Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

Published: November 17, 2016 doi: 10.3791/54719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, York University

Abstract

المعهد الوطني لليماغيج الصحة هي قوية ومتاحة بحرية برمجيات معالجة الصور. يماغيج ديه خوارزميات شاملة تحليل الجزيئات التي يمكن استخدامها بشكل فعال لحساب الجزيئات البيولوجية المختلفة. عندما عد أعداد كبيرة من عينات من الخلايا، تقدم عدادة الكريات عنق الزجاجة بالنسبة لآخر. وبالمثل، عد الأغشية من المقايسات الهجرة / الغزو مع عداد خلية يماغيج المساعد، وإن كانت صحيحة، هو عمل استثنائي مكثفة، ذاتية، واشتهر عن التسبب في آلام الرسغ. لتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير اثنين من الإضافات ضمن يماغيج للقيام بهذه المهمة الوحيدة للعدادة الكريات الآلي (أو حجم معروفة) وعد الخلايا الهجرة / الغزو. كل من الإضافات تعتمد على القدرة على اكتساب الميكروسكوب عالية الجودة مع الحد الأدنى من الخلفية. فهي سهلة الاستخدام والأمثل لفرز سريع وتحليل عينات كبيرة الحجم مع أدوات التحليل المدمج للمساعدة في معايرة التهم الموجهة إليه. من خلال الجمع بين المبدأ الأساسيالصورة من عداد الخليوي مع خوارزمية الفرز والعد بعد التحليل الآلي، وهذا يزيد كثيرا من السهولة التي المقايسات الهجرة يمكن ان يتم بدون أي خسارة من الدقة.

Introduction

في عد الخلايا في المختبر هو أسلوب الأساسية الهامة في مجموعة واسعة من تجارب زراعة الأنسجة. تحديد بدقة عدد الخلايا في الثقافة أمر ضروري لاستنساخ التجارب وتوحيد 1،2. عد الخلايا يمكن القيام بها يدويا باستخدام عدادة الكريات فضلا عن استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب الآلية، ولكل منها مزاياه وعيوبه 3،4،5. معظم الطرق الآلية للعد الخلايا تنتمي إلى واحدة من فئتين، تلك التي تستخدم مبدأ كولتر أو التدفق الخلوي. عدادات كولتر الاستفادة من خلايا المقاومة الكهربائية لتحديد عدد الخلايا والحجم. فهي سريعة ودقيقة وأرخص من أجهزة قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك، نادرا ما يتم استخدامها لعد الخلايا الوحيد نظرا لتكلفتها كبيرة بالمقارنة مع العد والفرز اليدوي 3. تدفق cytometers، من ناحية أخرى، هي مكلفة ولكن لديهم العديد من التطبيقات مثل عد الخلايا، وتحليل شكل خلايا، الحادي والعشرينructure وقياس الخلايا الداخلية علامات 4،5. تتوفر العديد من الشركات المصنعة للأجهزة التي تستخدم أي من هذين المبدأين. العد والفرز اليدوي هو في متناول اليد ولكن وقتا طويلا وتخضع للانحياز في حين تأتي الأساليب الآلي مع جزء من الوقت اللازم لالعد والفرز اليدوي ولكن باستخدام أجهزة باهظة الثمن 6.

إجراءات زراعة الخلايا الأخرى الشائعة هي في المقايسات خلية حركية المختبر، وهي هجرة الخلايا وغزو 7. وتستخدم الهجرة والغزو فحوصات عادة للتحقيق حركية الخلية والغزو ردا على استجابة الكيميائي. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم على نطاق واسع لدراسة التطور الجنيني، والتفريق، استجابة التهابية، والانبثاث من أنواع خلايا متعددة 7-11. الخلايا التي هاجروا أو غزو من خلال غشاء مسامي لفحص الهجرة يمكن أن يكون كميا بطريقتين مختلفتين. أولا، من خلال تلطيخ الخلايا مع صبغة الفلورسنت، التفكك جيئة وذهابام الغشاء، وتقدير باستخدام قارئ الفلورسنت 12. وجود قيود على هذا الأسلوب من تقدير هو أنه لا يوجد سجل يمكن الاحتفاظ بها في الأغشية وليس هناك احتمال لمزيد من التحليل 13. طريقة القياس الكمي الثاني هو لهاجر / الخلايا لتكون ثابتة وملطخة صبغة الفلورسنت أو أكثر شيوعا، مع الأصباغ الخلوي مثل البنفسجي وضوح الشمس، طولويدين صبغة زرقاء أو الهيماتوكسيلين غزا. ثم يتم كميا الخلايا يدويا باستخدام الصور المجهرية مقلوبة من هذه الأغشية وهي تستغرق وقتا طويلا مهمة جدا 12،13.

للتغلب على عيوب خلية العد والفرز اليدوي، وضعت اثنين من عدادات خلية الآلي موثوقة ودقيقة للتركيز خلية ولفحص الهجرة. وقد وضعت هذه الخوارزميات مكافحة خلية الآلي ليماغيج على النحو المساعد باستخدام لغة الكمبيوتر جافا أوراكل. يماغيج هو أداة معالجة الصور العامة وعلى نطاق واسع المستخدمة التي وضعها المعهد الوطني للهيئة التعليم العاليLTH (NIH) 14،15. وبالتالي، أكتب هذه الإضافات ليماغيج يسهل سهولة الاندماج في المجتمع البيولوجي.

أتمتة عد الخلايا يضمن إنتاجية عالية واستنساخ مقارنة العد والفرز اليدوي. على الرغم من أن البرامج والإضافات أخرى متاحة يمكن استخدامها لحساب تركيز الخلية من خلال تحليل الصور 5،16،17، خلية تركيز حاسبة المساعد سريع ويمكن أيضا التعامل مع التخفيفات من الخلايا والعلاجات. وعلاوة على ذلك، جميع النتائج والحسابات من هذه العدادات اثنين يمكن انقاذه وتصديرها. هي الأمثل الإضافات المذكورين في هذه الورقة لاستخدام على النقيض المجهر مرحلة لتصوير الخلايا الحية وحقل كبير للعرض (كامل القبض على غشاء) التصوير للأغشية الهجرة الفحص من خلال استخدام نطاق تشريح. هي متاحة بحرية للتحميل مع تعليمات التثبيت من الإضافات: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

مجهر 1. مجمع وإعداد الكاميرا (خلية تركيز حاسبة)

  1. زيادة سطوع المصباح إلى كامل مع مقبض تعديل ضوء، والتحول إلى عدسة الهدف 4X، وضمان ويتم اختيار المرشحات النقيض من المرحلة.
    ملاحظة: أي مقلوب المرحلة المجهر النقيض لزراعة الأنسجة مع خلفية مظلمة، على سبيل المثال، فب مرحلة النقيض من ذلك، يمكن استخدامها وفقا للإجراءات المجهر والكاميرا القياسية.
  2. ضمن البرامج المجهر، تعيين إعدادات التقاط الصور إلى القيم الافتراضية.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم المجهر للعثور على موقع هذه الإعدادات.
    1. مجموعة 'السطوع'، 'المقابل'، و 'التشبع "إلى 100٪ و" جاما "و" مكاسب "إلى 1.0.
      ملاحظة: اعتمادا على البرنامج، "السطوع" و "التباين" قد الافتراضي إلى قيمة 0٪ بدلا من 100٪.
    2. مجموعة صور يتم التقاطها باللونين الأبيض والأسود باستخدام أعلى دقة المتوفرهه (1600 س 1200 بكسل (بكسل) أو أكبر).
      ملاحظة: "تشبع" من 0٪ لا يكفي إذا وضع أبيض وأسود غير متوفر.
  3. وضع عدادة الكريات القياسية على خشبة المسرح المجهر والتقاط صورة كما هو مبين في الشكل (1A)؛ هذا هو "حجم الصورة المعايرة. ضبط التعرض توقيت كما هو مطلوب.

2. صورة معايرة حجم

  1. فتح يماغيج ومن قائمة الإضافات، وبدء تركيز خلية حاسبة (CCC) المساعد، على سبيل المثال، والإضافات> محلل> 'تركيز خلية حاسبة.
    1. إذا كانت لوحة الجانب الأيمن "صورة حجم معايرة" غير مرئية، انقر على 'معايرة "لاظهار ذلك.
  2. في ImageJ، وفتح "حجم الصورة المعايرة" من الخطوة 1.3 ( 'ملف'> 'المفتوحة') وفي CCC انقر على "احصل على صورة البعد 'زر.
    ملاحظة: هذا سوف تملأ في كل صورة العرض ومربعات النص الارتفاع مع دقة وضوح الصورة بالبكسل تلقائيا.
  3. في ImageJ، حدد "أداة خط مستقيم" إلى جانب اختيار الأدوات ورسم خط مستقيم عبر طول عدادة الكريات الابتدائية (P) -square موضح في (الشكل 1B) عن طريق النقر والسحب المؤشر.
    1. دفع مفتاح 'م' لعرض إطار نتائج تحتوي على قياسات خط مستقيم. اكتب قيمة من العمود طول في مربع النص "ف مربع طول" في CCC (الشكل 1B).
    2. انقر على زر "احسب صورة وحدة تخزين" لإخراج حجم الصورة في مربع النص صورة حجم. بالتناوب، إذا كان حجم الصورة هو معروف بالفعل، اكتب وحدة التخزين في NL في مربع النص صورة حجم.
  4. انقر فوق الزر "حفظ".
    ملاحظة: يتم الآن معايرة المساعد.

3. كاميرا التعرض المعايرة

  1. بعد حصاد الخلايا لعد عبر عدادة الكريات، وتحميل 10 ميكرولتر من الخلايا في غرفة عدادة الكريات ووضعه على خشبة المسرح المجهر.
  2. باستخدام نفس الإعدادات من الخطوة 1.2، وضبط وقت التعرض بحيث تكون خطوط خلفية عدادة الكريات تختفي.
    1. ضبط التركيز حتى أن المناطق الداخلية من الخلايا أغمق من غشاء الخلية، مما يدل على التركيز داخل المقطع العرضي المركزي للخلية وليس القطبين.
    2. وعلاوة على ذلك ضبط التعريض الضوئي بحيث لا يتم تعريض الخلايا وتشبه تلك المصورة في (الشكل 1C).
      ملاحظة: خطوط عدادة الكريات مرئية قليلا مقبولة. فمن المستحسن لحفظ أو تسجيل هذه الإعدادات للحفاظ على دقة والتكاثر.

4. الحصول على الصور

  1. لكل عينة الخلية، وتحميل 10 ميكرولتر في مجلسي عدادة الكريات لزيادة قوة الاستدلال الإحصائي 2. وضع عدادة الكريات على المسرح المجهرللتصوير.
    ملاحظة: إن قرار والتكبير من كل صورة يجب أن تكون هي نفسها باسم 'حجم الصورة المعايرة. البرنامج المساعد بحساب جميع الصور من أي المجلد المحدد. تبقى الصور ليتم احتساب معا في نفس المجلد.
    1. إذا وظيفة اسم الملف لصناعة السيارات زيادة متاح، قم بتشغيله والتأكد من عدم ظهور كل صورة بعد التقاط لزيادة الإنتاجية.
      ملاحظة: حفظ وإغلاق كل صورة سوف يتباطأ بشكل كبير بانخفاض العملية يدويا. الرجوع إلى دليل المستخدم المجهر للحصول على معلومات عن توافر وظيفة لصناعة السيارات في الزيادة.
    2. القبض على ثلاثة أشخاص على الأقل الصور غير المتداخلة في المنطقة الوسطى من عدادة الكريات على الرغم من أن أكثر من المستحسن (5-10) لزيادة دقة.
      ملاحظة: تجنب كل من أعلى والمناطق السفلى من الدوائر كما تميل الخلايا لزيادة في كثافة في كلا الموقعين. خذ نفس العدد من الصور لكل غرفة. هذا مطلوب من أجل حسن سير العمل في البرنامج المساعد أثناء الفرز.

    5. عد صورة والتخفيفات

    1. في CCC، انقر على 'عدد خلايا "ومراقبة مربع الحوار اختيار دليل. حدد المجلد المراد فرزها.
    2. مراقبة مربع إدخال رقم العينة بعد اختيار المجلد. أدخل عدد من الصور التي التقطت في غرفة، أي 4.1.2، وانقر على 'موافق'. والبرنامج المساعد الآن عد جميع بي، شجار، وبابوا نيو غينيا الصور في المجلد المحدد حسب الترتيب الأبجدي.
      ملاحظة: يؤدي النقر على زر 'عارض نموذج' إظهار إطار عارض نموذج عرض معلومات حول عينات فرزها. تركيز العينة هو متوسط ​​تركيز جميع الصور التي التقطت في الغرفة. عينات مع تركيزات الكمية اللابعدية يمكن أن تضاف إلى هذه القائمة، مثل إضافة الدواء أو العلاج جزيء صغير.
      1. إعادة فرز الأصوات في عينات من الخلايا إذا تختلف تركيزات بشكل كبير في تهم نفس العينات (القسم 4).
        ملاحظة: لحساب التخفيفات عن كل طنانه احصى-العينات، CCC تلقائيا يستخدم الصيغة C 1 V 1 = C 2 V 2.
    3. استخدام سيناريو البذر 15000 خلية لكل 200 ميليلتر إلى 30 بئرا من لوحة 96-جيدا + 1 اضافية:
      1. تعيين النص إلى اليمين من التسمية C2 إلى 15،000 وتركيز حجم النص إلى 200، تغيير وحدة مربع التحرير والسرد المجاورة ل"ميكرولتر.
        ملاحظة: البرنامج المساعد حساب في نهاية المطاف التركيز في خلية / مل.
      2. تأكد من مربع التحرير والسرد حجم وV2 اختيار (الحجم النهائي) وفي مربع النص إلى اليمين إدخال 6200 (200 ميكرولتر س (30 + 1))، واختيار "ميكرولتر" في مربع التحرير والسرد وحدة حجم.
    4. انقر على "حساب التخفيف" لإضافة التخفيف دخلت حاليا إلى مربع القائمة الأيسر السفلي.
      ملاحظة: للحصول على كل تخفيف المضافة، وسيتم حل لكل عينة وعرض في مخطط الشجرة إلى اليمين. انقر مرتين على كل دخول للتوسع.
    5. النقر روقال انه على زر "حفظ" أسفل زر "عارض نموذج 'الكتابة إلى ملف جميع البيانات والتخفيفات عينة.
    6. ملاحظة: يمكن استعادة هذه البيانات في أي وقت عن طريق النقر على 'تحميل' واختيار الملف المحفوظ.

    6. الهجرة والغزو (عداد)

    1. أداء الهجرة والغزو فحوصات باستخدام معيار طريقة بويدن غرفة 7-9.
    2. بعد خلايا هاجروا / غزا، وإزالة بعناية وسائل الإعلام في إدراج كتبها قلب والتنصت بلطف. انضمت الفتيل بعيدا بأية وسيلة الزائدة إلى أسفل الغشاء عن طريق لمس حافة منشفة ورقية.
      ملاحظة: لا تلمس الغشاء نفسه إلى منشفة، وهذا قد إزاحة الخلايا الالتزام.
    3. إصلاح وصمة عار على الخلايا كما ذكرت 7-9 في 24 لوحة جيدا اقامة مع كل صف يحتوي على ~ 500 ميكرولتر من حل مختلف، على سبيل المثال، تثبيتي، وصمة عار 1، وصمة عار 2، والماء المقطر المزدوج ([ده 2 O). ملء طبق الثانية مع برنامج تلفزيوني 1X رس وضع تدرج في قبل القطع.
    4. غسل إدراج عن طريق وضعها في آبار مليئة ده 2 O وملء إدراج مع ده 2 O. استنزاف المياه قبل ينظف بعيدا الخلايا عن طريق انقلاب.
    5. استخدام قضيب من القطن نظيفة لإزالة الخلايا من الامم المتحدة وهاجر / برنامج الأمم المتحدة للغزو من أعلى الغشاء مع الحرص على عدم تلف الغشاء. تكون شاملة حول حواف الغشاء.
    6. قطع الغشاء باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط وبعناية نقل الغشاء (الجانب أسفل إلى أعلى) على شريحة زجاجية نظيفة.
    7. إضافة قطرة صغيرة من محلول المتصاعدة تحت وفوق الغشاء، وتغطي مع انزلاق الغطاء رقيقة.
      ملاحظة: تجنب احتباس فقاعات في الحل متزايدة للحفاظ على صحة التهم الموجهة إليه.

    7. تشريح نطاق وكاميرا الإعداد

    1. بدوره على مصدر للضوء المجهر والكاميرا.
      ملاحظة: يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم المجهر للحصول على إرشادات مفصلة.
    2. خفة دمهين البرمجيات، وضبط إعدادات التقاط الصور المجهر إلى القيم الافتراضية.
      ملاحظة: في حالة وجود وظيفة المتوسط، فمن المستحسن قيمة الأربع. هذا هو حل وسط جيد بين درجة المتوسط ​​والحصول على الصور وقت. وبالمثل، وعلى درجة صغيرة من شحذ قد يزيد صورة الإخلاص.
      1. مجموعة 'السطوع'، 'المقابل'، و 'التشبع "إلى 100٪ و" جاما "و" مكاسب "إلى 1.0.
        ملاحظة: اعتمادا على البرنامج، "السطوع" و "التباين" قد الافتراضي إلى قيمة 0٪ بدلا من 100٪.
      2. عرض مجموعة (الوقت الحقيقي) وقرار القبض على ضبط الحد الأقصى من (1600 س 1200 بكسل و2،592 خ 1،944 بكسل، على التوالي).
        يمكن تعديل عرض القرار على النحو المطلوب إذا كان معدل التحديث بطيئة جدا: ملاحظة. وقرارات أقل من صعوبة في التركيز بدقة ولكن زيادة معدل التحديث.
    3. للمرحلة نطاق تشريح، واستخدام backgro الأبيض الصلبةاوند. خلفية سوداء أو زجاج غير كافية.
    4. استخدام مصدر ضوء المرحلة المذكورة آنفا، ويفضل أن يكون من اثنين من أضواء LED مرنة إلى يمين ويسار المسرح.
      ملاحظة: أقل من المرحلة مصدر الضوء سوف تضيء المسام داخل غشاء فحص الهجرة التي قد تؤثر سلبا على دقة التهم اللاحقة.
    5. وضع تكتمل الهجرة فحص شريحة الغشاء على خشبة المسرح. وعند النظر إلى الصورة في الوقت الحقيقي التي يعرضها البرنامج، وضبط التكبير مع مقبض تعديل التكبير بحيث حواف غشاء واحد ليست سوى في مجال الكاميرا وجهة نظر.
      ملاحظة: وضع الشريحة على طبق من زجاج فاق مرحلة خلفية بيضاء يسهل على المناورة الشريحة للتصوير.
    6. توفيق أوضاع الخفيفة المصدر (7.6.1) وأوقات التعرض لإنتاج قدر الإمكان الصورة المثالية هو مبين في الشكل 2A. اعتمادا على السطوع، ويجب التعرض مرات من 5-60 مللي تكون كافية.
      ملاحظة:والهدف هو إنتاج صورة مع اقل قدر من لون الخلفية ممكن وغشاء مضاءة بشكل موحد دون التقليل الإخلاص صورة، أي التعرض المفرط مما يؤدي إلى فقدان الخلايا المرئية.
      1. ضع مصادر الضوء اليسار واليمين في زاوية منخفضة نسبة إلى الشريحة. هذا وسوف تساعد على إزالة وصمة عار الخلفية والانحرافات لوني. محاولة للحفاظ على كل مصدر الضوء المعاكس مباشرة إلى أخرى.
        ملاحظة: أثناء المناورة كل مصدر الضوء في الموقف، وتحويل بعضا. هذا يساعد على مركز للمجال الإضاءة على الغشاء نفسه أكثر سهولة ودقة.
    7. إزالة الشريحة وتوازن اللون الأبيض للصورة باستخدام زر واحد في البرنامج المجهر.
      ملاحظة: يتم الآن معايرة المجهر. حفظ العديد من الإعدادات ممكن لاستخدامها في المستقبل واتخاذ علما بالمواقف مصدر الضوء وكثافة.

    8. الحصول على الصور وFlatfield

    1. في داخل البرنامج، تعيينموقع المجلد القبض، والقبض على صورة واحدة في الغشاء. تسمية الصور التالية القالب العام لل: الاسم - ###، على سبيل المثال، مراقبة - 001.tif، التحكم - 002.tif، اختبار المخدرات - 001.tif، وهلم جرا.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج صورة، حفظ نوع ملف الصورة كما شجار على الأشكال الضياع أخرى مثل الحياة السياسية في فرنسا.
      ملاحظة: الصور لا يتبع القالب العام لا تزال تحسب لكنها لن تكون خاضعة للتجمع الآلي وإيفاد شقة.
      1. إذا المطلوب هو تصحيح flatfield، لكل شريحة العثور على منطقة فارغة وأخذ صورة فارغة التالية اصطلاح التسمية: الاسم - فارغة.
        ملاحظة: فارغة هي منطقة تقع على الشريحة التي لا تحتوي على الغشاء ويمثل الإضاءة الخلفية.
      2. على الفور قبل التصوير، تتسطح كل الغشاء عن طريق الضغط على ساترة وإزالة العديد من فقاعات المحاصرين وقت ممكن.
    2. في ImageJ، انتقل إلى الإضافات وفتح المساعد TC. على سبيل المثال، والإضافات> تحليل> & #39؛ Transwell مكافحة '.
    3. ضمن TC، انقر على زر "Flatfield" ومراقبة مربع الحوار اختيار دليل. حدد المجلد حيث تم حفظ الصور الغشاء.
      ملاحظة: فقط الصور المحفوظة مع القالب العام فوق سيتم تلقائيا flatfield تصحيح وحفظها في مجلد جديد يسمى Flatfield داخل المجلد الذي تم اختياره. انظر الشكل 2B للحصول على مثال صورة flatfield تصحيحها.

    9. إعدادات التكوين

    1. فتح صورة غشاء الهجرة فحص في ImageJ ( 'ملف'> 'فتح') ثم اختر صورة> ضبط> 'اللون عتبة ...'. مراقبة نافذة عتبة اللون لضبط ما هي الألوان وسوف تخرج من الصورة.
      1. في الجزء السفلي من النافذة، وتحديد طريقة استيفاء الحد الأدنى ل"Shanbhag"، اللون عتبة إلى 'الأبيض'، ومساحة اللون إلى "RGB" (أحمر أخضر أزرق)؛ الخلفية الداكنة إلغاء تحديد اذا تم اختيارهم.
      2. ضبط أعلىالمتزلجون عن طريق النقر والسحب علامات ل0 والمتزلجون أسفل إلى 255 (ترك المتزلجون السفلي في 255). تأكد من أن صورة بيضاء بالكامل.
    2. ضبط أكبر المتزلجون الأخضر والأحمر فقط حتى نوى مرئية.
      ملاحظة: الإعدادات المحددة ستختلف كليا على وصمة عار الخلايا المستخدمة. انظر الشكل 2C.
    3. في البرنامج المساعد TC، إدخال القيم من كبار المتزلجون RGB إلى مربعات النص وإعدادات التكوين المرتبطة "عتبة RGB. انقر على "إضافة / تعديل 'زر والكتابة التكوين.
      1. مغادرة حجم متوسط ​​السفلى والعليا القيم في 1 - اللانهاية.
    4. في لوحة إعدادات التكوين، انقر فوق "حفظ" لكتابة الإعدادات إلى القرص الصلب.

    10. صور العد والمعايرة

    1. فتح المساعد TC (8.2) وانقر على "عدد المجلدات 'ومراقبة مربع الحوار اختيار دليل. حدد المجلد لتحسب لالثانية انتظر حتى النهاية.
    2. يضاف كل عينة تحسب تلقائيا إلى الجدول الرئيسي. الأعمدة الرئيسية هي 'عدد'، 'نوعية'، و 'معايرة؟ ".
      ملاحظة: عدد معايرة الامم المتحدة هو عدد الجسيمات في غشاء داخل المنطقة المعروضة في العمود "مجموعة المساحة.
      ملاحظة: تتراوح الجودة من حوالي -0.8 إلى 1.7. س ≥ 0.5 غير مقبول.
      1. لاحظ علامة في "معايرة؟ العمود إذا كان يتم وضع صورة للمعايرة بناء على التشابه بينه وبين مقاييس مثالية.
        ملاحظة: كل من الجودة والمعايرة قد يوحي بأن الإعدادات الحالية هي ربما كافية. إذا كان بعد "نطاقات الحجم 'الصحيح' اللون استيفاء الحد الأدنى" وتم اختيارها وما زال اقترح المعايرة، والتفتيش على الأصلي وعدها يجب أن تكون الصور المحدد النهائي لعدد صحيح.
    3. تحديد جميع العينات في الجدول مأشر للمعايرة.
      1. انقر بزر الماوس الأيمن في تيانه الجدول وحدد إعادة فرز الأصوات> 'حجم المقترحة. وهذا سرد الصور مع منطقة الجسيمات الحد الأدنى المقترح.
      2. انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى واختر "إظهار مؤامرة". مراقبة مؤامرة تردد مبعثر من المناطق الجسيمات. وصورة مثالية لديهم الرسم البياني يشبه توزيع طويل الذيل اليمين العادي، أي منحنى الجرس. انظر الشكل 3B.
      3. ضبط انخفاض حجم متوسط، إذا لزم الأمر، من خلال تحديد العينة، النقر بزر الماوس الأيمن، واختيار إعادة فرز الأصوات> 'الإعدادات اليدوية. مراقبة الحوار إعدادات اليدوي. أدخل الإعدادات المطلوبة وعدد النقرات لإعادة فرز الأصوات في صورة مع الإعدادات الجديدة.
    4. لضبط التهم يدويا، اختر العينات، الحق النقر على الطاولة، وحدد "فتح صورة مع التهم". لاحظ الصورة الأصلية مع علامات حمراء تمثل كل الجسيمات عدها من قبل المساعد.
      ملاحظة: إعادة فرز الأصوات> 'مشاهدة أحصت الصورة الثنائية "يمكن أن تكون مفيدة للتحقق من مدى جودة طيجري حلها خلايا ndividual من قبل العتبة اللون.
      1. لإضافة عدد، عقد 'السيطرة' وانقر على اليسار. لاحظ علامة في موقع المؤشر التي ستضاف إلى عينات العدد الإجمالي. لإزالة علامة، انقر على الحق في الصورة. سوف المساعد إزالة علامة الأقرب إلى المؤشر.
      2. لإزالة مجموعة من علامات، استخدم أداة التحديد في ImageJ لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI). في حين عقد 'السيطرة'، انقر على الحق في الصورة وسيتم إزالة كل علامات داخل العائد على الاستثمار. مراقبة عدد الخلايا في العمود "الكونت".

    11. توفير / فتح نتائج والتصدير إلى CSV

    1. في TC، انتقل إلى شريط القوائم وانقر على 'ملف'> 'حفظ النتائج ". لاحظ مربع الحوار نتائج حفظ. اختيار اسم والمقصد وانقر على 'حفظ'.
      1. استخدام 'ملف'> 'نتائج المفتوحة "لتحميل ملف يحتوي على جميع البيانات المعروضة في الجدول الرئيسي، منها:ز المؤامرة.
        ملاحظة: الملف النتائج يحفظ الدلائل يتم حفظ الصور في إذا تم نقل الصور الأصلية بعد إنقاذ، و "الصورة الأصلية المفتوحة" و "فتح صورة مع التهم" ستفشل الوظائف.
      2. لإعادة تعيين الدليل صورة، حدد العينات، انقر على الحق في الجدول، واختر "إعادة تعيين الدليل صورة". لاحظ مربع الحوار اختيار دليل. حدد المجلد الجديد وفي حالة وجود الصور، والدلائل يمكن إعادة تعيين. إعادة حفظ الملف النتائج.
    2. حفظ ملف القيم المفصولة بفواصل (CSV)، في شريط القائمة اذهب إلى 'ملف'> 'تصدير إلى ملف .csv. وهذا ينتج ملف مع عينات تنظيمها في مجموعات الإحصائية مع متوسط ​​العد والخطأ المعياري للمتوسط. تم تصميم تخطيطه لبرسوم بيانية سريعة في برامج الرسوم البيانية المشتركة.
      ملاحظة: توجد هذه المجموعات الإحصائية عن المجموعات التي تم إنشاؤها ضمن TC.
      1. إذا كانت العينات تتبع قالب التسمية العام، تحديد العينات لتكون غرامouped، انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "تجمع السيارات. وهذا يضيف عينات تحمل نفس الاسم "لنفس المجموعة. استخدام التحكم سبيل المثال - 1، التحكم - 2، العلاج - 1، العلاج - 2: ستضاف على حد سواء ضوابط لمجموعة "تحكم" والعلاجات ل'العلاج'.
      2. إضافة عينات يدويا إلى مجموعة عن طريق النقر المزدوج خلية العينة "المجموعة" وكتابة اسم المجموعة. اختيار العينات التي يمكن ان تضاف إلى هذه المجموعة، انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "إضافة إلى مجموعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تركيز خلية حاسبة

ويبين الشكل 1 مجمل عملية المعايرة مجلس التعاون الجمركي والحصول على الصور معدود. الشكل 1A 1B وتصور صورة معايرة ف مربع وحساب طول ف مربع في بكسل. يحدد مجلس التعاون الجمركي تركيز خلية في حجم معين باستخدام المعادلة التالية:

المعادلة 1

ف مربع عدادة الكريات لديه وبلغ حجم التداول 100 NL (1 مم × 1 مم × 0.1 مم) ونظرا لهذا ثابت، ويمكن حساب حجم الصورة الإجمالي بعد تحويل بكسل إلى مم. الشكل 1C هو صورة مثالية للعد مع التركيز في خلايا عرض إضاءة مرحلة مميزة ولا التخرج خلفية عدادة الكريات. وأخيرا، مؤامرة مبعثر من شملت رقميظهر البريد 1D على درجة عالية من الارتباط، دليل مقابل العد الآلي من الخلايا من 57 الصور التي التقطت على مختلف التجارب وأنواع الخلايا بما في ذلك HTR8، ES-2، وSwan71. من المذكرة، كان النطاق العلوي من تركيز ~ 5.6 × 10 6 خلية / مل مع نهاية منخفضة من ~ 2.3 × 10 3 خلية / مل (≈ 5 خلايا لكل صورة). واقترح أنه إذا التهم هي أقل من 10-15 خلية لكل صورة، ينبغي وقف العينة في حجم أصغر لزيادة القدرة الإحصائية.

اقتناء وتجهيز الصور للهجرة الفحص عداد

تم تصوير المئات من الأغشية فحص الهجرة خلال العديد من التجارب، كل منها مع المصنف خط الخلية الأرومة الغاذية الإنسان HTR8، Swan71، أو المبيض خط الخلايا السرطانية ES-2. من هذه الصور، وقد تم اختيار متعددة لتمثيل مجموعة من الفئات من الفقراء جدا لنوعية ممتازة على أساس سطوع ووضوح ولون staineخلايا د، ودرجة تلوين الخلفية والجزيئات غير المرغوب فيها (الضوضاء). باستخدام هذه الصور، إعدادات RGB عتبة اللون الافتراضي (≈ 150، 120، 0) تم تحديد (الشكل 2C) وتستخدم كأساس في كل التطورات اللاحقة للخوارزمية. وكان الهدف هو تحقيق أقصى قدر من اللون النووي إلى إجمالي نسبة اللون، أي يجب أن يكون غالبية بكسل الملونة داخل نواة الخلية. لوحة العليا في الشكل 2A يصور سطوع المثالي صورة، خلية الوضوح أنويتها واللون، والضوضاء الخلفية يكاد يذكر. سطوع الصورة مهم لضمان عدم وجود تباين كبير بين ما يكفي من الخلايا والخلفية لإنتاج أبيض وأسود صورة ثنائية.

إذا لم يتم استيفاء هذا الاختلاف، قد تحسب مساحات واسعة أو لا يمكن التنبؤ بها من قبل يماغيج تحليل وظيفة الجسيمات. أفضل سيناريو هو خلفية بيضاء تماما. في المعارضة، لوحة أقل من فايجوري 2A ديه تلوين الخلفية المدقع والخلايا التي لا يمكن تمييزها تقريبا. والأغشية مع هذه الدرجة من تلطيخ على الأرجح تسفر عن نتائج يمكن الاعتماد عليها من مكافحة الهجرة الفحص.

في بعض الحالات، وزيادة سطوع إلى المستوى المثالي قد تؤثر على صورة الإخلاص من قبل تعريض الصورة. وبالمثل، والتعرض عالية أو سطوع يمكن أن تحدث آثارا لوني النظامية مع ضوء التدريجي أو عدم انتظام والمناطق المظلمة. مع تصحيح flatfield، وهذه الآثار يمكن التقليل أو إزالتها تماما كما هو مبين في الشكل 2B (مقابل العلوي اللوحة السفلى). وعلاوة على ذلك، وتصحيح flatfield هو وسيلة جيدة لتحقيق التعادل في سطوع الصور غشاء متعددة.

المعايرة والتحقق من الهجرة الفحص عداد

لمساعدة لناإيه في تحديد أفضل لو صور غشاء الهجرة فحص تلبي المعايير المطلوبة لحساب دقيق، وقد صممت اثنين من التصفيات، جودة دعا صورة (س)، ومعايرة التوصية (CR). الأهم من ذلك، على حد سواء التصفيات، وكما يوحي اسم CR، هي توصيات فقط والعمل كمرشدين بدلا من القضاة المطلقة لقابلية العد Countability كل صورة. وتقوم كل من س و CR على المقاييس من مؤامرة تردد مبعثر من منطقة الجسيمات (10.3.2). للتبسيط، مقياس يمكن اعتبار الأشكال المختلفة للمنحنى التي تشكل مؤامرة تردد. تم تحديد المقياس المطلوب لس الكافي (≥0.5) من خلال التوزيع الطبيعي تقريبي لوحظ من حجم الخلية. عادة، الخلايا التي هي غير القابلة للحل من بعضها البعض، والإفراط في ملون، أو مجرد كبيرة على وجه الخصوص، يتحول skewedness إلى التوزيع الطبيعي الذيل اليمين (الشكل 3B). على هذا النحو، وهذا هو المعيار المثالي لصورة معايرة نموذجية. معإضافة الضوضاء الخلفية، وهذا يؤدي عادة إلى عدد كبير من الجزيئات في نطاق المنطقة 1-5 بكسل (الشكل 3A). من أجل حساب مقاييس المؤامرة، تم تركيب البيانات مع عشرة Savitzky-غولي منحنيات ممهدة لاختلاف درجة متعدد الحدود التي تنتجها مكتبة جافا العلمي الدكتور مايكل توماس فلاناغان (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga / جافا /). أساسا، وهذا يخلق نقاط متعددة في المنطقة التقريبية لكل extremum. من خلال سلسلة من الخرائط العنقودية كثافة الدنيا المحلية وماكسيما، صورة عامة للمقاييس مؤامرة يمكن أن تحسب على أنها قائمة مرتبة، أي الحد الأدنى والحد الأقصى، الحد الأدنى / الحد الأقصى التداخل، ...، ن extremum عشر. وباختصار، فإن الدرجة التي تناسب منحنيات ممهدة البيانات تردد يحدد كيفية بإحكام معبأة في القيم القصوى النقاط. وكلما زاد تجميع غير متداخلة القيم القصوى، وزيادة س يصبح. من الناحية النظرية، س يمثل وضوح الصورة بشكل عام على أساس ركان توزيع أحجام الجسيمات مختلفة.

إذا كانت منطقية CR صحيح أو لا يعتمد على سلسلة من القيم القصوى. من الشكل 3A، أن القائمة أمر أن يكون الحد الأدنى والحد الأقصى، وسلسلة من تداخل القيم القصوى استنادا إلى خصائص منحنى Savitzky-غولي. منذ 3A الشكل يمثل صورة غير معاير، هذا التسلسل العام للأعلام القيم القصوى CR الحقيقية كما، مما يوحي للمستخدم أن الصورة قد تكون هناك حاجة المعايرة. المضي قدما، ويمكن أن نرى أن من الشكل 3B، هذه القائمة سوف تكون متطابقة ولكن مع استبعاد من الحد الأدنى الأول. وهكذا تم تحديد مقاييس الصور غير معاير ومعايرة مثالية. والانحرافات من هذه المقاييس العلم عموما صورة للمعايرة وتقليل س ≤ 0، مثل الحال مع غشاء ضوضاء عالية الخلفية في الشكل 3C. تطبيق هذه التصفيات لاختيار من متواضعة إلى صور ممتازة، فيما يتعلق السطوع والضوضاء الخلفية، فمن الواضح أن التهم صورة معايرة هي أقرب كثيرا إلى التهم اليدوية من لم تتم المعايرة (1.9٪ ± 0.3 مقابل 21.7٪ ± 2.9، على التوالي؛ الشكل 3D، E). ونظرا لجودة عالية الشاملة من الصور المختارة لتحليل (غير معاير المعادلة 2 = 0.71 ± 0.04. يعني ± SE)، كانت هناك زيادة متواضعة المتوقع فقط في س التالية المعايرة ( المعادلة 2 = 0.90 ± 0.04). مجتمعة، يقترح س إمكانية قابلية العد Countability الشاملة للصورة في حين CR هو مؤشر قوي على ما إذا كانت معايرة ناجحة أم لا.

توقيت مقارنات من كل عداد تركيز خلية والهجرة الفحص عداد

هين الصفحات = "1"> استخدمت باحثان (المستخدم 1 والعضو 2) لاختبار المقارنات السرعة بين الطرق اليدوية والآلية. وكان كل من الباحثين خبرة كبيرة مع عد الخلايا وفحص الهجرة ولكن كان المستخدم 1 من ذوي الخبرة في استخدام كل من مجلس التعاون الجمركي والتعاون التقني في حين أن المستخدم 2 على اتباع التعليمات المكتوبة. الشكل 4A يقارن CCC وقت المعايرة بين المستخدم 1 و 2. وكما كان متوقعا، كان المستخدم 1 كبير أسرع من المستخدم 2، جنبا إلى جنب، مع الأخذ في المتوسط ما يقرب من خمس دقائق للمعايرة CCC. من أجل مقارنة اليدوي عدادة الكريات العد ومعدلات الآلي، وتمت مقارنة معدل اليدوي عد باستخدام عداد رصيده إلى الوقت الذي استغرقه لاتخاذ تسع صور من الغرفة عدادة الكريات وعدها في مجلس التعاون الجمركي (الشكل 4B). / تم استخدام تركيز خلية نموذجية من 1.15 × 10 6 خلايا مل مقارنة التوقيت، مما يؤدي إلى بمتوسط زيادة 1X في الإنتاجية. وتختلف هذه النسبة حسب عدد الخلايا تحميلها فيعدادة الكريات كما الوقت الإجمالي المتخذة لالتقاط الصور ومعالجتها مستقلة من عدد الخلايا.

وأخيرا، تم قياس توقيت تشمل الحصول على الصور من الأغشية، والكمي في TC، ودليل التسويات من هذه الصور في الشكل 4C. والجدير بالذكر، تم اختيار 12 الهجرة فحص الأغشية مع انخفاض عدد الخلايا (مجموع = 10571 الخلايا) وتلوين الخلفية كبيرة والحطام الخلوي لتسهيل سيناريو أسوأ الحالات التي تتطلب تعديلات يدوية لعدد الخلايا. وينعكس هذا في عمود تعديل الشكل 4C (الصفة) حيث يستغرق في المتوسط 13 دقيقة لإزالة التهم غير المرغوب فيها وإضافة خلايا تفويتها. وعلى سبيل المقارنة إلى العد والفرز اليدوي، وتم تحديد أفضل معدلات عد الخلايا مع مكافحة الخليوي، تم استخدام صور عالية الجودة الغشاء مع كثافة عالية الخلية (النتائج غير معروضة). أسفرت هذه بمعدل القصوى متوسط بين المستخدم 1 و 2 من 9.1 × 10 3 خلايا / ساعة(~ 2.5 خلايا / ث). باستخدام هذه الأرقام، احصي الأغشية من الشكل 4C 4.4x أسرع مع TC مما هو متوقع في معدل اليدوي القصوى. توفير الوقت تعتمد اعتمادا مباشرا على عدد الخلايا وجودة الصورة، عن طريق عد الأغشية الهجرة التي تتطلب القليل أو أي تعديل وكثافة الخلايا عالية (~ 7000 خلية / غشاء)، ولدت TC عدد الخلايا 1،395x أسرع من معدل اليدوي القصوى.

شكل 1
الشكل 1: خلية تركيز حاسبة. صورة مجهرية على النقيض من (أ) مرحلة من الميدان الرئيسي المركزي للعدادة الكريات التي اتخذت في 40X مجموع التكبير. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. (ب) وهناك نسخة من صورة اقتصاص من (A) التي تصور ما طول لقياس على عدادة الكريات. تم تسليط الضوء على عمود طول نتائج نافذة لسهولة تحديد. الشريط الأصفر= 1 مم. (ج) صورة مجهرية مثالية من عدادة الكريات تحتوي على خلايا HTR8 بعد المجهر والبرمجيات المعايرة في 40X التكبير الكلي مع قرار من 1600 س 1200 بكسل. شريط مقياس = 200 ميكرون. (D) مؤامرة مبعثر مقارنة التهم اليدوية باستخدام عداد يماغيج المساعد خلية مقارنة التهم الآلي من نفس الصور باستخدام تركيز خلية حاسبة. ن = 57 صور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: فحص الهجرة مواجهة صور تمثيلية. (A) لوحة العليا هي جزء الثامن واحدة من غشاء إجمالي تصور صورة مثالية مع الحد الأدنى من الخلفية؛ شريط مقياس = 200 ميكرون. التحتوي اللوحة السفلى صورة مع تلوين الخلفية الكبير الذي يؤثر بشدة على دقة العد التلقائي؛ شريط مقياس = 585 ميكرون. (ب) تمثل الجزء العلوى من الصورة القاتمة ذات نوعية جيدة والتي أنتجت التهم غير صحيحة. لوحة أسفل هو نسخة معدود من نفس الصورة بعد تصحيح flatfield. الحانات النطاق = 593 ميكرون. (C) وتمثل اللوحة العليا وأسرع في ضوء غشاء نموذجي. اللوحة السفلى هي نفس الصورة التي تتبعها يماغيج العتبة اللون المطلوب (RGB عتبة = 150، 120، 0) لإزالة الخلفية بين الخلايا والغالبية العظمى من السيتوبلازم الملون بشكل واضح. وقد اتخذت جميع الصور في 1.35X مجموع التكبير على نطاق تشريح معايرة بدرجة وضوح 2592 X 1944 بكسل من عدة غزوات الهجرة فحص من HTR8 ملطخة الهيماتوكسيلين. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء الضغط هنا للتنافسوا نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): المعايرة والتحقق من الهجرة فحص ج ounter. (أ) مثال نموذجي صورة غير معاير الجودة العالية. (ب) نسخة معايرة من (A) باستخدام إعادة فرز الأصوات الهجرة فحص العداد> 'حجم المقترحة. (ج) ومؤامرة تردد نموذجية من أدنى مستوى غشاء جودة الصورة مع وصمة عار خلفية كبيرة أو الظلام الشامل. (D) مؤامرة مبعثر مقارنة التهم اليدوية باستخدام يماغيج مكافحة المساعد خلية والهجرة فحص العداد العد الآلي. (E) شريط رسم بياني يوضح متوسط الفرق في المئة من معايرة مقابل التهم الآلي لم تتم معايرتها. البيانات هي متوسط ​​± SE. P <0.0001، ن = 30، أونبايريد اختبار t مع كور ولشction. استخدمت نفس الصور لD وجرى E. معايرة سواء مع إعادة فرز الأصوات> 'حجم المقترحة "وإعادة فرز الأصوات>" ضبط يدوي "لمواصلة صقل الحد الأدنى لحجم عدها وعتبة اللون. لم يتم إجراء أية تعديلات العد اليدوي باستخدام 'فتح صورة مع التهم' وظيفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: توقيت عداد تركيز خلية والهجرة فحص استخدام العداد. (A) مقارنة مرات CCC معايرة (الخطوتين 1 و 2) بين المستخدم 1 (CCC / TC الخبراء) والعضو 2 (CCC / TC مبتدئ). وبلغ متوسط (ب) مرات عد الخلايا دليل على مدى خمس محاكمات وأعرب في الخلايا تحسب لكل دقيقة. ومحوحسبت التهم ج من قبل مرات في المتوسط ​​لالتقاط تسع صور من غرفة عدادة الكريات وعدها مع مجلس التعاون الجمركي. كان تركيز خلية تستخدم ~ 1.15 × 10 6 خلية / مل. البيانات هي متوسط ​​± SE. ن = تمت مقارنة 5. (C) توقيت Transwell عداد على ثلاث فئات: شراء (ACQ، الخطوات 7 و 8)، الكمي (QNT، الخطوات 10.1-10.3.3 باستخدام إعدادات التكوين الافتراضي)، ودليل التكيف (الصفة، الخطوات 10.4 -1.4.2). كان الأغشية كميا على درجة عالية من تلوين الخلفية والحطام من أجل يتطلب تعديل يدوي كبير للتعداد دقيق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خطوات حاسمة، حل المشاكل، والقيود

طبيعة الأساليب الحسابية الآلي، وعلى وجه التحديد تلك التي تحليل الجزيئات، تستلزم القدرة الحسابية لتحديد هذه الجسيمات. ونتيجة لذلك، فإن دقة كلا حاسبة تركيز خلية والهجرة فحص العداد تعتمد مجورلي على الإخلاص صورة، وهذا هو، مدى الارتباط الوثيق بين الصورة التي تم التقاطها تشبه عينة الخلية أو فحص الهجرة الغشاء. ولذلك من أهمية ليفنات لمتابعة المجهر وما يرتبط بها من بروتوكولات معايرة البرمجيات على أفضل وجه ممكن. وهذا يشمل الحد من الضوضاء في الخلفية، والحد من الجزيئات غير المرغوب فيها، واستولت موحد الصور في التركيز مشرق و، والحفظ في تنسيقات الملفات غير الضياع مثل شجار. وبالتالي، من المرجح أن تؤدي إلى نتائج خاطئة إذا لم يتم استيفاء هذه المتطلبات كل من الإضافات. ومن الناحية العملية لذا دائما جيدة لمضاعفة عدد خلايا الاختيار لتحديد ما إذا كانت تطابق التوقعات المرئية في حين دوبت. إذا فعلا نتائج لا تتطابق، ويقارن بين الصورة الأصلية مع صورة ثنائية قد تساعد في توضيح هذه المسألة (10.4 المذكرة). في بعض الحالات، قد تحتوي على أكثر قتامة الصور الهجرة فحص المناطق الكبيرة التي تم فرزها بسبب القيم بكسل التي تقع ضمن حدود عتبة اللون. بشكل عام، وذلك باستخدام صورة flatfield سيتم إزالة الظلام والتلطخ ومنع التهم أكثر غير مرغوب فيها بسبب مخالفات لوني.

ونظرا لهذه المشاكل المحتملة وشائعة نسبيا، فإنه من المهم أن تتبع مبادئ توجيهية موحدة سلامة صورة مثل تلك التي اقترحتها مجموعة النشر الطبيعة وغيرها (13). للحفاظ على التهم متسقة، ينبغي أن تطبق أية تعديلات على صورة واحدة بالتساوي على جميع الآخرين. وهذا يشمل لكن لا يقتصر على التباين والتشبع والسطوع، وزيادة، والمرشحات مثل المتوسط ​​والحدة، ومرشحات لونية. وينبغي تجنب تعديل جاما كما ينطبق على التغيير غير الخطية من لون بكسل وذلك قد يؤثر على كل صورة مختلفةلاي 14. عند تطبيق وقت التعرض المشترك إلى صور مع خلايا قليلة (<1000)، وهذا يمكن أن يؤدي إلى التعرض المفرط وفقدان الإخلاص الصورة. على العكس من ذلك، وهو الغشاء مع آلاف الخلايا يمكن أن تتطلب التعرض مرات أعلى لمنع ناقص. وفقا لذلك، فإنه هو أفضل الممارسات لضبط الصور بأقل قدر ممكن، وإلا عند الضرورة، للحفاظ على أعلى صورة الإخلاص للتحقيق.

حتى مع وجود صورة عالية الدقة، يمكن أن تعول الجسيمات الحقيقية أن يكون منحرفا بشدة من الجزيئات غير المرغوب فيها. عند استخدام تركيز خلية آلة حاسبة، وإذا كان النموذج يحتوي على كميات كبيرة من الحطام الخلية، وتحديدا من مناطق مشابهة لتلك الخلايا مع وقف التنفيذ، وهذا قد تحرف النتيجة. في بعض الحالات، وهذا يمكن أن تمنع التحليل الآلي إذا لا يمكن التقليل من الحطام. وبالمثل، الأغشية الهجرة الفحص التي تحتوي على مستويات عالية من تلوين الخلفية من لون مشابه لملطخة الخلايا أو خلايا unremoved من الجانب الخلفي للغشاء، من المرجح أن تنتج طالنتائج n بالضبط. يمكن عادة هذه الجزيئات غير المرغوب فيها يمكن إزالتها في عدد قليل من الطرق: زيادة سطوع مصدر أو التعرض للضوء الوقت، تعديل العتبة اللون أن تكون أكثر صرامة، أو إزالتها يدويا عبر "فتح صورة مع التهم" (10.4). من المهم أن نلاحظ أن هذا البروتوكول تنتج نوعية أفضل من الصورة المطلوبة لمجلس التعاون الجمركي وTC للحفاظ على دقة. ومع ذلك، TC قادر على عد صور أقل بكثير جودة، تكبير مختلفة، أو بقع بلون مختلف، وعموما لا تتطلب سوى المزيد من الوقت الذي يقضيه في دليل التسويات (10.4).

خلال معايرة أي صورة غشاء الهجرة فحص من المهم أن تأخذ في الاعتبار دقة الصورة والحجم النسبي للخلايا. كما هو موضح سابقا، جودة الصورة (س) والتوصية معايرة (CR) تعتمد على مقاييس تردد مؤامرة من منطقة الجسيمات. الصور تحليلها، كل خلية يستغرق في المتوسط ​​1 / 100،000 منمجموع مساحة الصورة. عند استخدام الصور الملايين فقط من بكسل مع نسبة صغيرة حجم الخلية، والاختلاف في حجم الخلية هو أيضا صغير. وهذا يعني أن الفرق قد تتراوح فقط 10-60 بكسل. ولكن كما مساحة الخلية إلى نسبة المساحة يحصل على صورة أكبر، وتوزيع الخلايا أحجام الزيادات، والحد من التفرطح للتوزيع الطبيعي حجم الخلية من خلال خفض وتيرة في أي منطقة معينة. وهذا بدوره يمكن أن يجعل حساب الآلي من منطقة خلية من الصعب أو المستحيل لمساحة لا تقل محددة لا يمكن تحديدها. وبالمثل، وهذا ينطبق أيضا على الصور مع أرقام قليلة من الخلايا حيث تردد من أحجام مختلفة من الخلايا قد تكون منخفضة جدا (<50). ونتيجة لذلك، عند تحليل الصور مع قرارات مختلفة عن تلك المستخدمة في هذه الدراسة أو توزيعات مختلفة من حجم الخلية، قد تكون هناك حاجة إلى تحديد اليدوي لمجموعة حجم الخلية (10.3.3).

أهمية والاتجاهات المستقبلية

كان يماغيج مكافحة المساعد خلية rele البدايةASED في عام 2001 من قبل الدكتور كورت دي فوس وكانت بمثابة العنصر الرئيسي لخلية العد والفرز اليدوي لهذا اليوم. أن يستمر هذا الاتجاه من الأدوات المتاحة بحرية للمجتمع البيولوجي، آلة حاسبة تركيز خلية والهجرة فحص العداد توفر الخطوة التالية في أدوات مجانية للمساعدة على زيادة الإنتاجية والتكاثر بين التجريبي للفحوصات الهجرة. النتيجة النهائية للفحوصات الهجرة تعتمد بشكل كبير على عدد من الخلايا المزروعة. إرجو عدد خلايا موثوق هو ضرورة للاستنساخ. وبهذه الطريقة، CCC يقدم كل زيادة دقة بسبب اليقين الإحصائي أعلى من تركيز خلية والأوقات العد أقصر الحفاظ على صحة الخلية.

وعلاوة على ذلك، فإن النتيجة النهائية من كل من الإضافات هي عدد من عدد الخلايا وليس مؤشر نسبي مثل مضان. غيرها من البروتوكولات المختلفة موجودة والتي مضان الإجراء إلا بعد تلطيخ لكن هذه الأساليب تعاني من عدم وجود حساسية 13. تقدم أدوبي فوتوشوب الخاص تحليل الجزيئات تي فيمونغوشيفيتش ولكن يجب أن يكون شراؤها البرنامج للاستخدام ولا يقدم تحليل ما بعد العد المتاحة من الهجرة فحص العداد 20. كل من الإضافات تعتمد على ميزة العد الجسيمات من يماغيج وبالتالي يمكن تعديلها من قبل المستخدم النهائي عن طريق تحرير وحدات الماكرو التي تستخدمها يماغيج. هذا يوفر مرونة أكبر للمستخدم لتوسيع نطاق الإضافات إلى الجزيئات الأخرى من خلال إنشاء وحدات الماكرو جديدة. مزيد من التطوير لزيادة اتساع جزيئات المعدودة وادراج المساهمات المستخدم النهائي هو الخطوة المنطقية التالية. من خلال الجمع بين المبادئ الأساسية لمكافحة الخليوي مع خوارزمية الفرز والعد بعد التحليل الآلي، وهذا يزيد كثيرا من السهولة التي المقايسات الهجرة يمكن ان يتم بدون أي خسارة من الدقة. هي متاحة بحرية للتحميل مع تعليمات التثبيت من الإضافات: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine Fisher Scientific SH3002702 Cell culturing media 
Fetal bovian serum (FBS) GIBCO BRL P00015 Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) Software is designed to work with any cell line.
Trypsin GIBCO BRL 27250-018 Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
10 cm cell culture plates SARSTEDT 833902 Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size Costar 3422 ordered from Fisher Scientific 7200150 For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3 EMD Millipore and ordered from VWR 65044A, B, & C Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator Puritan Medical 806-WC
Single-edge industrial razor blades VWR 55411 - 055 Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain Fisher Scientific 12550A3 Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1 Fisher Scientific 12-545E Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope Leica Microsystems The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer Assistant Germany  0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope Olympus Corporation CKX41SF The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2
2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2 Thermo Scientific  Model: 1375 Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable 
Cell culture incubator Thermo Scientific  Model: 370 Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C 
ImageJ NIH Version 1.50e Minimum version required
Java Runtime Environment Oracle Version 1.8.0_66 Minimum version required

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
  2. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
  3. Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
  4. Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. Animal Cell Culture. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).
  5. Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
  6. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).
  7. Scott, W. N. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
  9. Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
  10. Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
  11. Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
  12. Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
  13. Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
  14. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/ (2007).
  15. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
  16. Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
  17. Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
  18. Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
  19. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
  20. Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , Available from: https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html (2016).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 117، وتحديد صورة، يماغيج، عد الخلايا الآلي، العد الجسيمات، والغزو، والهجرة، عدادة الكريات، يماغيج المساعد، ماكرو يماغيج
الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C.… More

O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins. J. Vis. Exp. (117), e54719, doi:10.3791/54719 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter