-specifieke expressie, alternatieve splicing, gen fusies en single nucleotide polymorphisms (SNPs) 12. Ten slotte kan differentiële analyses op geselecteerde niveau (dat wil zeggen, genexpressie of alternatieve splicing) worden gebruikt om monsters die onder verschillende omstandigheden te vergelijken.

Differentiële splicing analyse beschrijft de verschillen in splice gebruik van de site tussen de twee monsters. Steeds softwarepakketten is voor dit doel zijn gebaseerd op verschillende statistische modellen, uitvoeringen en gebruikersinterface 18. Onder deze, MATS (Multivariate analyse van Transcript verbinden) naar voren als een vrij beschikbaar en precieze computational tool gebaseerd op een Bayesian statistische kader en ontworpen om diffe detecterenrential splicing gebeurtenissen uit enkele of gepaarde end RNA-seq data. Vanaf de uitgelijnde (.bam) bestanden, kan MATS detecteren alle belangrijke types van alternatieve splicing gebeurtenissen (exon skipping, alternatieve 3'-splitsingsplaats, alternatieve 5'-splitsingsplaats, elkaar uitsluitende exons en retentie intron - zie ook figuur 1).

Ten eerste, de software identificeert leest die een zekere verbinding gebeurtenis, bij voorbeeld exon skipping en classificeert ze in twee types. "Inclusion leest" (voor de canonieke splice event) kaart binnen de onderzochte exon en span de verbindingen tussen die specifiek exon en de twee upstream en downstream flankerende exonen. "Skipping leest" (voor de alternatieve splice event) overspannen de kruising tussen de twee flankerende exonen. Vervolgens MATS geeft de genormaliseerde opname niveau voor zowel de canonieke en alternatieve evenementen en vergelijkt waarden tussen de monsters of voorwaarden. Uiteindelijk berekent P-waarde and valse ontdekking rate (FDR) aangenomen dat het verschil in de verhouding variant van een gen tussen twee voorwaarden een bepaalde door de gebruiker gedefinieerde drempel voor elke splitsing gebeurtenis 19,34 overschrijdt.

Naar aanleiding van differentiële splicing analyse in combinatie met RNA-seq, is een uitgebreide experimentele validatie gerechtvaardigd om true-positieve kandidaten 18 gen te identificeren. Kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (qRT-PCR) is de meest gebruikte en optimale methode validatie kandidaten verkregen uit RNA-Seq analyse 20. Het doel van dit artikel is om een ​​robuuste methodologie om resistentie gerelateerde splicing profielen in solide tumoren en hematologische maligniteiten onderzoeken bieden. Onze aanpak maakt gebruik van RNA-seq-gebaseerde transcriptoom profilering van geselecteerde cellijn modellen van resistente vormen van kanker in combinatie met een gevestigde qRT-PCR-methode voor de validatie van kandidaat-genen betrokken bij resistentie tegen geneesmiddelen.

21,22 en de methotrexaat (MTX) resistente sublijn CEM / R30dm 23. Hoewel de huidige therapieën op basis van GC en MTX vestigen klinisch voordeel bij ongeveer 90% van de gevallen, de opkomst van GC-resistentie vormt nog steeds een onopgelost probleem met een onduidelijke moleculaire mechanisme. GC-resistente subklonen isoleren CEM-WT cellen werden gekweekt in 1 uM dexamethason (Dex) gedurende 2 tot 3 weken. MTX-resistente sublijn CEM / R30dm werd ontwikkeld door middel van herhaalde korte termijn (24 uur) blootstelling van CEM-WT-cellen tot 30 uM MTX als een nabootsing van de klinische protocollen. Interessant is weergegeven deze cellijn ook kruisresistentie Dex (niet gepubliceerde resultaten) waarvoor het mechanisme niet volledig begrepen.

De vaste tumof model onderzocht in deze studie is de pancreas ductaal adenocarcinoom, berucht om zijn buitengewone ongevoeligheid voor chemotherapie. Daartoe selecteerden we Panc-1 cellijn en gemcitabine-resistente subkloon Panc-1R verkregen door continue incubatie met 1 uM van het geneesmiddel 24. Hier beschrijven we een benadering om nieuwe onderliggende mechanismen in vitro geneesmiddelresistentie ontdekken combineert drie protocollen: colorimetrische cytotoxiciteit assays geneesmiddelgevoeligheid in leukemische cellen en kankercellen van solide tumoren, RNA-seq gebaseerde pijpleiding beoordelen op nieuwe splice-varianten met betrekking tot identificatie geneesmiddelgevoeligheid / resistentie en RT-PCR en qRT-PCR analyse potentiële kandidaten valideren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Karakterisering van Drug Resistance Profiles door middel van cytotoxiciteitassays

  1. Leukemische cellijn Cultuur
    1. Handhaaf de ouderlijke T-cel ALL cellijn CCRF-CEM (CEM-WT) en zijn resistente sublijnen, zoals CEM / R30dm, CEM-R5 en CEM-C3, in 25 cm 2 in 10 ml RPMI-1640 medium dat 2,3 uM foliumzuur aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en 100 eenheden / ml penicilline G en 100 ug / ml streptomycine.
    2. Cultuur van de cellen in een vochtige atmosfeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
    3. Sta celgroei concentraties van 2-3 x 10 6 cellen / ml.
    4. Splits de cellen twee keer per week bij een initiële concentratie van 0,3 x 10 6 cellen / ml (bijvoorbeeld wanneer de celconcentratie is 3 x 10 6 cellen / ml, breng 1 ml celsuspensie in een nieuwe kolf met 9 ml vers medium). Gooi de cultuur na 20 opeenvolgende passages.
    Pancreascarcinoom Cell Line Cultuur
    OPMERKING: Houd de humane pancreas carcinoma cellijn Panc-1 in 75 cm2 kolven in 10 ml DMEM-medium met hoog glucosegehalte en L-glutamine, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 eenheden / ml penicilline G en 100 ug / ml streptomycine . De drug resistente variant, Panc-1R, gekweekt in hetzelfde kweekmedium dat 1 uM gemcitabine opgelost in steriel water. Nadere details worden verstrekt in 24.
    1. De cellen te kweken bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
    2. Splits de cellen om de 2-3 dagen in een verhouding van 1: 5 bereikt wanneer cellen samenvloeiing van ongeveer 90%.
    3. Om de cellen te splitsen, wast tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 1 ml trypsine / EDTA per 75 cm2 kweekfles en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min.
    4. Voeg 9 ml medium en de oogst van de vrijstaande cellen in een 15 ml buis. Seed 2 ml celsuspensie in een nieuwe fles containing 8 ml medium. Gooi de cultuur na 20 opeenvolgende passages.
  2. MTT test voor leukemiecellen
    1. Bereid op voorhand de MTT: los 500 mg MTT formazan in 10 ml PBS en roer (beschermd tegen licht) met een magnetische roerder gedurende ongeveer 1 uur. Steriliseer de oplossing door een 0,22 urn filter. NB: De oplossing kan worden bewaard in 10 ml porties bij -20 ° C. Beschermen tegen direct licht na het ontdooien.
    2. Bereid op voorhand de aangezuurde isopropanol: voeg 50 ml 2 M HCl tot 2,5 L isopropanol. OPMERKING: Bewaar de oplossing gedurende ten minste één maand bij kamertemperatuur vóór gebruik. Als de isopropanol niet correct wordt aangezuurd, kan het neerslagen met het medium te vormen en in gevaar brengen van de spectrofotometrische uitlezing.
    3. Bereid een aparte 96-well vlakke bodem "dag 0" (controle) plaat om ervoor te zorgen meer nauwkeurige schatting van groeiremming: wijden 3-6 wells per cellijn, voeg 30 ul van de groeimedium en 120 ul celsuspensie (8000 cellen) per elk putje 150 ul groeimedium aan putjes overeenkomend met blanco (geen cellen). Ga verder met stap 1.3.9 naar stap 1.3.13 van deze sectie om de optische dichtheid (OD) te meten. OPMERKING: Nadere details worden verstrekt in 4.
    4. Bereid een 96-well platbodem experimentele plaat: wijden 30 putten geneesmiddelconcentraties (10 concentraties, elk in drievoud), 10 putjes met controle cellen en 10 putten medium zonder cellen (blanco) controle en stelt een geneesmiddel verdunningsreeks dexamethason ( Dex) gebruikt dimethylsulfoxide als oplosmiddel.
      LET OP: Voor CEM-WT-cellen het Dex verdunning bereik ligt tussen 2 pm en 0,97 nM. Voor CEM / R30dm, CEM-R5 en CEM-C3 cellen het Dex verdunning bereik ligt tussen 640 pm en 0,33 nM.
    5. Voeg 30 ul van elke verdunning Dex in een geschikte putje van de 96-well plaat. Zorg ervoor dat elke concentratie in drievoud op te nemen.
    6. Voeg 30 pl groeimedium goeds gevonden volgens cellen en 150 ui groeimedium aan putjes overeenkomend met blanco controle.
    7. Harvest exponentieel groeiende cellen en resuspendeer op hun optimale zaaien concentratie.
      LET OP: Voor een optimale start cel concentraties te bepalen, is het raadzaam om het groeiprofiel van elke cellijn cellijn in een 96-wells plaat beoordelen door het zaaien cellen bij verschillende concentraties en dagelijks te meten gedurende ten minste 4 dagen. Kies een seeding concentratie die overmatige groei van cellen voorkomt na 72 uur, omdat dit het experiment te beïnvloeden door te verzadigen van de OD-waarden. Voor CEM-WT, CEM-C5 en CEM-R5 de optimale zaaien concentratie 8.000 cellen / putje, terwijl het voor CEM / R30dm is 5.000 cellen / putje.
    8. Voeg 120 ul celsuspensie aan elk putje dat hetzij de geneesmiddeloplossing of groeimedium (putjes overeenkomend met controle cellen). Vul de lege buitenste putjes van de plaat met 150 pl PBS om goede waarborgen dat het vocht in de plaat en incubeer the platen gedurende 72 uur bij 37 ° C met 5% CO2 in een celkweek incubator.
    9. Voeg 15 ul van de MTT-oplossing aan elk putje en schud de plaat gedurende 5 minuten met een plaat-shaker tot maximaal 900 shakes / min.
    10. Plaats de platen weer bij 37 ° C met 5% CO2 in een celkweek incubator en incubeer gedurende nog 4-6 uur.
    11. Voeg 150 ul van de aangezuurde isopropanol aan elke well en meng met een multichannel pipet grondig mengen de formazan kristallen. Begin met de lege putten en zorg ervoor dat de tips goed spoelen alvorens een volgende rij van de plaat.
    12. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 min.
    13. Met behulp van een microplaat reader Bepaal de OD bij 540 en 720 nm om een ​​nauwkeurige meting door te corrigeren voor de achtergrond OD. Sla gegevens in een spreadsheet-bestand en analyseren 4.
  3. SRB Assay voor pancreascarcinoom cellen
    1. Oplossen SRB reagens in 1% azijnzuur bij eindconcentratie van 0,4% (w / v).
    2. Oplossen trichloorazijnzuur (TCA) in ultrazuiver water bij eindconcentratie van 50% (w / v).
    3. Ontbinden Tris (hydroxymethyl) aminomethaan in ultrazuiver water in een eindconcentratie van 10 mM.
    4. Bereid een aparte 96-well vlakke bodem "dag 0" control plaat om meer nauwkeurige schatting van groeiremming verzekeren: zaad 6 putjes met cellen groeien in exponentiële fase in 100 gl medium op de juiste zaaien concentratie en voeg 100 pl medium alleen te putten die overeenkomt met blanks. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO 2 om een goede hechting van de cellen aan de plaat waarborgen. voeg dan 100 ul medium om alle putten en ga verder met stappen 1.4.8 - 1.4.16 van deze sectie.
    5. Bereid een 96-well platbodem experimentele plaat: zaadcellen groeien in exponentiële fase in triplo in 96 putjes vlakke bodemplaten op geschikte dichtheid in 100 pl meDIUM met behulp van een multichannel pipet.
      LET OP: Voor een optimale start cel concentraties te bepalen, is het raadzaam om het groeiprofiel van elke cellijn cellijn in een 96-wells plaat beoordelen door het zaaien cellen bij verschillende concentraties en dagelijks te meten gedurende ten minste 4 dagen. Kies een seeding concentratie die overmatige groei van cellen voorkomt na 72 uur, omdat dit het experiment te beïnvloeden door te verzadigen van de OD-waarden. Voor Panc-1 en Panc-1R cellen, de optimale concentratie zaaien 8000 cellen / putje.
    6. Voeg 100 ul medium tot medium alleen putjes en incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO 2 om een goede hechting van de cellen aan de plaat waarborgen.
    7. Bereid een geneesmiddel verdunningsreeks van gemcitabine tussen 1 uM en 10 nM voor Panc-1 en 1 mM en 100 nM voor Panc-1R cellen. Voeg 100 ul van elke verdunning in een geschikte putje van de 96-well plaat met een meerkanaals pipet. Zorg ervoor dat elke concentratie hebben in drievoud. Daarnaast,voeg 100 ul medium met het enige medium-wells en de controlecellen. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 72 uur.
    8. Voeg 25 ul koude TCA oplossing aan de putjes met behulp van een meerkanaals pipet en incubeer de plaat gedurende tenminste 60 minuten bij 4 ° C om precipiteren en de eiwitten vast te stellen op de bodem van de putjes.
    9. Leeg de plaat door het verwijderen van het medium en droog kort op een tissue.
    10. Was 5 keer met kraanwater en vervolgens legen van de plaat en laat drogen op kamertemperatuur.
    11. Voeg 50 ul SRB-oplossing per putje met behulp van een pipet en herhaalde vlekken gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    12. Leeg de plaat door het verwijderen van de SRB vlek.
    13. Was 4 keer met 1% azijnzuur, leeg vervolgens de plaat en laat het drogen op kamertemperatuur.
    14. Voeg 150 ul Tris-oplossing per putje met behulp van een multichannel pipet en meng gedurende 3 minuten op een plaat-shaker tot maximaal 900 shakes / min.
    15. Lees de optische dichtheid bij 540 nm (of 492 nm als tHij OD-waarden te hoog zijn).
    16. Analyseer de gegevens.
  4. Data-analyse voor MTT en SRB Testen
    1. Bereken de OD-waarden van de cellen op "Dag 0" met behulp van de volgende formule: OD dag 0 = OD controle cellen - Gemiddeld OD blanco wells
    2. Bereken het percentage van overlevende cellen per geneesmiddelconcentratie volgens de volgende formule:% Bewerkte cellen = Gemiddeld [OD behandelde cellen - gemiddelde OD blanco's - OD Dag 0] / [OD controlecellen - Gemiddelde OD blanco's - OD Day0] * 100
    3. Plot de dosis-responscurve (geneesmiddelconcentratie vs. groeiremming in%).
    4. Bereken de concentratie van het geneesmiddel die de groei van cellen met 50% remt (IC50) met de dosis-responscurve.

2. RNA isolatie en Bibliotheek Voorbereiding voor RNA-sequencing

  1. sample Collectie en RNA Isolation
    1. Voor CEM cellen: de oogst van 10 6 cellen direct uit kweekmedium.
    2. Voor Panc-1 en Panc-1R: verwijderen medium, was de cellen tweemaal met PBS en los door toevoeging van trypsine-EDTA en incuberen bij 37 ° C gedurende 3 min. Voeg kweekmedium en de oogst van 10 6 cellen.
    3. Spin down monsters bij 300 g gedurende 3 minuten, verwijder supernatant en extract totale mRNA met behulp van commercieel verkrijgbare silica membraan spinkoloms, door het volgen van de fabrikant van `protocol.
    4. Bepaal de concentratie en zuiverheid van totaal RNA met behulp van een UV-Vis spectrofotometer.
      OPMERKING: RNA wordt uit hoge zuiverheid als de 260 nm / 280 nm absorptie, groter dan 1,8. De monsters kunnen worden opgeslagen bij - 80 ° C.
    5. Beoordelen totaal RNA integriteit door elektroforese van 200 ng monster op 1% agarose gel gekleurd met ethidiumbromide.
      OPMERKING: De detectie van twee banden die overeenkomen intacte zoogdiercellen 28S en 18S rRNA's bij ongeveer2 kb en 1 kb groot is indicatief voor goede totaal RNA integriteit.
  2. Sequencing Bibliotheek Voorbereiding
    1. Gebruik 2 ug totaal mRNA per elk monster. Volg mRNA bibliotheek bereidingsprotocol volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Bepaal kwaliteit en concentratie van elke bibliotheek door een bioanalyzer systeem. bibliotheken in een enkel monster tot bundelen tot een uiteindelijke concentratie van 10 nmol / L en meten met de bioanalyzer.
    3. Gebruik high-throughput sequencing-systeem met Single Lees 100 bp mode.
      OPMERKING: Lees lengte van> 80 bp tot de identificatie transcriptionele isovormen.

3. Detectie van differentiële splicing van Sequencing Leest

  1. Aanpassing van de leest aan Referentie genoom en de kwaliteitscontrole
    1. Stel een gen annotatie (.gtf-bestand) uit de NCBI refGene tafel met behulp van UCSC table browser (25.963 genen).
    2. Uitvoerenannotatie-aware gapped uitlijning van sequencing leest met de referentie genoom (GRCh37) met behulp van STAR.
    3. Sorteren en index de resulterende afstemming bestanden met Picard gereedschappen.
    4. Voer post-mapping kwaliteitscontrole met behulp van RSeQC en samtools.
  2. Differentiële splicing Detection tussen Sample Groepen
    1. Installeer Python en de bijbehorende versies van NumPy en scipy. Download en installeer samtools. Download en installeer bowtie en tophat,
    2. Voeg de Python, bowtie, tophat en samtools directories aan de variabele $ PATH omgeving. Download pre-built bowtie indexen (hg19). Download rMATS versie 3.0.9.
      LET OP: Verdere details over rMATS worden geleverd in 19 en 34.
    3. Detect alternatieve splicing gebeurtenissen door het vergelijken van elk Dex-resistente cellijn CEM-WT en Panc-1 tot Panc-1R in afzonderlijke MATS loopt volgens figuur 5A.
    4. Differentiële splicing gebeurtenissen uit previo detecterenusly uitgelijnd sequencing leest (.bam bestanden), voert MATS met behulp van de commando's van figuur 5B voor CEM-WT vs. CEM- C3, CEM-WT vs. CEM-R5, CEM-WT versus CEM / R30dm en PANC1 te Panc- 1R vergelijkingen.
      LET OP: MATS zal een output map te maken met twee .txt-bestanden met de resultaten per type splicing gebeurtenis geanalyseerd (SE - exon skipping, A5SS - alternatieve 5 'splice site, A3SS - alternatieve 3' splice site, MEX - elkaar uitsluitende exons en RI - intron retentie): een bestand met resultaten op basis van alleen knooppunt telt en een tweede bestand met resultaten op basis van knooppunt tellingen en leest op doel. Bovendien wordt een extra .txt bestand met een resultaat overzicht gegenereerd in dezelfde map.
    5. Voor SE, A5SS, A3SS en RI invoer in de .txt-bestanden op basis van knooppunt tellingen spreadsheets en leest op doel. Voor MEX importeert u de .txt-bestanden op basis van alleen knooppunt telt.
      LET OP: MATS output file wordt gesorteerd op oplopende P-waarden en bevat een aantal parameters: gen ID, gen symboolChromosoom en streng positie genomisch coördinaten van het alternatief gesplitste fragmenten, telt en de lengte van integratie en het overslaan vormen beide geanalyseerde monsters, de lengte van in- en overslaan formulier voor normalisatie, p-waarde false discovery rate (FDR ), inclusie level voor elk monster op basis van de genormaliseerde telt en het differentieel opname score (gemiddelde (IncLevel1) - gemiddelde (IncLevel2)).
    6. Selecteer statistisch significante kandidaat-genen met een FDR <10% voor verdere validatie (bv DDX5 en PKM2).
    7. Visualiseer alternatieve splicing evenementen met Integrative Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), zoals gerapporteerd in Figuur 5.

4. Validatie van de resultaten door middel van RT-PCR en qRT-PCR-tests

  1. primer Ontwerp
    OPMERKING: Om een ​​betrouwbare validatie van de resultaten verkregen met behulp van de bioinformatica pijpleiding, het mRNA trans verschaffencripts gevolg van alternatieve splicing gebeurtenissen worden geamplificeerd door RT-PCR en gevisualiseerd door agarose gelelektroforese van PCR-producten. Cyanine groene kleurstof zoals SYBR groen qRT-PCR-test wordt gebruikt om specifieke splice varianten kwantificeren ten opzichte van een huishoudgen. Figuur 7 toont de op de exon 12 skipping geval van DDX5 gen visualiseren en de elkaar uitsluitende exon 9 en exon 10 van het gen PKM kwantificeren strategie.
    1. Voor de RT-PCR-test, ontwerp primerparen die hybridiseren om constitutieve exons (exon 10 en exon 13) stroomopwaarts en stroomafwaarts van de alternatieve splicing sites (figuur 7A).
      OPMERKING: De amplicon maat zal dekken tussen 100 en 800 bp, om een ​​duidelijke scheiding van de verwachte PCR-producten op agarose gel te verzekeren. De annealing temperatuur van de primers moet tussen 55 en 65 ° C en het GC-gehalte niet meer dan 60%.
    2. Cyanine groen assay (Figuur 7B). Controleer de sequentie homologie van de twee elkaar uitsluitende exonen en ontwerp twee primerparen die elk specifiek en uitsluitend detecteert slechts één van de twee splice-varianten.
      LET OP: Voor PKM, de omgekeerde primer bindt met exon 11 tot en met beide varianten gemeen hebben, terwijl de forward primers variant-specifieke en gloeien met exon 9 (PKM1) of exon 10 (PKM2).
    3. Om DDX5 gen van volledige lengte te detecteren, annealen de reverse primer in de overgeslagen exon (exon 12).
      LET OP: Voor de specifieke detectie van de DDX5 ΔEx12 variant, de omgekeerde primer overspant de exon11 / exon13 grens. Gebruik dezelfde voorwaartse primer die bindt aan constitutieve exon 10 voor beide reacties.
      OPMERKING: De amplicongrootte moet tussen 80 en 200 bp.
  • Eerste streng cDNA Synthesis
    1. Opgericht reverse transcriptie van 1 pg van het geïsoleerde RNA in cDNA met 200 U / ui Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) galmse transcriptase in de reactiebuffer verdund 1: 5 met steriel water. Voeg 1 uM DTT, 0,05 ug random hexameren, deoxynucleotide mix (dNTP) 1 mM en 40 U / gl ribonuclease inhibitor.
    2. Kort vortexen en incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 2 uur.
    3. Incubeer het reactiemengsel bij 70 ° C gedurende 5 minuten om de reverse transcriptase te inactiveren, de overdracht in ijs en verminderde snelheid met behulp van een microcentrifuge. Monsters kunnen direct worden gebruikt of opgeslagen bij - 20 ° C.
  • RT-PCR Reaction agarosegel
    1. Stel de PCR-reactie in een PCR buis per elk monster door het mengen van 12,5 ui 2x geconcentreerde PCR mastermix, 1,25 ui 10 uM voorwaartse primer en hetzelfde bedrag voor de reverse primer tot een eindvolume van 25 pl met steriel water.
    2. Voeg 1 pl cDNA aan het mengsel en plaats de buizen in de thermocycler. Het programma uitvoeren als volgt: initiële denaturering: 95 ° C gedurende 2 minuten.Herhalen volgende stappen voor 35 cycli: denaturatie bij 95 ° C gedurende 25 seconden; hybridisatie bij 52 ° C gedurende 35 seconden; verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min. Stel laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten.
    3. Bereid 1% agarosegel door het oplossen van 1 g agarose in 100 ml 1 x TBE buffer. Voeg 2,5 pl ethidiumbromide aan de oplossing. LET OP: ethidiumbromide is kankerverwekkend, met zorg te behandelen met behulp van een chemische dampkap.
    4. Laad de monsters en uitvoeren van de gel in 1x TBE buffer bij 100 V gedurende ongeveer 30 minuten in een elektroforese-systeem.
    5. Onthullen de gel met een digitale camera UV en sla de afbeelding.
  • qRT-PCR en gegevensanalyse
    1. Stel de Cyanine groene PCR reactie per elk monster door het mengen van 12,5 ui 2x groen PCR Mastermix, 2 gl 5 uM voorwaartse primer en hetzelfde bedrag voor de reverse primer tot een eindvolume van 15 pl met steriel water in een PCR buis . Bereid een mix voor elke specifieke splicevariant te detecteren (PKM1, PKM2, DDX5 volledige lengte, DDX5 ΔEx12) en voor de huishoud-gen (GUS).
    2. Laad de mastermix op een witte plaat met 96 putjes en voor te bereiden duplicaten per elk monster.
    3. Verdun de cDNA 10x in het water, voeg 5 ul aan elke mix en zet de plaat in de thermocycler. Het programma uitvoeren als volgt: initiële denaturering: 95 ° C gedurende 5 minuten. Herhalen volgende stappen voor 45 cycli: denaturatie bij 95 ° C gedurende 10 seconden; hybridisatie bij 58 ° C (voor DDX5 en DDX5 ΔEx12 mengsels) of 60 ° C (voor PKM1 en PKM2 mixen) gedurende 20 sec. Stel laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 20 sec. Stel smeltcurve door toepassing van een gradiënt 65-97 ° C.
    4. Met het oog op de specificiteit van de primer sets beoordelen in hun doel, controleer dan de smeltcurven en controleer of een enkele piek wordt gevormd per elke primer set.
    5. Bereken de tweede afgeleide waarden van de versterking bochten en exporteren de cyclus drempelwaarden (Ct).
    6. calculate de relatieve expressieniveaus (REL) van de mRNA splice varianten vergeleken met GUS schoonmaak (referentie) gen in elk monster met behulp van de "delta Ct (ACt)" methode. De formule is: REL = 2 - ACt, waarbij ACt = Ct doel splice variant - Ct referentie-gen
    7. Om de relatieve abundantie van splice-varianten kwantificeren Bereken het REL verhouding met de formule: Ratio REL ratio = REL splitsingsvariant 1 / REL splice variant 2.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    De cytotoxiciteit assays beschreven in het protocol een betrouwbare en robuuste werkwijze voor de weerstand van kankercellen te bepalen chemotherapeutische middelen in vitro. Door middel van de MTT assay gevoeligheid voor Dex werd bepaald vier T-ALL cellijnen, waaronder Dex-gevoelige ouderlijke CEM-WT-cellen, en drie Dex-resistente sublijnen: CEM / R30dm, CEM-R5 en CEM-C3. Twee verschillende concentratiebereiken moesten worden gebruikt vanwege het grote verschil in gevoeligheid tussen CEM-WT (2 uM - 0,97 nM) en Dex resistente cellijnen (640 uM - 0,33 nM). De MTT assay toonde duidelijk Dex weerstand CEM / R30dm (IC50 = 456 ± 49 uM), CEM-R5 (IC50> 640 uM) en CEM-C3 (IC50 = 386 ± 98 uM) vergeleken met de CEM- WT cellen (IC 50 = 0,028 ± 0,003 uM). Op dezelfde manier de SRB-test toonde een hoge gemcitabine weerstand in Panc-1R cellijn (IC 50 = 3.16 ± 0,01 uM) vergeleken met de parentale Panc-1-cellen (IC50 = 0,077 ± 0,03 uM) zoals getoond in figuur 2.

    Na de bevestiging van resistentie in alle beschouwd cellijnen, we vervolgens overgegaan tot mRNA isolatie, bibliotheek voorbereiding en RNA-sequencing. Extractie van totaal mRNA met silica membraan spinkolommen is de voorkeur boven andere methoden omdat het voorkomt fenol en proteïne contaminatie en biedt een hoge zuiverheid van het monster met 260 nm / 280 nm absorptieverhouding ruim boven 1,8. Dit is een essentieel vereiste voor complexe stroomafwaartse toepassingen zoals diepe sequencing. De werkwijze gebruikt om de integriteit van de RNA-monsters controleren door agarose 1% is bijzonder geschikt voor vers geïsoleerde cellen (Figuur 3). Aangezien het doel van dit protocol is om alternatieve splice varianten aberrantly uitgedrukt in resistente cellijnen te detecteren, kiezen we voor positieve selection van gepolyadenyleerd mRNA voor sequencing bibliotheek preparaat, met gestrande mRNA kit. Elektroferogrammen van één en samengevoegd bibliotheken zijn afgebeeld in figuur 4, die een gemiddelde fragment van ongeveer 300 bp, in overeenstemming met sequencing systeemvereisten. De bereide bibliotheken werden vervolgens gesequenced met behulp van een chip met Single Lees 100 bp mode. De keuze van sequentiebepaling leest van 100 bp noodzakelijk is alternatieve splicing detecteren door middel stroomafwaartse bioinformatische pijpleidingen.

    Na de eerste verwerking stappen en kwaliteitscontrole, leest de schone afgestemd op het menselijk genoom (hg19) werden onderworpen aan splicing analyse met behulp van differentiële MATS. In dit onderzoek hebben we vergelijkingen tussen het geneesmiddel gevoelige ouderlijke cellijn en elk van de resistente sublijnen apart (bijv CEM WT versus CEM / R30dm, CEM WT versus CEM-C3, etc.). MATS vertrouwt op een flexibele en nauwkeurige statistische modelgebruikt om differentiële splicing tussen monsters te detecteren. Door het gebruik van standaard analyse opties en een FDR waarde <10% als een cut-off (weergegeven in figuur 5B), waren we in staat om 38 ± 12 significante differentieel gesplitst gen kandidaten te identificeren per vergelijking gerangschikt volgens de aard van de alternatieve splicing evenement, met de meeste hits geclassificeerd als exon skipping. Figuur 6 illustreert een kenmerkende analyse uitgang voor de vergelijking Panc-1 vs. Panc-1R.

    We concentreerden ons verder onze studie over twee meest voorkomende vormen van alternatieve splicing evenementen: exon skipping en elkaar uitsluitende exon evenementen met een vertegenwoordiger kandidaat per categorie hieronder beschreven. DDX5 (DEAD-box helicase 5) is door Mats analyse gedetecteerd als statistisch significant in de vergelijking CEM-WT vs. CEM-C3 en CEM-R5, maar niet significant in vergelijking CEM-WT versus CEM / R30dm. Gezien de mogelijke rol bij leukemie 25,26, wekiezen voor deze kandidaat voor verdere validatie. Het wordt sterk aangeraden om RNA-seq data te visualiseren in een genoom browser-achtige tool. IGV een veelzijdige en gebruikersvriendelijke interface voor dit doel, zoals weergegeven in figuur 7 voor het gen kandidaat DDX5. PKM (pyruvaat kinase isozym spier) is een statistisch significant elkaar uitsluitende exon gebeurtenis in vergelijking CEM-WT versus alle Dex resistente sublijnen, maar niet in vergelijking Panc-1 vs. Panc-1R. Gezien het belang van dit enzym in vaste tumormetabolisme 27,28 en de nieuwe rol celmetabolisme in glucocorticoid resistentie in T-ALL 29, kiezen we deze kandidaat voor verdere validering waarvoor RT-PCR.

    Primer ontwerp moet worden uitgevoerd met uiterste zorg om het correcte amplicon amplificeren, vooral als primers hybridiseren met exon-exon grenzen (bij de reverse primer detecteren DDX5 ΔEx12 variant) of op they hybridiseren aan elkaar uitsluitende exons met een hoge sequentiehomologie (exon 9 en exon 10 van PKM). Figuur 8 toont de primer ontwerpstrategie, terwijl figuur 9 toont de resultaten van een RT-PCR voor DDX5 gen kandidaat. DDX5 ΔEx12 wordt gedetecteerd in het monster CEM-WT en CEM / R30dm maar niet in CEM-C3 en CEM-R5, hetgeen bevestigt MATS gegevens op een kwalitatieve manier. Cyanine groen qRT-PCR assay kwantificeert nauwkeurig de mRNA-expressieniveaus van de DDX5 en PKM splice-varianten, zoals weergegeven in figuur 10 en figuur 11, respectievelijk.

    Figuur 1
    Figuur 1: Schematische weergave van alternatieve splicing Events. Schematische weergave van de mogelijke patronen van alternatieve splicing van een gen. Dozen zijn discrete exons die onafhankelijk van elkaar kunnen worden opgenomen of uitgesloten van de mRNA transcript. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2: Resultaten van cytotoxiciteit assays. (A) MTT assay voor leukemische cellijnen toont hoge niveaus van dexamethason resistentie in CEM-C3 (IC50 = 386 ± 98), CEM-R5 (IC50> 640 uM) en CEM / R30dm (IC50 = 456 ± 49 uM ) vergeleken met de parentale CEM-WT (IC50 = 0,028 ± 0,003 uM). (B) SRB assays voor pancreas carcinoma cellijnen tonen hoge niveaus van resistentie gemcitabine in Panc-1R (IC50 = 3,16 ± 0,01 uM) vergeleken met de parentale Panc-1 (IC50 = 77,22 ± 2,76 nM). De grafieken rapporteren gemiddelde celgroei% ± SEM van drie independent experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 3
    Figuur 3: RNA Quality Assessment met behulp van een agarosegel. Tweehonderd ng totaal-mRNA werden op 1% agarose gel gekleurd met ethidiumbromide. De aanwezigheid van intacte banden die overeenkomen met ribosomaal RNA (rRNA) soorten 18S en 28S en de afwezigheid van uitstrijkjes bij lagere molecuulgewichten zijn indicatief voor goede kwaliteit RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 4
    Figuur 4: <strong> Bioanalyzer Sporen van Sequencing Bibliotheken. (A) elektroferogrammen van sequencing bibliotheken laten pieken bij ongeveer 300 bp, wat duidt op een goede kwaliteit. Monster 1-6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 en Panc-1R. (B) elektroferogram van de samengevoegde monsters (FU, Fluorescentie Eenheden).

    figuur 5
    Figuur 5: Detectie van differentiële splicing met MATS. (A) met een groep vergelijkingen en (B) scripts gebruikt om MATS draaien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 6
    Figuur 6: MATS Output List. De figuur toont een typische productie van MATS analyse software met spreadsheets: hier worden vermeld de differentiële splicing kandidaten in de vergelijking Panc-1 vs. Panc-1R voor exon skipping evenementen (FDR <10%). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 7
    Figuur 7: Visualisatie van differentiële splicing van DDX5 kandidaat-gen door middel van IGV Genome Browser. Bestanden met uitgelijnde leest (.bam) overeenkomt met leukemische cellen zijn geüpload op IGV genoom browser en gevisualiseerd door gebruik te maken Sashimi plots (minimum knooppunt tellingen waarde = 10 tot aanzienlijke splicing gebeurtenissen visualiseren). Splitsingsplaats tellingen worden weergegeven door verbindingslijnen eneen dat overeenkomt met het RNA-seq leest verspreid over de exons. CEM-WT en CEM / R30dm tonen overslaan telt verspreid exon 11 tot exon 13 in vergelijking met CEM-C3 en CEM-R5 die geen exon 12 skipping vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 8
    Figuur 8: Primer ontwerp voor RT-PCR en Cyanine Green qRT-PCR. (A) RT-PCR: primerparen detecteren van differentiële splicing van DDX5 gloeien om constitutieve exons (exon 10 en exon 13) stroomopwaarts als stroomafwaarts van het alternatief gesplitste exons. (B) qRT-PCR: voor de relatieve kwantificatie van transcripten gevolg van exon skipping gebeurtenissen vergeleken met de canonieke transcripten, het reverse primer hybridiseert hetzij in het exon overgeslagen (alternatieve variant) ofaan de exon11 / exon13 grens (canonieke variant) van DDX5 gen. Voor de kwantificering van elkaar uitsluitende exons, de reverse primer hybridiseert met exon 11 aan beide isovormen gemeenschappelijke, terwijl de voorwaartse primer hybridiseren ofwel met exon 9 (PKM1) of exon 10 (PKM2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 9
    Figuur 9: RT-PCR Validatie van DDX5 Differential Splicing. De 1% agarosegel toont differentiële splicing van het DDX5 gen in leukemiecellen. Het fragment dat overeenkomt met de volledige lengte amplicon (650 bp) DDX5 wordt versterkt in alle monsters terwijl DDX5 ΔEx12 (430 bp) variant wordt versterkt in CEM-WT en CEM / R30dm samples en de grootte overeenkomt met Exon 12 skipping. Dit is niet gedetecteerd in CEM-C3 en CEM-R5-cellen, zoals ontmoedigenbepaald door MATS analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 10
    Figuur 10: mRNA expressieniveaus van DDX5 Splice varianten in CEM cellen. (A) qRT-PCR-bepaling. Gemiddelde relatieve expressieniveaus en standaardfout van het gemiddelde (REL ± SEM) van twee onafhankelijke experimenten. (B) Ratio van REL (± SEM) van de splice-varianten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 11
    Figuur 11: mRNA expressieniveaus van PKM Splice varianten in CEM en Panc-1-cellen. (A) qRT-PCR-bepaling. Gemiddelde relatieve expressieniveaus en standaardfout van het gemiddelde (REL ± SEM) van twee onafhankelijke experimenten en de verhouding van REL van de splice varianten CEM cellen. (B) qRT-PCR-bepaling. REL gemiddelde ± SEM van twee onafhankelijke experimenten en de verhouding van REL (± SEM) van de splice-varianten van Panc-1-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Hier beschrijven we een nieuwe benadering die gevestigde cytotoxiciteit screening technieken en krachtige NGS-gebaseerde transcriptomische combineert analyses differentiële splicing gebeurtenissen te identificeren met betrekking tot resistentie tegen geneesmiddelen. Spectrofotometrische assays gemakkelijk en robuust high-throughput methoden geneesmiddelgevoeligheid in vitro kankermodellen beoordelen en vormen de eerste keuze voor veel laboratoria die cytotoxiciteit screenings. Problemen en mogelijke varianten voor deze methode zijn uitgebreid beschreven elders 4,5.

    High-throughput genomische analyses die momenteel worden gebruikt om te ontdekken drug resistentie mechanismen zijn vooral gebaseerd op SNP detectie en differentiële expressie schatting van genen geassocieerd met een bepaalde drug-resistent fenotype. In deze studie beschrijven we het gebruik van RNA-sequencing methoden, alsmede robuuste bioinformatica pijpleidingen voor nauwkeurige annotatie van mRNA-transcripten en detectie van differential splicing. Een bijzonder belangrijk kenmerk van de beschreven protocol is de mogelijkheid om nieuwe splice-varianten te identificeren tussen twee monsters met verschillende groepen geneesmiddelgevoeligheid profielen. Een van de cruciale stappen een nauwkeurige en onpartijdige analyse is de isolatie van RNA, dat een hoge zuiverheid en integriteit moet zijn.

    MATS is de software die we kiezen uit een reeks van soortgelijke bioinformatica beschikbare hulpmiddelen (bijvoorbeeld Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice en Splicing Kompas) voor de detectie van alternatieve splicing 18. De belangrijkste sleutel functies die het de voorkeur verdienen zijn de superieure precisie en nauwkeurigheid, evenals de mogelijkheid om nieuwe gebeurtenissen te identificeren. MATS genereert twee soorten output die differentiële splicing analyse: de eerste is gebaseerd alleen exon junctie telt en de tweede is gebaseerd op splitsing telt en leest op doel. Terwijl de laatste de voorkeur heeft voor het detecteren van exon skipping gebeurtenissen, wordt aanbevolenGebruik de eerste optie voor de analyse van wederzijds uitsluitende exons aangezien deze aanpak vermindert het aantal vals positieve kandidaten voor dit type splicing verandering.

    Bovendien analyses gericht op intron retentie alternatieve 3 'en 5' splice sitegebeurtenissen een .gtf bestand geannoteerde introns worden gebruikt. Uiteindelijk, met het oog op biologische en technische variabiliteit binnen steekproef groepen te verminderen en zorgen voor een hoge ware positieven, is het sterk aan te raden om die ten minste drie repliceert 34. De keuze van differentieel gesplitst gen kandidaten op basis MATS uitgang gecombineerd met een validering middels RT-PCR. Dit is van cruciaal belang voor het selecteren van echte positieve varianten onder een grote lijst van kandidaten statistisch significant. De belangrijkste factor voor een nauwkeurige bevestiging is het ontwerp van oligonucleotiden en het optimaliseren van de PCR reacties volgens standaard moleculaire biologie. bijzondere aandachtmoet worden gehouden bij het ontwerpen van primers exon-exon overgangen en aanvullende validatiestappen, zoals sequentiebepaling van de amplicons van Sanger werkwijze worden gerechtvaardigd om hun specificiteit te bevestigen.

    De differentiële splicing van DDX5 en PKM transcripten gedetecteerd door MATS vertegenwoordigen twee voorbeelden van een afwijkende splitsing in verband met resistentie tegen geneesmiddelen. DDX5 ΔEx12 niet tot uitdrukking in de GC-resistente cellijnen (CEM-C3 en R5), die zijn geselecteerd na langdurige blootstelling Dex. DDX5 ΔEx12 werd uitgedrukt in de parentale cellijn, maar ook in de subkloon CEM / R30dm, die werd geselecteerd op resistentie tegen de chemotherapeutische agens MTX plaats Dex. In kankercellen, werd PKM2 sterk tot expressie in vergelijking met de splitsingsvariant PKM1, maar de verhouding PKM2 / PKM1 hoger bij Dex-resistente cellen, zoals door NGS resultaten. Dit werd niet waargenomen voor Panc-1 monster vergeleken met de gemcitabine-resistente tegenhanger en inderdaad deze kandidaat-gen niet totde statistisch significante gebeurtenissen in de MATS analyse. Dit kan weerspiegelen de verschillende celtype en het mechanisme van de resistentie veroorzaakt door gemcitabine blootstelling.

    Kortom: dit protocol is een geschikte benadering voor de ontdekking van splice varianten geneesmiddelresistentie ten grondslag liggen en kunnen worden toegepast op zowel leukemische cellen en vaste 30 tumorcellen 31. Een duidelijke beperking is dat tumorcellijnen vangen slechts een klein gedeelte van kanker heterogeniteit. Bovendien hebben de meeste cellijnen gedurende vele jaren in monolagen in groeibevorderende media. Deze omstandigheden beïnvloeden de cellulaire eigenschappen, waardoor de selectie van subpopulaties die sterk afwijken van de cellen van de primaire tumor waarvan ze afkomstig zijn. Veel van de genen die betrokken zijn bij resistentie zijn ook betrokken bij andere cruciale celfuncties zoals celgroei en apoptose die kan worden beïnvloed door langdurige culturin g kunststof. Teneinde de studie van resistentie te verbeteren, meer moet worden gericht op de ontwikkeling van nieuwe preklinische modellen, zoals primaire culturen en xenotransplantaten, die beter nabootsen van de in vivo kanker micro teneinde relevante veranderingen in cellulaire kenmerken voorkomen veroorzaakt door langdurig celcultuur en kweekomstandigheden. 32 Opmerkelijk ons protocol kan ook worden toegepast op primaire cellen, middels cytotoxiciteit assays om ex vivo IC50-waarden te bepalen. Een andere beperking is dat sinds vele resistentiemechanismen aanwezig voor elke anti-drug, gelijksoortige of verschillende mechanismen van resistentie in cellen blootgesteld aan identieke maar onafhankelijk behandelingen kunnen ontwikkelen. Daarom moet een vergelijkende selectiestrategie parallelle selecties en analyses, met inbegrip van genetische analyses van splicing varianten, van dezelfde ouderlijke cellen behandeld met dezelfde chemotherapeutische middel omvatten.

    jove_content "> Extra benaderingen voor de validatie moet gericht zijn op overexpressie van de splice variant van belang in cellijnen of specifiek downregulate hun expressie met behulp van RNA interferentie of-splice regelende oligonucleotiden 33.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
    2. McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
    3. Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
    4. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
    5. Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
    6. Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
    7. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
    8. Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
    9. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
    10. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
    11. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
    12. Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
    13. Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
    14. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
    15. Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
    16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
    17. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
    18. Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
    19. Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
    20. Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
    21. Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
    22. Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
    23. McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
    24. Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
    25. Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
    26. Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
    27. Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
    28. Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
    29. Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
    30. Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
    31. Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
    32. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
    33. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
    34. Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).

    Tags

    Cancer Research chemotherapie weerstand cytotoxiciteit alternatieve splicing RNA-seq transcriptomics
    Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A.,… More

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter