Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins

Abstract

Het National Institute of Health ImageJ is een krachtige, vrij beschikbare software voor beeldverwerking suite. ImageJ heeft uitgebreide deeltjes algoritmes die effectief kan worden gebruikt om verschillende biologische deeltjes tellen. Bij het tellen van een groot aantal van de cel monsters, de hemocytometer presenteert een knelpunt met betrekking tot de tijd. Ook het tellen van membranen van migratie / invasie assays met de ImageJ plugin Cell Counter, hoewel nauwkeurige, is bijzonder arbeidsintensief, subjectief en berucht voor het veroorzaken van pols pijn. Om aan deze behoefte te pakken, ontwikkelden we twee plugins in ImageJ voor de enige taak van geautomatiseerde hemocytometer (of bekende volume) en migratie / invasie cel tellen. Beide plugins berusten op het vermogen om hoge kwaliteit microfoto verkrijgen met minimale achtergrond. Ze zijn gemakkelijk te gebruiken en geoptimaliseerd voor snelle telling en analyse van grote aantallen individuen met ingebouwde analyse-instrumenten kalibratie tellingen helpen. Door de kernbeginsels Cell Counter met een geautomatiseerde telling algoritme en na telling analyse Dit verhoogt het gemak waarmee migratie assays zonder verlies aan nauwkeurigheid kan worden verwerkt.

Introduction

In vitro celtelling is een belangrijke basistechniek in uiteenlopende weefselkweek experimenten. Het nauwkeurig bepalen van het aantal cellen in een cultuur essentieel voor experimentele reproduceerbaarheid en standaardisatie ^1,2. Celtelling kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van een hemocytometer en met behulp van verschillende geautomatiseerde methoden, elk met hun eigen voordelen en nadelen ^3,4,5. De meeste geautomatiseerde werkwijzen voor celtelling behoren tot een van twee klassen, die de Coulter-principe gebruikt of flowcytometrie. Coulter tellers profiteer van cellen elektrische weerstand naar cel aantal en de grootte te bepalen. Ze zijn snel, nauwkeurig en goedkoper dan flowcytometers. Ze worden echter zelden gebruikt alleen celtelling vanwege de aanzienlijke kosten dan bij handmatige telling ^3. Stromingscytometers, daarentegen, zijn duur, maar ze hebben vele toepassingen zoals celtelling analyse van de vorm cellen, structure en het meten van de interne cel markers ^4,5. Machines die een van deze twee principes gebruiken zijn verkrijgbaar bij vele fabrikanten. Handmatige telling is betaalbaar maar tijdrovend en onder voorspanning terwijl de geautomatiseerde methoden hebben een fractie van de tijd die de handmatige telling maar het gebruik van dure machines ^6.

Andere veel voorkomende celcultuur procedures zijn in vitro cel beweeglijkheid assays, namelijk cel migratie en invasie ^7. Migratie en invasie assays worden vaak gebruikt om celmotiliteit en invasiviteit onderzoeken reactie op een chemotactische respons. Bovendien worden ze veel gebruikt embryonale ontwikkeling, differentiatie, ontstekingsreactie, en metastase van verschillende celtypen ^7-11 bestuderen. Cellen die gemigreerd of binnengedrongen door het poreuze membraan van een migratie assay kan worden gekwantificeerd op twee verschillende manieren. Ten eerste door het kleuren van de cellen met een fluorescerende kleurstof, dissociatie from het membraan en kwantificering met een fluorescerende reader ^12. Een beperking van deze methode is dat kwantificering geen record kan worden behouden de membranen en er geen mogelijkheid voor verdere analyse ^13. De tweede methode is kwantificering gemigreerde / binnengedrongen cellen worden gefixeerd en gekleurd met fluorescente kleurstof of vaker met cytologische kleurstoffen zoals kristalviolet, toluidine blauwe kleurstof of hematoxyline; dan cellen worden gekwantificeerd handmatig met behulp van omgekeerde microscopische beelden van deze membranen dat is een zeer tijdrovende taak ^12,13.

Om de nadelen van handmatige celtelling overwinnen, werden twee betrouwbare en nauwkeurige geautomatiseerde celtellers voor celconcentratie en de migratie assay ontwikkeld. Deze geautomatiseerde celgetalmeter algoritmes werden ontwikkeld voor ImageJ als een plugin met behulp van Oracle's Java programmeertaal. ImageJ is een publiek en veel gebruikte beeldverwerking tool ontwikkeld door het Nationaal Instituut voor HeaLTH (NIH) ^14,15; dus, het schrijven van deze plugins voor ImageJ vergemakkelijkt de integratie in de biologische gemeenschap.

Automatisering van de cel tellen zorgt voor een hoge doorvoersnelheid en reproduceerbaarheid in vergelijking met handmatige telling. Hoewel andere beschikbare software en plugins kunnen worden gebruikt om celconcentratie berekenen met beeldanalyse ^5,16,17, celconcentraties Calculator plug is snel en kan ook overweg verdunningen van cellen en behandelingen. Bovendien kunnen alle resultaten en berekeningen van deze twee tellers worden opgeslagen en uitgevoerd. De twee plugins in dit document beschreven zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van een fasecontrastmicroscoop voor live cell imaging en groot gezichtsveld (gehele membraan capture) beeldvorming voor migratieanalyse membranen met behulp van een dissectie scope. De plugins zijn vrij beschikbaar voor download met installatie-instructies uit: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. samengestelde microscoop en Camera Setup (Cell Concentration Calculator)

1. Verhoog de helderheid lamp volledig met het licht instelknop, over te schakelen naar de 4x objectief, en zorgen voor fase contrast filters worden geselecteerd.
   OPMERKING: omgekeerde fase contrast microscoop voor weefselkweek met een donkere achtergrond, bijvoorbeeld PhP fasecontrast, kan worden gebruikt volgens standaard procedures microscoop en camera.
2. Binnen de software van de microscoop, reeks opname-instellingen op de standaardwaarden.
   OPMERKING: Raadpleeg de microscoop handleiding om de locatie van deze instellingen te vinden.
   1. Stel, 'contrast' 'helderheid' en 'verzadiging' tot 100% en 'gamma' en 'winst' tot 1,0.
      OPMERKING: Afhankelijk van de software, 'helderheid' en 'contrast' kan standaard een waarde van 0% in plaats van 100%.
   2. Set beelden worden vastgelegd in zwart-wit met behulp van de hoogste resolutie beschike (1600 x 1200 pixels (px) of meer).
      LET OP: Een 'verzadiging' van 0% is voldoende als een zwart-wit instelling is niet beschikbaar.
3. Plaats een standaard hemocytometer op de microscoop podium en vastleggen van een beeld zoals weergegeven in (figuur 1A); dit is het 'imago Volume Calibration'. Pas blootstelling timing vereist.

2. Afbeelding Volume Calibration

1. Open ImageJ en in het menu Plugins, beginnen de Cell Concentratie Calculator (CCC) plugin, bijvoorbeeld, Plugins> Analyzer> 'Cell Concentratie Calculator'.
   1. Als de rechter-side 'Image Volume Calibration' panel niet zichtbaar is, klik dan op 'Calibrate' om het te laten zien.
2. In ImageJ, open het 'imago Volume Calibration' uit stap 1.3 ( 'Bestand'> 'Open') en in CCC klik op de 'Get Image Dimension' knop.
   LET OP: Dit zal in beide Image vullen Breedte enHoogte tekstvakken met de beeldresolutie in pixels automatisch.
3. In ImageJ, selecteert u de 'Straight Line Tool' naast de selectie gereedschap en trek een rechte lijn over de gehele lengte van de hemocytometer primaire (P) -square gedemonstreerd in (Figuur 1B) door te klikken en de cursor slepen.
   1. Druk op de 'M' toets om de resultaten venster met de rechte lijn metingen weer te geven. Typ de waarde van de lengte van de kolom in de 'P-square Length' tekstvak in CCC (Figuur 1B).
   2. Klik op de 'Bereken Image Volume "knop om de uitgang van het volume afbeelding in het Image Volume tekstvak. Anders, als het volume van het beeld reeds bekend Typ het volume nL in het beeldvolume tekstbox.
4. Klik op de knop 'Opslaan'.
   NB: De plugin is nu gekalibreerd.

3. Camera Exposure Calibration

1. Na cel oogsten voortellen via hemocytometer, belasting 10 pi van cellen in een kamer van het hemocytometer en plaats het op de microscoop podium.
2. Met dezelfde instellingen uit stap 1.2, stelt u de belichtingstijd, zodat de achtergrond lijnen van de hemocytometer verdwijnen.
   1. Stel scherp, zodat het inwendige van de cellen is donkerder dan de celmembraan, wat aangeeft richten binnen de centrale doorsnede van de cel en niet de polen.
   2. Verder aan te passen de belichting zodat de cellen niet worden overbelicht en lijken op die afgebeeld in (figuur 1C).
      LET OP: Licht zichtbaar hemocytometer lijnen aanvaardbaar zijn. Het wordt aanbevolen om deze instellingen op te slaan of op te nemen om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te behouden.

4. Image Acquisition

1. Voor elke cel monster, load 10 pi in beide kamers van het hemocytometer statistische gevolgtrekking vermogen ² verhogen. Plaats de hemocytometer op de microscooptafelvoor beeldvorming.
   OPMERKING: De resolutie en de vergroting van elk beeld moet hetzelfde zijn als het 'imago Volume Calibration' zijn. De plugin telt Alle foto's van elke geselecteerde map; houden beelden samen te tellen in dezelfde map.
   1. Als een bestandsnaam auto increment functie beschikbaar is, zet hem op en zorg ervoor dat elk beeld wordt niet getoond na het vastleggen om de doorvoer te verhogen.
      OPMERKING: Handmatig opslaan en sluiten van elk beeld drastisch zal vertragen het proces. Raadpleeg de microscoop de handleiding voor informatie over de beschikbaarheid van een auto-increment functie.
   2. Leg ten minste drie niet-overlappende beelden van het centrale gebied van de hemocytometer hoewel meer (5-10) wordt aanbevolen om de nauwkeurigheid te vergroten.
      OPMERKING: Vermijd de boven- en onderkant van de kamers als cellen de neiging te stijgen in dichtheid op beide locaties. Neem hetzelfde aantal beelden voor elke kamer. Dit is nodig voor een goede werking van de plug-in tijdens het tellen.

   5. Afbeelding Tellen en verdunningen

   1. In CCC, klikt u op 'Count Cells' en observeer het dialoogvenster Kies Directory box. Selecteer een map om te tellen.
   2. Let op de sample nummer invoerveld na het selecteren van een map. Voer het aantal beelden dat per kamer, dat wil zeggen, 4.1.2, en klik op 'Ok'. De plugin zal nu telt alle jpg, tiff en PNG-afbeeldingen in de geselecteerde map in alfabetische volgorde.
      LET OP: Als u op de 'Sample Viewer' knop zal de Sample Viewer venster met informatie over de getelde monsters brengen. Monster concentratie is de gemiddelde concentratie van alle opnamen die per kamer. Monsters met unitless concentraties kunnen worden toegevoegd aan deze lijst, zoals de toevoeging van een geneesmiddel of klein molecuul behandeling.
      1. Vertellen de cel monsters als de concentraties sterk variëren binnen tellingen van dezelfde monsters (hoofdstuk 4).
         OPMERKING: Om verdunningen te berekenen voor alle tHij telde-samples, CCC gebruikt automatisch de formule C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Gebruik het scenario van zaaien 15.000 cellen per 200 pl in 30 putjes van een 96-well plaat + 1 extra:
      1. Stel de tekstbox aan de rechterkant van de C2 label 15.000 en de concentratie volume tekstbox aan 200, veranderen de aangrenzende keuzelijst eenheid 'ul'.
         OPMERKING: De plug zal uiteindelijk bereken de concentratie cellen / ml.
      2. Zorg ervoor dat het volume keuzelijst heeft V2 geselecteerd (eindvolume) en in de tekstbox aan de rechterzijde in te voeren 6200 (200 pi x (30 + 1)), het selecteren van 'pi' in de volume-eenheid combo box.
   4. Klik op 'Bereken Verwatering' om de momenteel ingevoerde verdunning toe te voegen aan de linker keuzelijst.
      Opmerking: Voor elke verdunning toegevoegd worden opgelost voor elk monster en weergegeven in de boomstructuur naar rechts. Dubbelklik op elk item uit te breiden.
   5. klikken thij 'Save' knop onder de 'Sample Viewer' knop om te schrijven naar alle sample gegevens en verdunningen dienen.
   6. LET OP: Deze gegevens kunnen op elk moment worden hersteld door te klikken op 'Load' en het opgeslagen bestand te selecteren.

   6. Migratie en Invasion (Counter)

   1. Voer de migratie en invasie assays met behulp van de standaard methode Boyden-kamer ^7-9.
   2. Na de cellen zijn gemigreerd / binnengedrongen, verwijder voorzichtig de media binnen de insert door het omkeren en zachtjes tikken. Lont afstand overbodig papier gehecht aan de onderzijde van het membraan door het aanraken van de rand op de tissue.
      OPMERKING: het membraan zelf niet aan te raken om de handdoek, kan dit gehandeld cellen los te maken.
   3. Fix en vlekken cellen zoals gerapporteerd ^7-9 in een 24-well plaat die met elke rij met -500 pl van een andere oplossing, bijvoorbeeld Fixatief, Stain 1, 2 Stain en dubbel gedestilleerd water (DDH ₂ O). Vul een tweede plaat met 1x PBS to plaats de inserts in voor het snijden.
   4. Was de inserts door ze in putten gevuld met DDH ₂ O en vul de insert met DDH ₂ O. het water aftappen voordat weg zwabberen cellen door inversie.
   5. Gebruik een schone katoenen applicator niet-gemigreerde / un-binnengedrongen cellen van de bovenkant van het membraan zorg het membraan niet beschadigen. Grondig is rond de randen van het membraan.
   6. Snijd het membraan met behulp van een scheermes of een scalpel en zorgvuldig overdracht van de membraan (bottom-zijde naar boven) op een schoon glasplaatje.
   7. Voeg een kleine druppel bevestigingsoplossing onder en boven het membraan en bedekken met een dun dekglas.
      LET OP: Vermijd vangen bellen binnen de montage-oplossing om de nauwkeurigheid van de graven te behouden.

   7. Opheldering Reikwijdte en Camera Setup

   1. Schakel de lichtbron en de camera van de microscoop.
      OPMERKING: Raadpleeg de microscoop van de gebruikershandleiding voor gedetailleerde instructies.
   2. verstandhin software, reeks opname-instellingen van de microscoop naar de standaardwaarden.
      LET OP: Als een gemiddelde functie bestaat, wordt een waarde van vier aanbevolen. Dit is een goed compromis tussen de mate van middeling en beeldacquisitie tijd. Evenzo kan een geringe mate van verscherping afbeelding trouw te verhogen.
      1. Stel, 'contrast' 'helderheid' en 'verzadiging' tot 100% en 'gamma' en 'winst' tot 1,0.
         OPMERKING: Afhankelijk van de software, 'helderheid' en 'contrast' kan standaard een waarde van 0% in plaats van 100%.
      2. Stel display (real-time) en opnemen met een resolutie om hun maximale instellingen (1600 x 1200 px en 2592 x 1944 px, respectievelijk).
         LET OP: Beeldscherm resolutie kan worden aangepast als nodig als de refresh rate is te traag. Lagere resoluties zal het moeilijker maken om nauwkeurig te richten, maar verhoging van de refresh rate.
   3. Voor de fase van het ontleden scope, gebruik dan een stevige witte background; een zwarte of een glas achtergrond is onvoldoende.
   4. Gebruik bovenstaande fasen lichtbron, bij voorkeur twee flexibele LED rechts en links van het podium.
      LET OP: A hieronder stadium lichtbron de poriën binnen de migratie test membraan dat negatief voor de juistheid van de latere tellingen van invloed kunnen gaan branden.
   5. Plaats een voltooide migratie assay membraan slide op het podium. Op zoek naar de real-time beeld wordt weergegeven door de software bij, stel de vergroting met de zoomfunctie knop, zodat de randen van een enkel membraan zijn net binnen het gezichtsveld van de camera's.
      LET OP: Het plaatsen van de dia op een glasplaat overtop de witte achtergrond podium maakt het gemakkelijker om de glijbaan voor imaging manoeuvreren.
   6. Pas de lichtbron posities (7.6.1) en de blootstelling keer om zo dicht mogelijk te reproduceren het ideaalbeeld weergegeven in figuur 2A. Afhankelijk van de helderheid dient belichtingstijden van 5-60 ms volstaan.
      NOTITIE:Het doel is om een beeld te produceren met slechts achtergrondkleur mogelijk en gelijkmatig verlicht membraan zonder verlies van betrouwbaarheid, dwz overbelichting leidt tot een verlies van zichtbare cellen.
      1. Plaats de linker en rechter lichtbronnen onder een kleine hoek ten opzichte van de slede. Dit zal helpen bij het verwijderen achtergrond vlek en chromatische aberraties. Proberen om elke lichtbron direct tegenover de andere te houden.
         OPMERKING: Tijdens het manoeuvreren elke lichtbron in positie, zet de andere uit. Dit helpt om het gebied van verlichting centreren op het membraan zelf gemakkelijker en nauwkeuriger.
   7. Verwijder de afbeelding met behulp van een enkele druk op de knop in de microscoop software van de glijbaan en witbalans.
      NB: De microscoop is nu gekalibreerd. Opslaan als veel instellingen mogelijk te maken voor toekomstig gebruik en kennis te nemen van de lichtbron posities en intensiteit.

   8. Image Acquisition en Flatfield

   1. Binnen de software steltde vangst locatie van de map, en capture één afbeelding per membraan. Noem de beelden volgens de algemene sjabloon van: Naam - ###, bv Controle - 001.tif gaat, controle - 002.tif, Test drug - 001.tif gaat, en ga zo maar door.
      LET OP: Voor de beste beeldresultaten, sla het beeldbestand type als tiff ten opzichte van andere lossy formaten zoals jpeg.
      OPMERKING: Foto's die niet volgens de algemene sjabloon wordt nog geteld worden, maar zal niet worden onderworpen aan geautomatiseerde groeperen en plat fielding.
      1. Als Flatfield correctie gewenst is, voor elke dia te vinden een leeg gebied en neem een ​​blanco beeld na de naamgeving: Naam - Blank.
         OPMERKING: Een leeg is een gebied op de dia die geen membraan bevat en vertegenwoordigt de achtergrondverlichting.
      2. Onmiddellijk voor de beeldvorming, strijk elk membraan door druk uit te oefenen op het dekglaasje en verwijder zo veel gevangen bellen mogelijk te maken.
   2. In ImageJ, ga naar Plugins en open de TC plugin; bv, Plugins> Analyseren> & #39; Transwell Counter '.
   3. Binnen TC, klik op de 'Flatfield' knop en observeren het dialoogvenster Kies Directory box. Selecteer de map waarin het membraan beelden werden opgeslagen.
      NB: Alleen beelden opgeslagen met de algemene sjabloon bovenstaande wordt automatisch Flatfield gecorrigeerd en opgeslagen in een nieuwe map met de naam Flatfield binnen de gekozen map. Zie Figuur 2B voor een voorbeeld van flatfield gecorrigeerde beeld.

   9. Configuratie-instellingen

   1. Open een migratie test afbeelding membraan in ImageJ ( 'Bestand'> 'Open') en kies Afbeelding> Aanpassen> 'Kleurdrempel ...'. Let op de Threshold venster Color aan te passen welke kleuren worden uitgefilterd van het beeld.
      1. Aan de onderkant van het venster, zet Thresholding methode 'Shanbhag', Threshold kleur 'White', en Color ruimte om 'RGB' (rood groen blauw); Haal het vinkje weg Donkere achtergrond indien geselecteerd.
      2. Pas de topsliders door te klikken en de markeringen op 0 en de onderste schuifregelaars te slepen naar 255 (laat de bodem schuiven bij 255). Zorg ervoor dat het beeld is volledig wit.
   2. Pas de groene en rode top schuiven totdat alleen de kernen zichtbaar zijn.
      LET OP: De geselecteerde zal volledig variëren afhankelijk van de cel vlek gebruikte instellingen. Zie figuur 2C.
   3. In de TC plugin, het invoeren van de waarden van de RGB-top schuiven in 'RGB Threshold' tekstvakken de bijbehorende configuratie-instellingen. Klik op 'Toevoegen / Wijzigen' knop en overschrijven de configuratie.
      1. Laat de orde van grootte Tweede en Eerste waarden 1 - Infinity.
   4. Binnen het paneel Configuratie-instellingen, klikt u op 'Opslaan' om de instellingen te schrijven naar de harde schijf.

   10. Tellen Afbeeldingen en kalibratie

   1. Open de TC plugin (8.2) en klik op 'Count Folder' en observeer het dialoogvenster Kies Directory box. Selecteer de map te tellen eennd wachten tot het klaar is.
   2. Elk geteld-monster wordt automatisch toegevoegd aan de hoofdtabel. Key kolommen 'Count', 'kwaliteit' en 'kalibreren?'.
      LET OP: Het niet gekalibreerde Count is het aantal deeltjes per membraan binnen het gebied weergegeven in de kolom 'Area range'.
      LET OP: Kwaliteit varieert van ongeveer -0,8 tot 1,7; Q ≥ 0,5 is aanvaardbaar.
      1. Houd u een vinkje in het 'Calibrate?' kolom als een afbeelding is gemarkeerd voor de kalibratie op basis van haar gelijkenis met de ideale metrics.
         LET OP: zowel de kwaliteit en kalibratie kan erop wijzen dat de huidige instellingen zijn misschien niet voldoende. Als na een goede 'Color Thresholding' en 'Grootte Ranges' zijn geselecteerd en kalibratie wordt nog voorgesteld, inspectie van het origineel en telde afbeeldingen moeten de uiteindelijke determinant van een geldige telling.
   3. Selecteer alle monsters in de tabel gemarkeerde voor kalibratie.
      1. Klik met de rechtermuisknop in tHij tabel en selecteer Recount> 'Voorgestelde size'. Dit zal vertellen de beelden met een adviesprijs minimum deeltje gebied.
      2. Klik met de rechtermuisknop opnieuw en selecteer 'Toon Plot'. Let op de frequentie scatter plot van deeltje gebieden. Een ideaal beeld zal een grafiek die lijkt op een lang recht staart normale verdeling, dat wil zeggen, de bell curve. Zie figuur 3B.
      3. Stel de onderste Size Range, indien nodig, door het selecteren van de steekproef, rechts te klikken en te selecteren Recount> 'Handmatige instellingen'. Observeer het dialoogvenster handmatige instellingen. Voer de gewenste instellingen en klik op Tel om het beeld te vertellen met de nieuwe instellingen.
   4. Om de graven handmatig aan te passen, selecteert u de monsters, rechts te klikken op de tafel, en selecteer 'Open afbeelding met graven'. Let op de oorspronkelijke afbeelding met rode markeringen die elk deeltje geteld door de plugin.
      LET OP: Hertelling> 'Toon binair beeld geteld' kan handig zijn om te controleren hoe goed individuele cellen worden opgelost door de kleur drempelwaarde.
      1. Om een ​​telling toe te voegen, houdt 'Ctrl' en de linker muisknop. Observeer een marker op de cursor locatie die aan de monsters totale telling zal worden toegevoegd. Om een ​​markering te verwijderen, rechts op de afbeelding. De plugin zal de markering die het dichtst verwijderen om de cursor.
      2. Om een ​​groep van merkers te verwijderen, gebruikt u een selectie gereedschap in ImageJ om een ​​regio van belang (ROI) te selecteren. Terwijl 'Ctrl', met de rechtermuisknop op het beeld en alle markers in het ROI worden verwijderd. Let op het aantal cellen in de kolom 'Count'.

   11. Saving / Opening Resultaten en exporteren naar CSV

   1. In TC, gaat u naar de menubalk en klik op 'Bestand'> 'Opslaan resultaat'. Houd u aan de dialoog resultaten op te slaan in. Kies een naam en bestemming en klik op 'Opslaan'.
      1. Gebruik 'Bestand'> 'Open resultaten' om een ​​bestand met alle weergegeven in de hoofdtabel gegevens te laden, including de plot.
         LET OP: De resultaten file slaat de directories de beelden worden opgeslagen in Als de originele afbeeldingen worden verplaatst na het opslaan, het 'beeld Open met graven' 'Open oorspronkelijke beeld' en functies zal mislukken..
      2. Om de image map opnieuw in te stellen, selecteert u de monsters, met de rechtermuisknop op de tabel en selecteer 'Reset image map'. Let op het dialoogvenster Kies Directory box. Selecteer de nieuwe map en als de beelden bestaan, zullen de mappen worden gereset. Opnieuw de resultaten opslaan bestand.
   2. Om een ​​bestand komma's gescheiden waarden (CSV) op te slaan, in de menubalk naar 'Bestand'> 'Export naar .csv'. Dit levert een bestand met samples georganiseerd in groepen met de statistische gemiddelde tellen en standaardfout van het gemiddelde; de lay-out is ontworpen voor snelle grafische gemeen grafische programma's.
      OPMERKING: De statistische groepen zijn gebaseerd op de groepen afgelopen TC.
      1. Indien de monsters de algemene benaming sjabloon volgen, selecteert u de monsters gr te zijnouped, klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Auto groepering'. Dit voegt monsters met dezelfde 'Naam' tot dezelfde groep behoren. Met behulp van het voorbeeld Controle - 1, Controle - 2, Behandeling - 1, Behandeling - 2: beide regelaars zou tot de groep 'Control' en behandelingen worden toegevoegd aan de 'behandeling'.
      2. monsters handmatig toevoegen aan groepen door te dubbelklikken cel en typering van het monster 'Groep' in de groepsnaam. Selecteer de monsters worden toegevoegd aan deze groep, klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Toevoegen aan groep.

Representative Results

Cell Concentratie Calculator

Figuur 1 toont het totale proces van CCC kalibratie en telbare beeldacquisitie. Figuur 1A en 1B tonen de P-vierkant beeld kalibratie en berekening van de P-square lengte in pixels. CCC bepaalt celconcentratie in een bepaald volume met de formule:

Een hemocytometer P-vierkant een volume van 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) en gezien deze constante kan het totaalbeeld volume berekend na het converteren pixels mm. Figuur 1C is een ideale telbaar afbeelding met in-focus cellen die de kenmerkende fase verlichting en geen achtergrond hemocytometer diploma-uitreikingen. Ten slotte is de scatter plot van Figure 1D toont een sterk gecorreleerd, manuele versus automatische telling van cellen uit 57 foto's die over verschillende experimenten en celtypes waaronder HTR8, ES-2, en Swan71. Van de nota, de bovengrens van de concentratie was ~ 5.6 x 10 ⁶ cellen / ml met een lage kant van ~ 2,3 x 10 ³ cellen / ml (≈ 5 cellen per beeld). Gesuggereerd wordt dat als tellingen beneden 10-15 cellen per beeld, moet het monster in een kleiner volume gesuspendeerd statistisch toenemen.

Verwerven en verwerken van Beelden voor Migratie Assay Counter

Honderden migratieanalyse membranen werden belicht gedurende vele experimenten, die werden gezaaid met Human trofoblast cellijn HTR8, Swan71 of eierstokkanker cellijn ES-2. Van deze beelden, meerdere werden gekozen om een ​​aantal categorieën vertegenwoordigen van zeer slecht uitstekende basis van helderheid, helderheid en kleur van stained cellen en de mate van de achtergrondkleuring en ongewenste deeltjes (ruis). Gebruik van de afbeeldingen, de standaard RGB Threshold kleurinstellingen (≈ 150, 120, 0) werden bepaald (figuur 2C) en gebruikt als een basislijn bij alle verdere ontwikkelingen van het algoritme. Het doel was om de nucleaire kleur totale kleur ratio, maximaliseren, moeten de meeste gekleurde pixels binnen celkernen. Het bovenste paneel in Figuur 2A toont het ideale helderheid van het beeld, celkernen helderheid en kleur, en een te verwaarlozen achtergrondgeluiden. De helderheid van het beeld is het belangrijk om te zorgen voor een groot genoeg contrast tussen de cel en de achtergrond van een zwart-wit beeld binaire te produceren.

Als dit verschil niet is voldaan, kan grote of onvoorspelbare gebieden worden geteld door de ImageJ Analyseer Deeltjes functie; het best case scenario is een volledig witte achtergrond. In tegenstelling, het onderste paneel van Figuur 2A heeft extreme achtergrond kleuring en cellen die bijna niet te onderscheiden zijn. Membranen met deze mate van kleuring zal zeer waarschijnlijk leiden tot onbetrouwbare resultaten van de migratieanalyse teller.

In sommige gevallen, het verhogen van de helderheid van het ideale niveau kunnen image fidelity beïnvloeden door overbelichten het beeld. Evenzo kunnen hoge blootstelling of de helderheid systemische chromatische effecten met een progressieve of onregelmatige lichte en donkere gebieden te produceren. Met Flatfield correctie kunnen deze effecten worden geminimaliseerd of volledig verwijderd zoals getoond in Figuur 2B (boven vs. onderste paneel). Bovendien Flatfield correctie is een goede manier om de helderheid van meerdere membraan beelden egaliseren.

Kalibratie en validatie van Migratie Assay Counter

Om het ons te helpener beter bepalen of migratieanalyse membraan beelden aan de vereiste criteria voor nauwkeurige telling twee qualifiers ontworpen, beeld genoemd kwaliteit (Q) en kalibratie aanbeveling (CR). Belangrijk is dat beide qualifiers, zoals de naam al doet vermoeden CR, zijn slechts aanbevelingen en fungeren als gidsen in plaats van absolute rechters van het telbaarheid van elk beeld. Zowel Q en CR zijn gebaseerd op statistieken van de frequentie spreidingsdiagram deeltjes area (10.3.2). Ter vereenvoudiging kan een metriek worden geacht de verschillende vormen van de curve die het frequentiegrafiek. De gewenste metriek van een adequate Q (≥0.5) werd bepaald door de gevonden benaderde normale verdeling van celgrootte. Gewoonlijk cellen die onoplosbaar van elkaar, dan gekleurd of door bijzonder grote, verschuiven de skewedness een recht-tailed verdeling (figuur 3B). Als zodanig is het ideale metriek van een typische gekalibreerde beeld. Metde toevoeging van achtergrondgeluid, dit normaliter leidt tot een groot aantal deeltjes in het bereik 1-5 pixelgebied (Figuur 3A). Om de plot statistieken te berekenen, worden de data voorzien van tien Savitzky-Golay afgeronde curven van verschillende graden polynoom door Dr. Michael Thomas Flanagan Java Scientific Library (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Java/). In essentie maakt meerdere punten in het benaderende gebied van elk extremum. Door een reeks van cluster dichtheid kaarten van lokale minima en maxima, kan een algemeen beeld van het perceel statistieken worden berekend als een geordende lijst, dat wil zeggen, minimum, maximum, minimum / maximum overlap, ..., n ^th extremum. Kortom, de mate waarin de afgevlakte curves paste frequentiegegevens bepaalt hoe dicht opeengepakte de extrema punten. Hoe groter de clustering van niet-overlappende extrema, hoe groter Q wordt. In theorie, Q algehele helderheid van het beeld op basis van tHij verdeling van verschillende deeltjesgrootten.

Of de Booleaanse CR waar is of niet hangt af van de volgorde van extrema. Uit Figuur 3A, zou de geordende lijst minimum, maximum en een reeks overlappende extrema gebaseerd op de eigenschappen van de Savitzky-Golay curve. Aangezien Figuur 3A vertegenwoordigt een ongekalibreerd beeld, deze algemene sequentie van extrema vlaggen CR als waar, suggereren aan de gebruiker dat de beeldkalibratie nodig heeft. In de toekomst kan worden gezien dat in figuur 3B, zou deze lijst identiek, maar met uitzondering van het eerste minimum. Dus de statistieken van de ideale gekalibreerde en gekalibreerd beelden werden bepaald. Afwijkingen van deze statistieken zal in het algemeen vlag een beeld voor de kalibratie en vermindering van Q ≤ 0, zoals het geval is met de hoge achtergrondruis membraan in figuur 3C. Het toepassen van deze qualifiers om een ​​selectiebescheiden uitstekende beelden, met betrekking tot helderheid en achtergrondgeluid, is het duidelijk dat het geijkte tellingen veel dichter bij handmatige tellingen dan ongekalibreerd (1,9 ± 0,3% vs. 21,7% ± 2,9, respectievelijk Figuur 3D, E). Gezien de algemene hoge kwaliteit van de beelden gekozen voor analyse (ongekalibreerd = 0,71 ± 0,04; gemiddelde ± SE), was er een verwachte bescheiden stijging alleen in Q na kalibratie ( = 0.90 ± 0.04). Tezamen Q stelt de algemene telbaarheid potentieel van een beeld dat CR is een sterke indicator of kalibratie geslaagd is of niet.

Timing Vergelijkingen van beide Cell Concentratie Counter en Migratie Assay Counter

Figuur 4A vergelijkt CCC kalibratie tijd tussen Gebruiker 1 en 2. Zoals verwacht, User 1 aanzienlijk sneller dan de gebruiker 2 was, samen, waarbij gemiddeld ongeveer vijf minuten voor het CCC kalibratie. Voor een vergelijking hemocytometer handmatige telling en geautomatiseerde tarieven, de handmatige snelheid van tellen met een telapparaat vergeleken met de tijd die nodig was om negen afbeeldingen van de hemocytometer kamer nemen en geteld in CCC (figuur 4B). Een typische celconcentratie van 1,15 x 10 ⁶ cellen / ml werd gebruikt om timings vergelijken, waardoor gemiddeld 1x hogere doorvoer. Dit percentage is afhankelijk van het aantal cellen geladen in dehemocytometer als de totale tijd die nodig is om beelden vast te leggen en te verwerken is onafhankelijk van het aantal cellen.

Ten slotte, timings omvattend beeld overname van membranen, kwantificering binnen TC en handmatige aanpassingen van deze beelden werd gemeten in Figuur 4C. Met name 12 migratieanalyse membranen met lage celaantal (Totaal = 10.571 cellen) en aanzienlijke achtergrondkleuring en celresten werden gekozen om een ​​worst case scenario dat handmatige aanpassing celaantal vereisen vergemakkelijken. Dit komt tot uiting in figuur 4C aanpassing (Adj) kolom waarin het duurde een gemiddelde van 13 min om ongewenste tellingen te verwijderen en toe te voegen miste cellen. Ter vergelijking met handmatige telling werden optimale cel tellen tarieven bepaald met Cell Counter; hoge kwaliteit membraan beelden met hoge celdichtheid werden gebruikt (resultaten niet getoond). Dit leverde een gemiddelde maximale snelheid tussen Gebruiker 1 en 2 van 9,1 x 10 ³ cellen / h(~ 2,5 cellen / s). Door deze nummers, de membranen uit figuur 4C werden geteld 4,4x sneller TC dan verwacht bij maximale snelheid handleiding. De tijdwinst zijn direct afhankelijk van het aantal cellen en beeldkwaliteit, door het tellen van migratie membranen die vereist weinig of geen aanpassing en hoge celdichtheid (~ 7000 cellen / membraan), TC gegenereerde cel telt sneller dan de maximale snelheid handmatige 1,395x.

Figuur 1: Cell Concentratie Calculator. (A) Fase contrast microfoto van het centrale primaire kwadraat van de hemocytometer genomen bij 40x totale vergroting. Schaal bar vertegenwoordigt 200 urn. (B) Een bijgesneden versie van de afbeelding van (A) beeltenis van wat lengte te meten op de hemocytometer. De resultaten venster Lengte kolom werd gemarkeerd voor gemakkelijke identificatie. gele balk= 1 mm. (C) Een ideale microfoto van een hemocytometer met HTR8 cellen na microscoop en softwarekalibratie bij 40x totale vergroting met een resolutie van 1600 x 1200 px. Schaal bar = 200 micrometer. (D) Een spreidingsdiagram vergelijken manuele tellingen met behulp van de ImageJ plugin Cell Counter in vergelijking met geautomatiseerde tellingen van dezelfde beelden met behulp van Cell Concentratie Calculator. n = 57 beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Migratie assay tegen representatieve beelden. (A) Het bovenste paneel is een achtste deel van een totaal membraan voorstellende een ideaal beeld met minimale achtergrond; Schaal bar = 200 micrometer. Deonderste paneel bevat een beeld significant achtergrondkleuring dat de nauwkeurigheid van de automatische telling ernstig beïnvloedt; Schaal bar = 585 micrometer. (B) Het bovenste paneel is een donker beeld van goede kwaliteit, die onjuiste tellingen geproduceerd. Het onderste paneel is een telbaar versie van dezelfde afbeelding na flatfield correctie. Schaalbalken = 593 urn. (C) Het bovenste paneel is een ingezoomde weergave van een typische membraan. De sokkel van hetzelfde beeld, gevolgd door de gewenste drempelwaarde ImageJ kleur (RGB drempel = 150, 120, 0) intercellulaire achtergrond en de meerderheid van de zichtbaar gekleurd cytoplasma verwijderen. Alle beelden werden genomen bij 1.35X totale vergroting met een geijkte ontleden scope met een resolutie van 2592 x 1944 px vanuit meerdere migratie-assay invasies van HTR8 gekleurd met hematoxyline. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om viewa grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: kalibratie en validatie van de migratie test c ounter. (A) Typische voorbeeld van een niet-gekalibreerde afbeelding van hoge kwaliteit. (B) De gekalibreerde versie van (A) met behulp van de migratie-assay teller Recount> 'Voorgestelde size'. (C) Een typische frequentie plot van een lage beeldkwaliteit membraan met aanzienlijke achtergrond beits of totale duisternis. (D) Een spreidingsdiagram vergelijken manuele tellingen met behulp van de ImageJ plugin Cell Counter en migratie test teller geautomatiseerde telt. (E) een staafdiagram dat de gemiddelde procentuele verschil van gekalibreerde versus niet-gekalibreerde geautomatiseerde telt. Gegevens zijn gemiddelde ± SE. P <0,0001, n = 30, ongepaarde t-test met corre Welchctie. De dezelfde beelden werden gebruikt voor D en E. kalibratie van beide werd gedaan met de hertelling> 'Voorgestelde size' en Recount> 'Handmatige instellingen' verder te verfijnen de minimale grootte geteld en kleurdrempel. Geen handmatige telling aanpassingen werden gemaakt met behulp van de 'Open afbeelding met graven' functie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Timing van de Cel Concentratie Counter en migratie test teller gebruik. (A) Vergelijking van CCC kalibratietijden (stap 1 en 2) tussen Gebruiker 1 (CCC / TC expert) en Gebruiker 2 (CCC / TC beginnende). (B) handmatige celtelling tijden werden gemiddeld over vijf proeven en uitgedrukt in cellen geteld per min. automac tellingen werden berekend door het gemiddelde te keren tot negen beelden van een hemocytometer kamer vast te leggen en geteld met CCC. Celconcentratie werd gebruikt ~ 1,15 x 10 ⁶ cellen / ml. Gegevens zijn gemiddelde ± SE. n = 5. (C) Transwell Counter timings werden vergeleken in drie categorieën: overname (Acq; stap 7 en 8), kwantificering (Qnt; stappen 10.1-10.3.3 met behulp van standaard configuratie-instellingen), en handmatige aanpassing (Adj; stappen 10.4 -1.4.2). De membranen gekwantificeerd had een hoge achtergrondkleuring en puin om aanzienlijke handmatige instelling noodzakelijk voor nauwkeurige tellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Kritische Stappen, problemen oplossen, en beperkingen

De aard van geautomatiseerde rekenmethoden, bijzonder diegenen van deeltjesanalyse, vereist de wiskundige mogelijkheid om deze deeltjes te bepalen. Bijgevolg is de nauwkeurigheid van beide Cell Concentratie Calculator en migratie test teller is majorly afhankelijk van het trouw, dat wil zeggen, hoe nauw het opgenomen beeld lijkt op de cel monster of migratie assay membraan. Het is daarom van het grootste belang om microscoop en de bijbehorende software kalibratie protocollen zo goed mogelijk te volgen. Dit geldt ook voor het beperken van achtergrondgeluiden, het verminderen van ongewenste deeltjes, het vastleggen van helder en uniform in-focus beelden en opslaan in niet-lossy bestandsformaten zoals tiff. Dus zowel plugins zijn waarschijnlijk foutieve resultaten opleveren als deze eisen niet wordt voldaan. Het is daarom altijd een goede gewoonte om dubbel te controleren celtellingen om te bepalen of ze overeenkomen visuele verwachtingen toen in doubt. Als het inderdaad de resultaten niet overeenkomen, het vergelijken van de originele afbeelding met het binaire beeld kan helpen verhelderen het probleem (10,4 noot). In sommige gevallen kan donkerder migratieanalyse beelden grote gebieden die zijn geteld door pixelwaarden die binnen de grenswaarden kleur bevatten. In het algemeen, met behulp van beeld flatfield zal duisternis en blotchiness verwijderen en te voorkomen dat de meeste ongewenste telt als gevolg van chromatische onregelmatigheden.

Gezien deze mogelijke en relatief veel voorkomende problemen, is het belangrijk om standaardbeeld integriteit richtlijnen zoals die door de Nature Publishing Group en anderen ¹³ voorgesteld volgen. Om telt consistent te houden, moet een aanpassing aan één afbeelding ook van toepassing op alle andere. Dit omvat, maar is niet beperkt tot contrast, kleurverzadiging, helderheid, aanwinst, filters zoals middeling en scherpte en kleurfilters. Aanpassing van gamma moet worden vermeden omdat het een niet-lineaire verandering van pixelkleur zijn en zo kunnen beïnvloeden elke afbeelding verschillendely ^14. Bij de toepassing van een gemeenschappelijke blootstelling tijd om beelden met weinig cellen (<1000), kan dit leiden tot overbelichting en het verlies van het beeld trouw. Omgekeerd kan een membraan met duizenden cellen hogere blootstelling tijden nodig hebben om onderbelichting te voorkomen. Derhalve is het best practice om afbeeldingen aan te passen zo weinig mogelijk, en alleen wanneer dat nodig is, om de hoogste afbeelding fidelity haalbaar te houden.

afbeelding van een high fidelity Zelfs met, kunnen echte deeltje telt zwaar scheef door ongewenste deeltjes. Bij gebruik celconcentraties Calculator, indien een monster significante hoeveelheden celresten bevat, in het bijzonder gebieden overeenkomen met die van gesuspendeerde cellen, kan dit het resultaat scheef. In sommige gevallen kan dit geautomatiseerde analyse te voorkomen als het afval niet kan worden geminimaliseerd. Evenzo migratieanalyse membranen hoge achtergrondkleuring van dezelfde kleur bevat cellen of niet verwijderde cellen gekleurd aan de achterzijde van het membraan, geven waarschijnlijk inNauwkeurig resultaten. Deze ongewenste deeltjes kunnen normaal worden verwijderd in een paar manieren: het verhogen van de helderheid van het licht of blootstelling bron tijd, het wijzigen van de kleur drempelwaarde strenger, of handmatig verwijderd via 'Open afbeelding met tellingen' (10.4) te zijn. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol levert een optimale beeldkwaliteit vereist CCC en TC met nauwkeurigheid te handhaven. Echter, TC is in staat om het tellen van beelden van beduidend mindere kwaliteit, variërend vergrotingen of andere kleur vlekken, over het algemeen alleen die meer tijd besteed aan handmatige aanpassingen (10.4).

Tijdens het ijken een afbeelding migratieanalyse membraan is het belangrijk om rekening te houden met de resolutie van het beeld en de relatieve grootte van de cellen. Zoals eerder beschreven, Image Quality (Q) en kalibratie aanbeveling (CR) zijn afhankelijk frequentiegrafiek metrieken deeltjes area. De beelden geanalyseerd, elke cel neemt gemiddeld 1 / 100.000 van detotale beeldgebied. Bij gebruik van afbeeldingen van slechts miljoenen pixels met een kleine celgrootte verhouding, de variatie in celgrootte is ook klein. Dat wil zeggen, de variantie uitsluitend variëren 10-60 px. Maar als celoppervlak tot beeldgebiedverhouding groter wordt, de verspreiding van cel grootte toeneemt, waardoor de Kurtosis van de celgrootte normaalverdeling door verlaging van de frequentie van een bepaald gebied. Dit kan weer geautomatiseerde berekening van celoppervlak bemoeilijken of onmogelijk maken, omdat een bepaalde minimum gebied niet kan worden bepaald. Evenzo geldt dit ook voor beelden met weinig aantallen cellen wanneer de frequentie van verschillende celgroottes zeer laag zijn (<50). Dientengevolge, wanneer beelden te analyseren bij verschillende resoluties dan de in deze studie of verschillende distributies van celgrootte, handmatige identificatie van cellen groottebereik kan nodig zijn (10.3.3).

Betekenis en toekomstige richtingen

De ImageJ plugin Cell Counter werd aanvankelijk released in 2001 door Dr. Kurt De Vos en heeft gediend als een nietje voor handmatige celtelling aan deze dag. Om de trend van vrij beschikbare instrumenten voor de biologische gemeenschap blijven, Cell Concentratie Calculator en migratie test teller bieden de volgende stap in gratis tools om te helpen verhogen doorvoer en inter-experimentele reproduceerbaarheid van migratie assays. Het eindresultaat van migratie assays is sterk afhankelijk van het aantal cellen uitgezet. Ergo een betrouwbare celtelling is een noodzaak voor reproduceerbaarheid. Zo CCC biedt zowel verhoogde nauwkeurigheid door hogere statistische zekerheid van celconcentratie en kortere tijden tellen behoud celgezondheid.

Bovendien is het eindresultaat van beide plugins is een telling van het aantal cellen en niet een relatieve index, zoals fluorescentie. Diverse andere protocollen bestaan die maatregel fluorescentie na kleuring, maar deze methoden lijden aan een gebrek aan gevoeligheid ^13. Adobe's Photoshop beschikt over een eigen analyse van deeltjes tool maar het programma moeten worden aangeschaft voor gebruik en niet de post-telling analyse verkrijgbaar bij migratie assay teller ²⁰ aan te bieden. Beide plugins vertrouwen op het tellen van deeltjes eigenschap ImageJ en bijgevolg kan worden aangepast door de eindgebruiker door het bewerken van de macro gebruikt ImageJ. Dit biedt meer flexibiliteit voor de gebruiker om de reikwijdte van de plugins andere deeltjes breiden door nieuwe macro. De verdere ontwikkeling naar de breedte van telbare deeltjes te verhogen en op te nemen eindgebruiker bijdragen is de volgende logische stap. Door de basisprincipes Cell Counter met een geautomatiseerde telling algoritme en na telling analyse Dit verhoogt het gemak waarmee migratie assays zonder verlies aan nauwkeurigheid kan worden verwerkt. De plugins zijn vrij beschikbaar voor download met installatie-instructies uit: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required