Summary
ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。
Abstract
薬剤耐性は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方のために、癌の治療における主要な問題です。内因性または抵抗が大きく薬物除去を含む、メカニズムの範囲によって引き起こされる可能性が取得された、薬物摂取、薬物の不活性化、および薬物標的の変化を減少させました。最近のデータは、他よりはよく知られている遺伝子（突然変異、増幅）およびエピジェネティックな（DNAの過剰メチル化、ヒストンの翻訳後修飾）修飾により、薬物耐性の機構はまた、スプライシング異常によって調節されるかもしれないことを示しました。これは、より効果的な治療法を計画するために、将来の注目に値する研究の急速に成長している分野です。この論文に記載されているプロトコルは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とします。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおけるいくつかのトランスクリプトームのプロファイルを分析し、確立しますED定量RT-PCRに基づく方法は、候補遺伝子の妥当性を検証します。特に、我々はDDX5とPKM転写産物の差動スプライシングを評価しました。計算ツールマットによって検出された異常なスプライシングが異なるDDX5スプライス変異体は、親対抵抗性細胞において発現されることを示し、白血病細胞において確認されました。これらの細胞では、我々はまた、ゲムシタビン曝露によって誘発される薬剤耐性の異なるメカニズムを示唆し、親PANC-1細胞と比較して、PANC-1、ゲムシタビン耐性の対応では検出されなかった高いPKM2 / PKM1比を、観察しました。
Introduction
癌治療、化学療法に対する悪性細胞の抵抗、いずれかの真性または長期の薬物曝露の際に取得にかなりの進歩にもかかわらず、白血病および固形腫瘍1の広い範囲で治療失敗の主な理由です。
薬剤耐性の機序を描写するために、 インビトロ細胞株モデルにおいて化学療法剤に耐性の癌細胞の段階的な選択によって開発されています。この手順は、臨床現場で使用される体制を模倣し、従って、関連する耐性機構の深さ調査にできます。処置を生き延びる耐性細胞は、次いで、細胞生存性/細胞毒性アッセイ2を使用して、親の感受性細胞と区別されます。初代細胞のインビトロでの薬剤耐性プロファイルに化学療法3に対する臨床応答に有意に関連することが示されています。
ハイスループットcytotoxicityアッセイは、in vitroでの薬剤感受性を決定するための便利な方法を構成しています。本明細書において、細胞の生存率は、によって評価される、例えば、3- [4,5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド- すなわち 、特定の基質の代謝的変換（に基づいているMTTアッセイ4、それによって、細胞のミトコンドリア活性を反映して着色された製品へのテトラゾリウム塩）、。あるいは、細胞のタンパク質含有量は、スルホローダミンB（SRB）アッセイ5を用いて定量することができます。ここでは、生存細胞の数は、必要とせず、分光光度計に適切な波長で測定した光学密度（OD）に比例します 広範かつ時間のかかる細胞計数手順を。特定の化学療法剤によって誘導される成長阻害は、細胞が、試験薬剤で処理し、未処理対照細胞のODと比較したウェルのODに基づいて計算することができます。用量反応曲線はobtaあります細胞を制御するために相対生存細胞の割合対薬物濃度をプロットすることによりINED。最後に、薬物感受性は、未処理細胞（IC 50）と比較して細胞増殖阻害の50％を生じる濃度として報告することができます。
薬剤耐性のメカニズムは、薬物活性および細胞代謝の決定因子の遺伝子発現に影響を与える変化のような多くの異なる異常を含みます。突然変異、異常な転写時および転写後レベルだけでなく、邪魔エピジェネティック制御を含むこれらの分子の病変は、多くの場合、薬物代謝やアポトーシス6のいずれかに関与する遺伝子に影響を与えます。
代替的なプレmRNAスプライシング、その複雑な調節は、最近、癌細胞7の薬剤耐性を決定することができる新規な実体としてかなりの注目を集めています。ヒト遺伝子の95％までの代わりにこのによって正常細胞にスプライスされ同じ遺伝子から多くの異なるタンパク質アイソフォームを生成しっかりと調節されたプロセス。選択的スプライシングは、多くの場合、癌において調節解除され、いくつかの腫瘍は、薬物代謝に関与する遺伝子の増加（ すなわち 、デオキシシチジンキナーゼ、葉酸ポリグルタミン酸合成酵素、または多剤耐性タンパク質）6,8の変化したスプライシングによって特徴付けられます。しかし、薬剤耐性細胞のスプライシングプロファイルの包括的な分析が痛いほど欠けています。したがって、選択的スプライシング分析のためのハイスループット方法を開発することが不可欠です。これは、より効果的な治療法の開発に役立つ可能性があります。
最後の十年の間に、次世代シーケンシング（NGS）技術の急速な発展は、ゲノム発現の調節および様々な生物学的プロセス9におけるそれらの役割を支配する分子メカニズムに新しい洞察力を持つ生物医学研究を豊かにしています。 RNAシーケンシング（RNA-seqの）強力なサブアプリケーションですトランスクリプトミクスの分野におけるNGSの。それは、同時に数千の遺伝子の発現パターンのゲノムワイドなプロファイリングを（定性的および定量的に）可能にし、新たなコーディングmRNAの特性評価だけでなく、長い非コードRNA、miRNAのは、siRNA、および他の小RNAに適していますクラス（ 例えば 、snRNAをとのpiRNA）10,11。
RNA-のSeqは、トランスクリプトームの特徴づけ（ 例えば、サンガー配列決定及び発現マイクロアレイ）の以前の技術に比べて多くの利点を持っています。これは、既存のゲノム注釈に基づいていない、それは解像度の単一ヌクレオチドのレベルを有し、それは、発現レベルの推定のための広いダイナミックレンジを有しています。簡単に言えば、RNA-seqの実験の基本的な実験的なワークフローは、cDNAへの変換、ライブラリー構築、最終的には、大規模並列深いシーケンシング12,13に続いて、ポリアデニル化転写産物（mRNAの）選択と断片から構成されています。 sequencinの急速な低下に起因しますここ数年、RNA-seqのオーバーグラムコストは徐々に他の技術を交換し、重要な努力がライブラリの準備プロトコルを改善するために行われています。例えば、デオキシウリジン三リン酸（dUTPを）を有する第二鎖cDNAをマークし、PCR増幅の前に、ウラシルDNA-グリコシラーゼ（UDG）でマークされた鎖を消化することによってmRNA転写物のストランド情報を保持することが可能になりました。このプロセスは、遺伝子アノテーションと発現レベル14,15の推定精度を向上させます。
RNA-seqのデータの分析および解釈は、バイオインフォマティクスパイプライン16,17内の複雑で強力な計算ソフトウェアパッケージおよび処理を必要とします。まず、生のは、厳しい品質要求に達しない配列を技術的、生物学的なアーティファクトを除去し、廃棄する（トリミング）により品質管理を受ける読み取ります。続いて参照ゲノムにマッピングされ、インデックスが作成されている各サンプルに対して読み取り、遺伝子レベル、エクソンレベル、または転写物レベルに、各カテゴリの豊富さを決定するためです。用途に応じて、精製されたデータは、対立遺伝子特異的な発現、スプライシング、遺伝子融合、および単一ヌクレオチド多型（SNP）12を識別するための統計的モデルを介して計算されます。最後に、選択されたレベル（ すなわち、遺伝子発現または選択的スプライシング）の微分解析は、異なる条件下で得られた試料を比較するために使用することができます。
異なるスプライシング分析は、2サンプル間のスプライス部位の使用状況の違いを説明しています。この目的のために捧げられたソフトウェアパッケージの増加数は異なる統計モデル、パフォーマンスやユーザーインターフェース18に基づいてご利用いただけます。これらの中でも、MATS（トランスクリプトスプライシングの多変量解析）はベイズ統計の枠組みに基づいて、自由に利用できると正確な計算ツールとして現れ、diffeを検出するように設計します単一またはペアエンドRNA-seqのデータからrentialスプライシング事象。整列（.bam）ファイルから出発して、MATSは、選択的スプライシング事象のすべての主要なタイプを検出することができます（エクソンスキッピング、代替3 'スプライス部位、代替5'スプライス部位、相互に排他的なエクソンおよびイントロン保持を-また、 図1を参照します）。
まず、ソフトウェアの識別は、例えばエクソンスキッピングのために、特定のスプライシングイベントをサポートする読み出し、二つのタイプにそれらを分類します。調べエクソン内にマッピングし、その特定のエキソンと2上流と下流の隣接するエクソンの間の接合部にまたがる（標準的なスプライスイベントのために）」包含読み取り」。 2つのフランキングエクソンの間の接合部にまたがる（選択的スプライシングイベントのために）「スキップ読み取り」。その後、マットは両方の正準および代替イベントのための正規化された含有レベルを返し、サンプルまたは条件の間の値を比較します。最終的には、P値Aを算出しますND偽発見率（FDR）は、二つの状態の間の遺伝子の変異率の差が各スプライシング事象19,34の指定されたユーザ定義のしきい値を超えたと仮定します。
RNA-seqのと併せて、差動スプライシング解析に続いて、大規模な実験的検証は真陽性遺伝子候補18を識別するために保証されています。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）はRNA-、配列番号解析部20から得られた候補の検証の中で最も一般的に使用され、最適な方法です。本稿の目的は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性関連のスプライシングプロファイルを調査するための堅牢な方法論を提供することにあります。我々のアプローチは、薬剤耐性に関与する候補遺伝子の検証のために確立された定量RT-PCR法と組み合わせた薬剤耐性癌の選択された細胞株モデルのRNA-配列に基づくトランスクリプトーム・プロファイリングを利用します。
CEM-C7R5（CEM-R5）21,22およびメトトレキサート（MTX）耐性サブラインCEM / R30dm 23。 GCおよびMTXに基づいて、現在の治療法は、症例の約90％に臨床的有益性を確立しているが、GC-耐性の出現はまだ不明分子機構との未解決の問題を表します。 GC耐性サブクローンを単離するために、CEM-WT細胞は、2〜3週間、1μMのデキサメタゾン（Dexの）中で培養しました。 MTX耐性サブラインCEM / R30dmが繰り返さ短期（24時間）臨床プロトコルの模倣として30μMMTXへのCEM-WT細胞の曝露によって開発されました。興味深いことに、この細胞株はまた、メカニズムは完全には理解されていないデックスに対する交差耐性（未発表の結果）を表示します。
固体TUMまたは本研究で検討したモデルは、化学療法への特別な耐火性のための悪名高い、膵管腺癌です。この目的のために、我々は、薬剤24の1μMで連続インキュベーションによって得られたPANC-1細胞株およびそのゲムシタビン耐性サブクローンPANC-1Rを選択しました。に関連する新規なスプライス変異体を同定するためのRNA配列ベースのパイプライン、固形腫瘍からの白血病細胞および癌細胞における薬剤感受性を評価するために、比色細胞毒性アッセイ：ここでは、3つのプロトコルを組み合わせることによりインビトロ薬剤耐性の基礎となる新規のメカニズムを発見する方法を説明します薬剤感受性/抵抗およびRT-PCRおよび定量RT-PCR分析は、潜在的な候補者の妥当性を検証します。
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Protocol
細胞毒性アッセイを介して薬剤耐性プロファイルの特徴付け
- 白血病細胞株培養
- 親のT細胞を含む10ミリリットルRPMI-1640培地中で25cm 2の中のすべての細胞株CCRF-CEM（CEM-WT）と同様に、CEM / R30dm、CEM-R5およびCEM-C3を含め、その薬剤耐性サブラインを、維持2.3μM、10％ウシ胎児血清および100単位/ mlペニシリンGおよび100μg/ mlストレプトマイシンを補充した葉酸。
- 文化、5％CO 2インキュベーター内で37℃の加湿雰囲気で細胞。
- 3×10 6細胞/ mlの- 2の間の濃度に細胞増殖を可能にします。
- 0.3×10 6細胞/ mlの初期濃度で1週間に2回、細胞を分割（ 例えば、細胞濃度を3×10 6細胞/ mlで9 mlの新鮮な培地を含む新たなフラスコ内の転送1mLの細胞懸濁液の場合）。 20回連続継代後に文化を捨てます。
注記：高グルコースおよび10％ウシ胎児血清および100単位/ mlのペニシリンGおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充したL-グルタミン、10 mlのDMEM培地中で75cm 2の培養フラスコ中でヒト膵臓癌細胞株PANC-1を維持。薬剤耐性変異、PANC-1Rは、滅菌水に溶解した1μMのゲムシタビンを含む同じ培地で培養されます。さらなる詳細は24で提供されます。- 文化、5％CO 2インキュベーター内で37℃で細胞。
- 細胞が約90％コンフルエンスに達したときに5：1の割合で3日間 - すべての2セルを分割します。
- 細胞を分割し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回を洗浄し、75cm 2の培養フラスコあたりトリプシン/ EDTA 1 mlを加え、3分間37℃でインキュベートします。
- 9ミリリットル培地を追加し、15ミリリットルチューブに剥離した細胞を収穫。新しいフラスココンタでシード2ミリリットルの細胞懸濁液8ミリリットル培地ining。 20回連続継代後に文化を捨てます。
- 白血病細胞のためのMTTアッセイ
- 事前にMTT溶液を調製する：約1時間磁気撹拌機を（光から保護）10mlのPBSおよび撹拌にMTTホルマザンの500ミリグラムを溶解します。 0.22μmのフィルターで溶液を滅菌します。注：溶液を、-20℃で10mLのアリコートで保存することができます。解凍後、直接光から保護します。
- 事前に酸性化したイソプロパノールを準備：イソプロパノール2.5 Lに2 M HClを50ミリリットルを追加します。注：使用前に室温で少なくとも1ヶ月のためのソリューションを保存してください。イソプロパノールが正しく酸性化されていない場合は、媒体と沈殿物を形成し、分光光度読み出しを損なう可能性があります。
- 成長阻害のより正確な推定を確保するために、別の96ウェル平底「0日目」（コントロール）プレートを準備します。成長の30μlを添加、細胞株あたり3〜6井戸をささげます培地と、ブランク（細胞なし）に対応するウェルに成長培地の各ウェルに150μlのあたりの細胞懸濁液（8000細胞）の120μlの。光学密度（OD）を測定するには、このセクションの1.3.13をステップステップ1.3.9から進んでください。注：さらなる詳細は4で提供されます。
- 96ウェル平底実験プレートを準備します（（空白）細胞を含まない培地を制御するために、細胞および10のウェルを制御するために、薬物濃度（10濃度、各3回）、10ウェルに30井戸を捧げるとデキサメタゾンの薬物希釈範囲を準備溶媒としてジメチルスルホキシドを使用してDEX）。
注：CEM-WT細胞についてDexの希釈範囲は2μMおよび0.97 nMの間にあります。 CEM / R30dmについて、CEM-R5およびCEM-C3細胞のDexの希釈範囲は640μMおよび0.33 nMの間にあります。 - 96ウェルプレートの適切なウェルにそれぞれDexの希釈から30μlのを追加します。三連で各濃度を含めるようにしてください。
- ウェルに増殖培地の30μLを追加Sはブランクに対応するウェルに、細胞および増殖培地の150μlのを制御するように対応します。
- 収穫は指数関数的にそれらの最適な播種濃度で細胞を再懸濁を成長させます。
注：最適な出発細胞濃度を決定するために、それはいくつかの濃度で細胞を播種し、少なくとも4日間、毎日それを測定することにより、96ウェルプレート中の各細胞株の細胞株の増殖プロファイルを評価することが推奨されます。これはOD値を飽和させることにより、実験に影響を与えるように、72時間後の細胞の異常増殖を防ぐ播種濃度を選択してください。 CEM / R30dmのは5,000細胞/ウェルであるがCEM-WT、CEM-C5およびCEM-R5のための最適な播種濃度は、8000細胞/ウェルです。 - よく薬液や成長培地（細胞を制御するために、対応するウェル）のいずれかを含む各細胞懸濁液120μlのを追加します。プレートに良い湿度を確保するために、150μlのPBSでプレートの空の外側のウェルを記入し、番目をインキュベート細胞培養インキュベーター中で5％CO 2で37℃で72時間の電子版。
- 各ウェルにMTT溶液の15μlを添加して、/分で900揺れの最大プレートシェーカー上にして、5分間プレートを振ります。
- 細胞培養インキュベーター中、5％CO 2で戻って37℃でプレートを置き、別の4インキュベート- 6時間。
- 各ウェルに酸性化したイソプロパノール150μlを添加して、徹底的にすべてのホルマザン結晶を再懸濁するためにマルチチャンネルピペットでよく混ぜます。ブランクウェルから始めて、ウェルプレートの別の行に進む前に、ヒントを洗い流してください。
- 10分間室温（RT）でプレートをインキュベートします。
- マイクロプレートリーダーを使用して、バックグラウンドODを補正することで正確な測定を保証するために、540および720 nmでのODを決定します。その後、スプレッドシートファイルにデータを保存して、4を分析します。
- SRBアッセイ膵臓癌細胞のための
- 0.4％の最終濃度で1％酢酸中のSRB試薬を溶解する（W / V）。
- （w / v）の50％の最終濃度で超純水にトリクロロ酢酸（TCA）を溶解します。
- 10mMの最終濃度で、超純水中のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを溶解します。
- 成長阻害のより正確な推定を確保するために、別の96ウェル平底「0日」対照プレートの準備：シード適切な播種濃度で100μlの培地中で指数増殖期に増殖する細胞で6ウェルのみに対応するウェルに100μlの培地を追加ブランク。プレートへの細胞の適切な接着を確実にするために、5％CO 2で37℃で一晩インキュベートします。そして、すべてのウェルに100μlの培地を追加し、ステップ1.4.8に進み - このセクションの1.4.16。
- 96ウェル平底実験プレートを準備します。私の100μl中の適切な密度で96ウェル中の三連で指数増殖期に成長している種細胞平底プレートマルチチャンネルピペットを使用してdium。
注：最適な出発細胞濃度を決定するために、それはいくつかの濃度で細胞を播種し、少なくとも4日間、毎日それを測定することにより、96ウェルプレート中の各細胞株の細胞株の増殖プロファイルを評価することが推奨されます。これはOD値を飽和させることにより、実験に影響を与えるように、72時間後の細胞の異常増殖を防ぐ播種濃度を選択してください。 PANC-1およびPANC-1R細胞については、最適な播種濃度/ウェル8000細胞です。 - 培地のみのウェルに100μlの培地を加え、プレートへの細胞の適切な接着を確実にするために、5％CO 2で37℃で一晩インキュベートします。
- PANC-1R細胞を1μMおよびPANC-1および1 mMのための10および100nMの間ゲムシタビンの薬物希釈範囲を準備します。マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルプレートの適切なウェルに各希釈液から100μlを添加します。三連で各濃度を持っていることを確認してください。加えて、培地のみのウェルおよび対照細胞に100μlの培地を追加します。 72時間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。
- マルチチャンネルピペットを用いて、ウェルに25μlの冷たいTCA溶液を追加し、ウェルの底でタンパク質を沈殿させ、固定するために4℃で少なくとも60分間プレートをインキュベートします。
- 組織上の媒体及び乾燥を簡単に除去することによって、プレートを空にします。
- プレートを空にし、室温で乾燥させた後、水道水で5回洗浄します。
- 室温で15分間リピート・ピペットと染色を用いて、ウェルあたり50μlのSRBソリューションを追加します。
- SRB染色を除去することによって、プレートを空にします。
- プレートを空にし、室温でそれを乾燥させた後、1％酢酸で4回洗浄します。
- マルチチャンネルピペットを用いて、ウェル当たり150μlのTris溶液を追加し、/分で900揺れの最大プレートシェーカーアップで3分間混合します。
- トン場合は540 nmの（または492nmでの光学密度を読みます彼は）値が高すぎるOD。
- データを分析します。
- MTTとSRBアッセイのためのデータ分析
- -平均OD ブランクウェル OD 0日 = OD 対照細胞 ：以下の式を使用して「0日」の細胞のOD値を計算します
- 以下の式に従って、各薬物濃度について生存細胞の割合を計算します。％処理細胞=平均[OD 処理された細胞 -平均OD ブランクウェル - OD 日0] / [OD コントロール細胞 -平均OD ブランクウェル - OD Day0] * 100
- 用量反応曲線（％での成長阻害対薬物濃度）をプロットします。
- 用量応答曲線を用いて、50％（IC 50）によって細胞の増殖を阻害する薬剤の濃度を算出します。
RNA-配列決定のため2. RNAの単離とライブラリの準備
- サンプルコルectionとRNAの単離
- CEM細胞について：培地から直接的に10 6細胞を回収。
- PANC-1およびPANC-1Rの場合：、培地を除去し、PBSで細胞を2回洗浄し、トリプシンEDTAを添加し、3分間37℃でインキュベートすることによって切り離します。培養液を追加し、10 6細胞を採取します。
- 3分間300×gでサンプルをスピンダウンし、上清を除去し、manufacturer`sプロトコルに従うことにより、市販のシリカ膜のスピンカラムを使用して全mRNAを抽出します。
- 紫外可視分光光度計を用いて、全RNAの濃度および純度を決定します。
注：260 NM / 280 nmの吸光度比が1.8以上であれば、RNAは高純度で考えられています。 80°C - サンプルがで保存することができます。 - 臭化エチジウムで染色した1％アガロースゲル上でサンプルを200 ngのの電気泳動によって全RNAの完全性を評価します。
注：約哺乳類28Sおよび18SのrRNAに対応する二つの無傷のバンドの検出2キロバイトと優れたトータルRNAの完全性の指標であるサイズで1キロバイト
- シーケンシングライブラリの準備
- 各サンプルにつき全mRNA2μgのを使用してください。製造元の指示に従ってmRNAのライブラリー調製プロトコルに従ってください。
- バイオアナライザシステムを使用して、各ライブラリーの品質と濃度を決定します。 10ナノモル/ Lの最終濃度に単一のサンプルアップ内のライブラリをプールし、バイオアナライザーでそれを測定します。
- シングルリード100 bpのモードとハイスループットシークエンシングシステムを使用してください。
注：> 80塩基対のリード長は、転写アイソフォームを識別するために必要です。
3.シーケンシングから異なるスプライシングの検出は、読み込み
- アライメントは、リファレンスゲノムと品質チェックに読み込み
- UCSCテーブルブラウザ（25963遺伝子）を使用して、NCBI refGeneテーブルから遺伝子アノテーション（.gtfファイル）をコンパイルします。
- 実行しますシークエンシングの注釈認識ギャップ付きアラインメントはSTARを使用して参照ゲノム（GRCh37）に読み込みます。
- ソートとインデックスピカードツールと結果の整合ファイル。
- RSeQCとsamtoolsを使用することにより、マッピング後の品質管理を行います。
- サンプルグループ間の異なるスプライシング検出
- Pythonとnumpyのとscipyのダウンロードの対応バージョンをインストールします。ダウンロードしsamtoolsをインストールします。蝶ネクタイとトップハットをダウンロードしてインストールし、
- $ PATH環境変数にPythonの、蝶ネクタイ、トップハットとsamtoolsディレクトリを追加します。ダウンロード事前に構築されたボウタイインデックス（hg19）。 rMATSのバージョン3.0.9をダウンロードしてください。
注：rMATSに関するさらなる詳細は、 図19および34に設けられています。 - 別々のMATSでPANC-1RにCEM-WT及びPANC-1にそれぞれのDex耐性細胞株を比較することによって、選択的スプライシングイベントを検出は、 図5（a）に従って実行されます。
- previoから差動スプライシング事象を検出しますusly整列配列決定はPanc-する対CEM- C3、CEM-WT対CEM-R5、CEM-WT対CEM / R30dmとPANC1 CEM-WTについては、 図5（b）からのコマンドを使用して、MATSを実行し、（.bamファイル）を読み込みます1Rの比較。
注：MATSは、分析スプライシング事象の種類ごとの結果を持つ2つの.txtファイルに出力フォルダを作成します（SE - エクソンスキッピング、A5SS - 代替5 'スプライス部位、A3SS - 代替3'スプライス部位、MEX - 相互排他的エクソンとRI - イントロン保持）：1のみの接合数に基づいて結果を含むファイルであり、接合カウントに基づいて結果を有する第二のファイルとターゲットに読み込みます。また、結果の概要を追加.txtファイルは同じフォルダに生成されます。 - SE、A5SS、A3SSとRIインポートが接合カウントに基づいて.txtファイルをスプレッドシートにするため、およびターゲットに読み込みます。 MEXのためにのみ接合カウントに基づいて.txtファイルをインポートします。
注：遺伝子ID、遺伝子記号：MATS出力ファイルはP値とを昇順でソートされているが、いくつかのパラメータが含まれています、染色体および鎖位置、選択的スプライシングされた断片のゲノム座標だけでなく、介在物の長さをカウントし、両方の分析サンプル、介在物の長さおよび正規化、p値、偽発見率（FDRに使用スキップフォームのフォームをスキップ）、正規化された数との差分を含めるスコア（平均（IncLevel1）に基づいて、各サンプルの含有レベル - 平均（IncLevel2））。 - FDR <さらなる検証（ 例えば 、DDX5とPKM2）は10％で統計的に有意な候補遺伝子を選択します。
- 図5に報告したように、統合ゲノミクスビューア（IGV、https://www.broadinstitute.org/igv/）との選択的スプライシングイベントを視覚化します。
RT-PCRおよび定量RT-PCRアッセイの業績4.検証
- プライマーの設計
注：mRNAのトランス、バイオインフォマティクスパイプラインを使用して得られた結果の信頼性の検証を提供するために、選択的スプライシング事象から生じるcriptsは、RT-PCRを用いて増幅したPCR産物のアガロースゲル電気泳動により可視化されます。例えばSYBRグリーン定量RT-PCRアッセイなどのシアニングリーン色素は、特定のスプライスを定量するために使用されるハウスキーピング遺伝子に対して変異体。 図7は、DDX5遺伝子のエクソン12スキッピングイベントを視覚化するとPKM遺伝子の相互排他的エクソン9及びエクソン10を定量化するために適用される戦略を描いています。- 構成的エクソン（エクソン10とエクソン13）上流と下流に位置選択的スプライシング部位（ 図7A）にRT-PCRアッセイのために、設計プライマー対は、アニール。
注：アンプリコンサイズは、アガロースゲル上で予測されたPCR産物の明確な分離を確実にするために、100〜800塩基対をカバーすべきです。プライマーのアニーリング温度は55℃〜65℃であるべきであり、GC含量が60％を超えてはなりません。 - シアニングリーンアッセイ（ 図7B）。
注：PKMについては、逆方向プライマーは、フォワードプライマーは、変異型固有およびアニール9（PKM1）をエキソンまたはエキソン10（PKM2）であるが、両方のバリアントに共通する11のエクソンにアニールします。 - DDX5完全長遺伝子を検出するために、スキップされたエクソン（エクソン12）内のリバースプライマーをアニーリング。
注：DDX5ΔEx12変異体の特異的検出のために、逆方向プライマーは、exon11 / exon13の境界にまたがります。両反応のための構成的エクソン10にアニール同じフォワードプライマーを使用してください。
注：アンプリコンサイズは80と200 bpの間であるべきです。
- 構成的エクソン（エクソン10とエクソン13）上流と下流に位置選択的スプライシング部位（ 図7A）にRT-PCRアッセイのために、設計プライマー対は、アニール。
- モロニーマウス白血病ウイルスの200 U /μLを使用してcDNAと単離されたRNAを1μgの逆転写を設定します（M-MLV）rever滅菌水で5：その反応緩衝液中のSE転写酵素は、1に希釈しました。 DTT、1μM、ランダムヘキサマーの0.05μgの、デオキシヌクレオチドミックス（のdNTP）1mMの、およびリボヌクレアーゼインヒビターの40 U /μlを添加します。
- 渦を簡単にし、2時間37℃で反応混合物をインキュベートします。
- 、逆転写酵素を不活性化し、氷上でミックスを転送し、マイクロ遠心を用いて、スピンダウンする5分間、70℃で反応混合物をインキュベートします。サンプルは、直ちに使用するかで保存することができる - 20°C。
- セットアップ2倍の12.5μLを混合することにより、各サンプルあたりPCRチューブでのPCR反応は、滅菌水で25μlの最終容量まで、10μMフォワードプライマーとリバースプライマーのために同じ量の1.25μLをPCRマスターミックスを濃縮しました。
- ミックスにcDNAを1μlを添加しサーモサイクラーにチューブを配置します。初期変性：95℃を2分間、以下のようにプログラムを実行します。35サイクル以下の手順を繰り返す：変性を25秒間95℃で、 35秒間52℃でのアニーリング; 1分間の72℃での伸長。 5分間72℃で最終伸長を設定します。
- TBE緩衝液1×100mlのアガロース1gを溶解させて、1％アガロースゲルを準備します。溶液に、臭化エチジウムの2.5μlを添加します。注意：エチジウムブロマイドは発癌性である、化学ヒュームフードを使用して、取り扱いに注意して。
- サンプルをロードし、電気泳動システムで約30分間、100 Vで1×TBE緩衝液でゲルを実行します。
- デジタルUVカメラでゲルを明らかにし、画像を保存します。
- PCRチューブ内の滅菌水で15μlの最終容量まで5μMフォワードプライマーとリバースプライマーのために同じ量の2μlを、2×グリーンPCRマスターミックスの12.5μLを混合することにより、各サンプル当たりシアニングリーンPCR反応を設定します。各特定のスプライス用のミックスを準備します（PKM1、PKM2、DDX5全長、DDX5ΔEx12）を検出し、ハウスキーピング遺伝子（GUS）のためにするバリアント。
- 白色96ウェルプレートにマスターミックスをロードし、各サンプルごとに重複を準備します。
- 水の中のcDNAの10倍を希釈し、各ミックスに5μlを添加し、サーマルサイクラーにプレートを配置します。初期変性：95℃を5分間以下のようにプログラムを実行します。 45サイクルのために、以下の手順を繰り返す：変性を10秒間95℃で、 20秒間58°C（DDX5とDDX5ΔEx12がミックスの場合）または60（PKM1とPKM2ミックス用）°Cでアニール。 20秒間、72℃での最終伸長を設定します。 65から97℃に勾配を適用することにより、曲線を溶融設定します。
- 彼らのターゲットにプライマーセットの特異性を評価するために、融解曲線を確認し、単一のピークが各プライマーセットごとに形成されていることを確認します。
- 増幅曲線の二次導関数値を計算し、サイクル閾値（CT）をエクスポートします。
- Calculat電子mRNAスプライスバリアントの相対的な発現レベル（REL）は「デルタCT（ΔCt値）」法を用いて、各試料中のGUSのハウスキーピング（参照）遺伝子と比較しました。式は次のとおりです。REL = 2 -のCt 参照遺伝子 -のΔCt= Ctをターゲットスプライスバリアント のΔCt、
- 比率REL比= REL スプライス変異体1 / REL スプライスバリアント2：スプライス変異体の相対的な存在量を定量化する式を用いてREL率を算出するためです。
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Representative Results
プロトコルに記載の細胞毒性アッセイは、in vitroでの化学療法剤に対する癌細胞の耐性を評価するための信頼性の高い強固な方法を提供します。 CEM / R30dm、CEM-R5及びCEM-C3：MTTアッセイにより、デックスに対する感度がデックス感受性親CEM-WT細胞を含む4つのT-ALL細胞株、および3つのDex耐性亜系統で決定しました。 Dexの耐性細胞株（640μM - 0.33 nM）を - 二つの異なる濃度範囲は、CEM-WT間の感度差が大きい（0.97 nMの2μM）のために使用しなければなりませんでした。 MTTアッセイは明らかにCEM-と比較して、CEM / R30dm（IC 50 = 456±49μM）、CEM-R5（IC 50> 640μM）およびCEM-C3（IC 50 = 386±98μM）でのDex性を示しましたWT細胞（IC 50 = 0.028±0.003μM）。同様にSRBアッセイは、IC 50 = 3（PANC-1Rの細胞株において高ゲムシタビン耐性を示しました。親PANC-1細胞と比較して16±0.01μM）（ 図2に示したように、IC 50 = 0.077±0.03μM）。
すべての考え細胞株における薬剤耐性の確認に続いて、我々は次のmRNA単離、ライブラリーの調製及びRNA配列決定に進みます。それはフェノールおよび蛋白質の汚染を回避し、十分に1.8以上の260nmで/ 280nmの吸光度比と試料の高純度を提供するので、シリカ膜のスピンカラムを使用して、全mRNAの抽出は、他の方法に比べて好ましい選択肢です。これは、このような深いシーケンシングのような複雑なダウンストリームアプリケーションのための重要な要件です。アガロース1重量％をRNAサンプルの完全性をチェックするために使用される方法は、新たに単離された細胞（ 図3）のために特に適しています。このプロトコルの目的は、異常に薬剤耐性細胞株で発現オルタナティブスプライス変異体を検出することであるので、我々は、正のSelectIOを選択します一本鎖のmRNAキットを用いて配列決定ライブラリーを調製するためのポリアデニル化mRNAのN、。単一およびプールされたライブラリの電気泳動図は、シークエンシングシステムの要件と一致して、約300塩基対の平均断片サイズを示す、 図4に示されています。準備されたライブラリーは、その後、シングルリード100 bpのモードを持つチップを使用して配列決定しました。 100 bpの下流バイオインフォマティクスパイプラインを介して選択的スプライシングを検出する必要があるのシーケンシングの選択が読み込まれます。
初期の処理工程と品質管理の後、清浄なヒトゲノム（hg19）に位置合わせ読み出しMATSを用いてスプライシング分析を差動に供しました。この分析では、薬剤感受性の親細胞株およびその薬剤耐性亜のそれぞれ別々に（CEM / R30dm 対 すなわち、CEM WT など CEM-C3、 対 CEM WT）との比較を行いました。 MATSは、柔軟かつ正確な統計モデルに依存していますサンプル間の異なるスプライシングを検出するために使用されます。デフォルトの分析オプションとFDR値<（ 図5Bに示されている）、カットオフとして10％を使用することにより、我々は、最もヒットして、選択的スプライシングイベントのタイプによって順序付け比較あたり38±12重大な差別的スプライシングされた遺伝子候補を同定することができましたエクソンスキッピングに分類。 図6は、PANC-1R対比較PANC-1のための典型的な分析の出力を示します。
エクソンスキッピング、下記のカテゴリごとに1代表候補と相互に排他的エクソンイベント：我々はさらに、選択的スプライシングイベントの最も一般的な2種類の我々の研究を集中しました。 DDX5（DEADボックスヘリカーゼ5）は、比較CEM-WT 対 CEM-C3およびCEM-R5で統計学的に有意であるとMATS分析によって検出されたが、比較CEM-WT 対 CEM / R30dmで有意ではないされています。我々は、白血病25,26でその推定役割を考えますさらなる検証のために、この候補者を選択します。非常ゲノムブラウザのようなツールでRNA-seqのデータを視覚化することをお勧めします。遺伝子候補DDX5については、 図7に示すようにIGVは、この目的のために汎用性とユーザーフレンドリーなインターフェイスを提供します。 PKM（ピルビン酸キナーゼ筋アイソザイム）は、CEM-WT 対すべてのDex耐性サブラインではなく、PANC-1R 対比較PANC-1で比較して統計学的に有意な相互排他的エクソンイベントです。固形腫瘍代謝27,28におけるこの酵素の関連性とT-ALL 29におけるグルココルチコイド抵抗の細胞代謝の新しい役割を考えると、我々は、RT-PCRを用いて、さらなる検証のために、この候補者を選択します。
プライマーの設計は、プライマーのアニールはエクソン - エクソンする場合は特に（DDX5ΔEx12変異を検出するリバースプライマーの場合）の境界を、正しいアンプリコンを増幅するために細心の注意を払って行ったとき、またはトンしなければなりませんちょっとアニール高い配列相同性（エクソン9とエクソンPKMの10）と相互に排他的エクソンします。 図9は、DDX5遺伝子候補についてRT-PCRの結果を示している。図8は 、プライマー設計戦略を示します。 DDX5ΔEx12は、このように、定性的な方法でMATSデータを確認し、サンプルCEM-WT及びCEM / R30dmではなく、CEM-C3およびCEM-R5で検出されました。それぞれ、 図10および図11に示すように、シアニングリーンのqRT-PCRアッセイは正確に、DDX5及びPKMスプライスバリアントのmRNA発現レベルを定量化します。
図1： 選択的スプライシングイベントの概略図。遺伝子の選択的スプライシングの可能なパターンの模式図。ボックスには、独立して含めるかはmRから除外することができる個別のエクソンありますNA転写物。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：細胞毒性アッセイの結果。 （A）白血病細胞株のためのMTTアッセイはCEM-C3（IC 50 = 386±98）でデキサメタゾン抵抗の高いレベルを示す、CEM-R5（IC 50> 640μM）およびCEM / R30dm（IC 50 = 456±49μM ）親のCEM-WT（IC 50 = 0.028±0.003μM）と比較して。膵臓癌細胞株のための（B）SRBアッセイは親PANC-1（IC 50 = 77.22±2.76 nm）に比べて、PANC-1R（IC 50 = 3.16±0.01μM）におけるゲムシタビン耐性の高いレベルを明らかにしました。グラフは、3アーキテクチャ非の細胞増殖％平均値±SEMを報告しますendent実験。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： アガロースゲルを用いてRNA品質評価。 二百ngの全mRNAの、臭化エチジウムで染色した1％アガロースゲルに流しました。リボソームRNA（rRNAの）種18Sおよび28Sと低い分子量でスメアの欠如に対応する無傷のバンドの存在は、良質のRNAを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：<シーケンシングライブラリの強い>バイオアナライザートレース。シーケンシングライブラリの（A）電気泳動図は、良質の指標である約300bpの、でピークを示しています。サンプル1〜6 = CEM-WT、CEM-C3、CEM-R5、CEM / R30dm、PANC-1およびPANC-1R。 （B）プールした試料の電気泳動図（FU、蛍光単位）。
図5： MATSと異なるスプライシングの検出。 （A）グループの比較とMATSを実行するために使用される（B）スクリプト。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：
図7： IGVゲノムブラウザを介してDDX5候補遺伝子の異なるスプライシングの可視化。整列さを持つファイルは、白血病細胞に対応する（.bam）はIGVゲノムブラウザ上にアップロードし、（重要なスプライシング事象を可視化するために最低限の接合カウント値= 10）を刺身プロットを使用して可視化されています読みます。スプライス部位の数は、接続線によって表されているとRNA-seqのに対応する番号は、エクソンにまたがる読み取ります。 CEM-WT及びCEM / R30dmは、任意のエクソン12スキッピングを示していないCEM-C3およびCEM-R5に比べて13エクソンするエクソン11に及ぶスキップカウントを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8：RT-PCRおよびシアニングリーン定量RT-PCRのためのプライマーの設計。 （A）RT-PCR：選択的スプライシングされたエクソンから上流と下流に位置する構成のエクソン（エクソン10とエクソン13）にDDX5アニールの差動スプライシングを検出するプライマー対。 （B）定量RT-PCRアッセイ：標準的な転写産物に比べてイベントをスキップエクソンから生じる転写物の相対定量化のために、逆方向プライマーは、スキップされたエクソン（代替バリアント）内、またはいずれかのアニールDDX5遺伝子のexon11 / exon13境界（カノニカルバリアント）へ。相互に排他的なエクソンの定量化のために、逆方向プライマーは、フォワードプライマーのアニールが9（PKM1）のエクソンまたはエクソン10（PKM2）するかしながら、両方のアイソフォームに共通する11のエクソンにアニールします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9：DDX5 異なるスプライシングのRT-PCR検証。 1％アガロースゲルは、白血病細胞にDDX5遺伝子のディファレンシャルなスプライシングを示しています。 DDX5ΔEx12（430 bp）の変異体は、CEM-WT及びCEM / R30dmサンプルで増幅され、サイズはエクソン12スキッピングに対応している全長アンプリコン（650 bp）をDDX5に対応する断片は、全ての試料において増幅されます。阻止するように、これは、CEM-C3およびCEM-R5細胞では検出されませんMATS分析によって採掘されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図10：CEM 細胞におけるDDX5スプライスバリアントのmRNAの発現レベル。 （A）定量RT-PCR分析。相対的な発現レベルと平均2つの独立した実験の（REL±SEM）の標準誤差を意味します。 （B）スプライスバリアントのRELの比率（±SEM）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図11： mRNA発現レベルCEMでPKMスプライスバリアントおよびPANC-1細胞の秒。 （A）定量RT-PCR分析。相対的な発現レベルおよびCEM細胞のためのスプライスバリアントのRELの平均2つの独立した実験の（REL±SEM）との比の標準誤差を意味します。 （B）QRT-PCRアッセイ。 PANC-1細胞のためのスプライスバリアントのRELの2つの独立した実験と比のREL±SEM（±SEM）を意味します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、十分に確立された細胞毒性のスクリーニング技術を組み合わせて、強力なNGSベースのトランスクリプトームは、薬剤耐性に関連する差動スプライシング事象を識別するために分析する新規な方法を記載します。分光光度アッセイは、in vitroでの癌モデルにおける薬剤感受性を評価するための便利で堅牢なハイスループット法であり、細胞毒性スクリーニングを行う多くの研究室のための最初の選択肢を表します。このメソッドのトラブルシューティングだけでなく、可能なバリエーションは広範囲に他の場所で4,5説明しました。
ハイスループットゲノムは、現在のSNP検出に主に依存し、特定の薬剤耐性表現型に関連する遺伝子の発現の推定差分薬剤耐性メカニズムを調査するために使用される分析します。本研究では、正確なmRNA転写物の注釈とDIFの検出のための堅牢なバイオインフォマティクスパイプラインと一緒に、RNA配列決定法の使用を記載しています差動のスプライシング。記載されたプロトコルの特に重要な特徴は、別個の薬剤感受性プロファイルを有する2つのサンプルグループ間での新規スプライスバリアントを同定する能力です。正確かつ公平な分析のための重要なステップの一つは、高純度および完全性のものでなければならないRNAの単離、です。
MATS我々は選択的スプライシング18の検出のために利用可能な類似のバイオインフォマティクスツール（ 例えば、Cuffdiff 2、DEXseq、DiffSpliceおよびスプライシングコンパス）の一連の中から選択したソフトウェアです。それ好ましい選択肢作るメインキーの機能は、その優れた精度と正確さだけでなく、新たな事象を特定する可能性があります。最初だけエクソンジャンクション数に基づくものであり、第二は、接合カウントに基づいてだけでなく、ターゲットに読み取る：MATSは、差動スプライシング解析を含む出力の2種類を生成します。後者はイベントエクソンスキッピングを検出するために好ましいが、それに推奨されますこのアプローチは、スプライシング改変のこの特定のタイプの偽陽性候補の数を減少させるように相互に排他的エクソンの分析のための最初のオプションを使用します。
また、イントロン保持に焦点を当てた分析のために、代替的な3 'および5'スプライス部位のイベントは、注釈付きのイントロンと.gtfファイルが使用されるべきです。最終的に、サンプルグループ内の生物学的および技術的な変動性を低減し、高い真陽性率を確保するために、それは強く配列に推奨される、少なくとも3つの34を複製します 。 MATS出力に基づいて、示差的にスプライシング遺伝子候補の選択は、RT-PCRを用いて確認ステップと合わせました。これは統計的に有意な候補の大規模なリストの間で真の陽性変異体の選択のために非常に重要です。正確な検証のための重要な要因は、分子生物学の標準に従ってオリゴヌクレオチドの設計及びPCR反応の最適化です。特別な注意サンガー法により、このようなアンプリコンの配列決定エクソン - エクソンジャンクションおよび追加の検証ステップをスパニングするプライマーを設計する際に注意しなければならない、その特異性を確認するために保証されます。
MATSによって検出DDX5とPKM転写産物のディファレンシャルスプライシングは、薬剤耐性に関連した異常なスプライシングの2つの例を表します。 DDX5ΔEx12は、長期デックスの曝露後に選択されたGC-耐性細胞株（CEM-C3とR5）で発現していませんでした。 DDX5ΔEx12は、親細胞株でも化学療法薬MTXではなくデックスに対する耐性のために選択したサブクローンCEM / R30dm、で発現させました。がん細胞では、PKM2は非常にそのスプライスバリアントPKM1に比べて発現していたが、NGSの結果によって示唆されるように比PKM2 / PKM1は、Dexの耐性細胞で高かったです。これは、そのゲムシタビン耐性対応物と比較して、PANC-1のサンプルについて観察されなかったと、確かに、この候補遺伝子は、間ではありませんでしたMATS分析の統計学的に有意なイベント。これは、ゲムシタビン曝露によって誘発される薬剤耐性の異なる細胞型とメカニズムを反映可能性があります。
結論として、このプロトコルは、薬剤耐性の根底にあり、白血病細胞30または固形腫瘍細胞31のいずれかに適用することができるスプライス変異体の発見のための適切なアプローチを構成しています。明確な制限は、腫瘍細胞株が癌異質のほんの一部を捕捉することです。また、ほとんどの細胞株は、増殖促進培地で単層で長年にわたって維持されています。これらの条件は、彼らが発信元の原発腫瘍の細胞から劇的に異なる亜集団の選択で、その結果、細胞特性に影響を与えます。しかし、薬剤耐性に関与する遺伝子の多くはまた、長期culturinによって影響を受ける可能性がある細胞増殖およびアポトーシスなどの他の極めて重要な細胞機能に関与していますプラスチックでグラム。したがって、薬剤耐性の研究を向上させるために、多くの努力は、細胞特性の関連する変化を回避するように、より密接にin vivoで癌の微小環境を模倣することは、例えば、初代培養及び異種移植片のような新規な前臨床モデルの開発に向かうべきです細胞培養および培養条件の長期間に起因します。 図32は、注目すべきことに、我々のプロトコルは、ex vivoでのIC 50値を決定するために、細胞毒性アッセイを用いて、一次電池にも適用することができます。別の制限は、抵抗の多くの機構は、各抗癌剤のために存在するので、抵抗の類似または異なるメカニズムが同一であるが、独立し治療に曝露された細胞内で開発できるということです。したがって、比較選択戦略は、同じ化学療法剤で処理し、同じ親細胞のスプライシングバリアント上の遺伝子解析、などの並列選択および分析を、関与させるべきです。
jove_contentは">機能的検証のためのさらなるアプローチは、細胞株に関心のスプライス変異体を過剰発現することを目的とした、または特異的にRNA干渉またはスプライス切替オリゴヌクレオチド33を使用して、それらの発現をダウンレギュレートされるべきです。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
References
- Gottesman, M. M.
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
- Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
- Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
- Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
- Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
- Shendure, J., Ji, H.
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
- Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
- Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
- Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
- Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
- Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
- Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
- Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
- Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
- McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
- Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
- Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
- Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
- Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
- Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
- Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
- Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
- Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
- Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).
