Abstract
Национальный институт здравоохранения ImageJ является мощным, свободно доступны для обработки изображений пакет программного обеспечения. ImageJ имеет алгоритмы анализа частиц комплексные, которые могут быть эффективно использованы для подсчета различных биологических частиц. При подсчете большого числа образцов клеток, гемоцитометре представляет собой узкое место в отношении времени. Точно так же, подсчитывая мембраны от миграции / инвазии анализов с Счетчик клеток ImageJ плагин, хотя точные, исключительно трудоемкий, субъективная, и печально известный за причинение боли запястья. Для удовлетворения этой потребности, мы разработали два плагина в пределах ImageJ для единственной задачей автоматизированной гемоцитометра (или известного объема) и подсчета миграции / инвазии клеток. Оба плагина полагаться на способность приобретать высококачественные микрофотографии с минимальным фоном. Они просты в использовании и оптимизирован для быстрого подсчета и анализа больших размеров образцов со встроенными инструментами анализа, чтобы помочь калибровки графов. Объединив основной принципе годы Счетчик клеток с автоматизированной алгоритма подсчета и после подсчета анализа, это значительно увеличивает легкость, с которой миграционные анализы могут быть обработаны без потери точности.
Introduction
В пробирке подсчета клеток является важным основным методом в широком диапазоне экспериментов для культур тканей. Точного определения количества клеток в культуре , имеет важное значение для экспериментальной воспроизводимости и стандартизации в 1,2 раза . Подсчета клеток можно осуществить вручную с помощью гемоцитометра, а также с использованием различных автоматизированных методов, каждый со своими преимуществами и недостатками 3,4,5. Большинство автоматизированных методов подсчета клеток принадлежат к одному из двух классов, те, которые используют принцип Coulter или проточной цитометрии. счетчики Coulter воспользоваться клеток электрического сопротивления, чтобы определить количество и размер ячейки. Они быстрые, точные и дешевле, чем цитометров. Тем не менее, они редко используются только для подсчета клеток из - за их значительной стоимости по сравнению с ручным подсчетом 3. Поток цитометры, с другой стороны, являются дорогими, но они имеют много приложений, таких как подсчет клеток, анализ формы клеток, стructure и измерения внутренней ячейки маркеров 4,5. Машины, которые используют любой из этих двух принципов доступны от многих производителей. Ручной подсчет является доступным , но отнимает много времени и при условии смещения в то время как автоматизированные методы приходят с фракцией времени , необходимого для ручного подсчета , но с использованием дорогих машин 6.
Другие процедуры общей культивирования клеток в пробирке клеток моторики анализов, а именно, миграции клеток и вторжения 7. Миграция и инвазия анализы обычно используются для изучения подвижности клеток и инвазивности в ответ на хемотаксисного ответа. Кроме того, они широко используются для изучения эмбрионального развития, дифференцировки, воспалительную реакцию, и метастазирование нескольких типов клеток 7-11. Клетки, которые мигрировали или захватившие через пористую мембрану анализа миграции может быть определена количественно двумя различными способами. Во-первых, путем окрашивания клеток с флуоресцентным красителем, диссоциации сюдам мембрану, и количественно оценить с помощью флуоресцентного читателя 12. Ограничение этого метода количественного определения является то , что запись не может быть сохранена мембран и нет никакой возможности для дальнейшего анализа 13. Второй метод Количественное для мигрировали / захвачена клетки, которые будут фиксировали и окрашивали с флуоресцентным красителем или, чаще всего, с цитологическим красители, такие как кристаллический фиолетовый, толуидиновым синим красителем или гематоксилином; Затем клетки количественно вручную , используя перевернутые микроскопические изображения этих мембран , что является очень трудоемкой задачей 12,13.
Для того, чтобы преодолеть недостатки подсчета клеток вручную, были разработаны два надежных и точных автоматизированных счетчиков клеток для концентрации клеток и для анализа миграции. Эти автоматизированные алгоритмы счетчика клеток были разработаны для ImageJ как плагин с использованием языка программирования Java от Oracle. ImageJ является публичным и широко используемым инструментом для обработки изображений, разработанная Национальным институтом HeaLtH (NIH) 14,15; Таким образом, записывая эти плагины для ImageJ облегчает интеграцию в биологическом сообществе.
Автоматизация подсчета клеток обеспечивает высокую пропускную способность и воспроизводимость по сравнению с ручным подсчетом. Хотя другие доступное программное обеспечение и плагины могут быть использованы для расчета концентрации клеток на основе анализа изображений 5,16,17, Cell концентрационного Calculator плагин очень быстро и может также обрабатывать разведений клеток и лечения. Кроме того, все результаты и расчеты из этих двух счетчиков могут быть сохранены и экспортированы. Эти два плагина, описанные в этой статье, оптимизированы для использования контрастного микроскопа фазы для клеток живого изображения и большим полем зрения (полный цикл захвата мембраны) изображений для анализа миграции мембран за счет использования в рамках рассекает. Плагины свободно доступны для загрузки с инструкциями по установке от: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Соединение микроскопа и настройки фотокамеры (Cell Концентрация калькулятор)
- Увеличение яркости лампы в полном объеме с помощью ручки регулировки света, переключиться на линзы объектива 4X, а также обеспечить выбраны фильтры фазового контраста.
Примечание: Любой перевернутый фазовый контраст микроскопа для культуры тканей с темным фоном, например, фазовый контраст PhP, могут быть использованы в соответствии со стандартными процедурами микроскопа и камеры. - В программном обеспечении микроскопа, установить параметры съемки изображения значения по умолчанию.
Примечание: Обратитесь к руководству пользователя микроскопа, чтобы найти расположение этих настроек.- Установка параметров "яркости", "контрастности" и "насыщение" до 100% и "гамма" и "усиление" до 1,0.
Примечание: В зависимости от программного обеспечения, "яркости" и "контрастности" может по умолчанию на значение 0% вместо 100%. - Установить изображения, которые будут захвачены в черно-белом, используя высокое разрешение availablе (1600 х 1200 пикселей (пикселей) или больше).
ПРИМЕЧАНИЕ: "насыщение" 0% достаточно, если черно-белая установка недоступна.
- Установка параметров "яркости", "контрастности" и "насыщение" до 100% и "гамма" и "усиление" до 1,0.
- Поместите стандартную гемоцитометра на столик микроскопа и захватить изображение , как показано на (рис 1А); это "Калибровка изображения Volume '. Регулировка времени экспозиции по мере необходимости.
2. Изображение Объем калибровки
- Открыть ImageJ и из меню плагинов, запустите Cell Концентрационный Калькулятор (CCC) плагин, например, Плагины> Анализатор> 'Cell Концентрация Калькулятор ".
- Если панель с правой стороны 'Image Volume Calibration' не видно, нажмите на кнопку "Калибровка", чтобы показать его.
- В ImageJ, откройте "Volume Calibration изображение ', начиная с шага 1.3 (' Файл '>' Open ') и CCC нажмите на кнопку« Получить размеров изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет заполнить как изображения Ширина иВысота текстовых полей с разрешением изображения в пикселях автоматически. - В ImageJ, выберите 'Straight Line Tool "рядом с инструментами выделения и нарисовать прямую линию по всей длине гемоцитометр первичной (P) -Square показано в (Рисунок 1В), перетаскивая курсор.
- Нажмите клавишу 'M', чтобы отобразить окно результатов, содержащий измерения прямой линии. Введите значение из столбца Length в "P-квадрат длины" текстовое поле в КТС (рис 1B).
- Нажмите на кнопку "Рассчитать объемное изображение", чтобы выводить объемное изображение в изображение Volume текстового поля. С другой стороны, если объем изображения уже известно, введите объем в нл в образ тома текстового поля.
- Нажмите на кнопку "Сохранить".
Примечание: Плагин теперь откалиброван.
3. Калибровка камеры экспозиции
- После сбора клеток дляподсчета с помощью гемоцитометра, нагрузка 10 мкл клеток в камере гемоцитометра и поместите его на столик микроскопа.
- Используя те же параметры, начиная с шага 1.2, настройте время экспозиции, так что фоновые линии гемоцитометра исчезают.
- Отрегулируйте фокусировку так, чтобы внутренняя часть ячеек темнее, чем мембраны клетки, что указывает на фокус в центральном сечении клетки и не полюсах.
- Далее настроить экспозицию так, чтобы клетки не передержано и напоминают те , изображены на рис (1С).
Примечание: Слегка видимые гемоцитометра линии являются приемлемыми. Рекомендуется записать или сохранить эти настройки для поддержания точности и воспроизводимости.
4. Получение изображения
- Для каждого образца клеток, нагрузка 10 мкл в обеих палатах гемоцитометра увеличить мощность статистического вывода 2. Поместите гемоцитометра на столик микроскопадля работы с изображениями.
Примечание: Разрешение и увеличение каждого изображения должно быть таким же, как 'Volume калибровочное изображение ". Плагин подсчитывает все изображения любой выбранной папки; сохранять изображения, которые будут учитываться вместе в той же папке.- Если функция файла автоматическое приращение доступна, включите его и убедитесь, что каждое изображение не отображается после захвата для увеличения пропускной способности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ручное сохранение и закрытие каждого изображения будет значительно замедлить процесс. Обратитесь к руководству пользователя микроскопа для получения информации о наличии функцией автоматического приращения. - Захват по меньшей мере, три неперекрывающихся изображения центральной области гемоцитометра, хотя и более (5-10) рекомендуется для повышения точности.
Примечание: Избегайте как верхние и нижние участки камер, как клетки имеют тенденцию к увеличению плотности в обоих местах. Возьмем то же количество изображений для каждой камеры. Это необходимо для правильного функционирования подключаемого модуля во время подсчета голосов.
5. подсчитывая и Разведения Изображение
- В КТС, нажмите на кнопку "Count ячеек" и наблюдать диалоговое окно выбора каталога. Выберите папку для подсчета.
- Обратите внимание на поле ввода номера образца после выбора папки. Введите количество снимков , сделанных в камере, то есть 4.1.2, и нажмите кнопку "Ok". Плагин теперь будет считать все JPG, TIFF и PNG изображений в выбранной папке в алфавитном порядке.
ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии на кнопку "Пример просмотра" появится окно просмотра Пример отображения информации о считанных образцах. Концентрация образца средняя концентрация всех снимков, сделанных в камере. Образцы с безразмерными концентрации могут быть добавлены в этот список, например, добавление лекарственного средства или небольшого лечения молекулы.- Пересчет образцы клеток, если концентрации значительно варьироваться в пределах отсчетов одних и тех же образцов (раздел 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета разведений для всех тон считал-образцы, CCC автоматически использует формулу С 1 V 1 = C 2 V 2.
- Пересчет образцы клеток, если концентрации значительно варьироваться в пределах отсчетов одних и тех же образцов (раздел 4).
- Используйте сценарий высева 15000 клеток на 200 мкл в 30 лунки 96-луночного планшета + 1 дополнительная:
- Установите текстовое поле справа от метки С2 до 15000 и объемной концентрации текстового поля до 200, изменяя блок поле со списком, примыкающий к '' мкл.
Примечание: плагин будет в конечном счете вычислить концентрацию в клетках / мл. - Убедитесь, что поле со списком имеет объем V2, выбранный (конечный объем) и в текстовом поле справа введите 6200 (200 мкл х (30 + 1)), выбор '' мкл в поле со списком единице объема.
- Установите текстовое поле справа от метки С2 до 15000 и объемной концентрации текстового поля до 200, изменяя блок поле со списком, примыкающий к '' мкл.
- Нажмите на кнопку "Рассчитать Разбавление", чтобы добавить введенный в данный момент разбавление в левый нижний список.
Примечание: Для каждого разведения добавленного, будет решена для каждого образца и отображаются в дереве диаграмме справа. Двойной щелчок по каждой записи расширяться. - Щелчок тон кнопку "Сохранить" под кнопкой "Пример просмотра", чтобы записать в файл все образцы данных и разбавителей.
- Примечание: Эти данные могут быть восстановлены в любое время, нажав кнопку "Load" и выбрав сохраненный файл.
6. Миграция и Invasion (счетчик)
- Выполните миграцию и инвазию анализов с использованием стандартного метода Бойден камеры 7-9.
- После того, как клетки мигрировали / захвачена, осторожно удалите носитель внутри вставки путем переворачивания и осторожно постукивая. Фитиль от любых избыточных средств массовой информации присоединились к нижней части мембраны, касаясь края к бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к самой мембраны к полотенцу, это может сместить прилипшие клетки. - Закрепить и окрашивать клетки как сообщалось 7-9 в 24-луночный планшет с установленной каждой строки , содержащей ~ 500 мкл другого раствора, например, фиксирующим средством , морилку 1, морилку 2 и затем дважды дистиллированной водой (DDH 2 O). Заполните вторую пластину с 1x PBS то размещения вставок в перед нарезкой.
- Вымойте вставки, помещая их в лунки , заполненные DDH 2 O и заполнить вкладыш с DDH 2 O. Слейте воду перед моечные прочь клеток путем инверсии.
- Используйте чистую хлопчатобумажную аппликатор для удаления не-мигрировали / деинсталлировать вторглись клетки из верхней части мембраны, стараясь не повредить мембрану. Будь тщательное вокруг краев мембраны.
- Обрежьте мембрану с помощью бритвы или скальпель и осторожно перенести мембрану (снизу вверх) на чистую предметное стекло.
- Добавить небольшую каплю решение для монтажа под и на верхней стороне мембраны и покрывают тонким покровным.
Примечание: во избежание захвата пузырьков внутри монтажного раствора, чтобы сохранить точность подсчета.
7. Анатомический Scope и Camera Setup
- Включите источник света микроскопа и камеры.
Примечание: Обратитесь к руководству пользователя микроскопа подробные инструкции. - остроумиегин программного обеспечения, устанавливать параметры захвата изображения микроскопа значений по умолчанию.
Примечание: Если функция усреднения существует, то значение четырех рекомендуется. Это хороший компромисс между степенью усреднения и получения изображений времени. Точно так же, небольшая степень резкости может повысить точность воспроизведения изображения.- Установка параметров "яркости", "контрастности" и "насыщение" до 100% и "гамма" и "усиление" до 1,0.
Примечание: В зависимости от программного обеспечения, "яркости" и "контрастности" может по умолчанию на значение 0% вместо 100%. - Установите дисплей (в режиме реального времени) и разрешение захвата их максимальных настройках (1600 х 1200 пикселей и 2592 х 1,944 пикселей, соответственно).
Примечание: Разрешение дисплея можно регулировать по мере необходимости, если частота обновления слишком медленно. Более низкие резолюции сделает его более трудно сосредоточиться точно, но увеличить частоту обновления.
- Установка параметров "яркости", "контрастности" и "насыщение" до 100% и "гамма" и "усиление" до 1,0.
- Для стадии сферы рассекает, используйте твердый белый backgroунд; черный или стекло фон недостаточно.
- Используйте источник света выше стадии, предпочтительно от двух гибких светодиодных огней справа и слева от сцены.
ПРИМЕЧАНИЕ: ниже стадии источник света будет освещать поры внутри анализа миграции мембраны, которая может негативно повлиять на точность последующих отсчетов. - Поместите заполненную анализа миграции мембраны слайд на сцену. Глядя на реальном времени изображение, отображаемое с помощью программного обеспечения, регулировать увеличение с помощью ручки регулировки зума так, чтобы края одной мембраны только в поле зрения камеры.
Примечание: Размещение слайдов на стеклянной пластине возвышаться белый фон этап делает его легче маневрировать слайд для работы с изображениями. - Отрегулируйте положение источников света (7.6.1) и времени экспозиции воспроизвести настолько близко , насколько это возможно идеальный образ , изображенный на рисунке 2А. В зависимости от яркости, время воздействия 5-60 мс должно быть достаточно.
ЗАМЕТКА:Цель состоит в том, чтобы произвести изображение с минимальным цветом фона , как это возможно и равномерно освещенную мембрану без уменьшения точности изображения, то есть, передержка , ведущей к потере видимых ячеек.- Установите левый и правый источники света под небольшим углом по отношению к слайду. Это поможет удалить пятна и фон хроматических аберраций. Попытка держать каждый источник света прямо напротив другой.
ПРИМЕЧАНИЕ: При маневрировании каждый источник света в положение, поверните друга. Это помогает центрировать область освещения на мембрану сама более легко и точно.
- Установите левый и правый источники света под небольшим углом по отношению к слайду. Это поможет удалить пятна и фон хроматических аберраций. Попытка держать каждый источник света прямо напротив другой.
- Удалить слайд и баланс белого изображения с помощью нажатия одной кнопки в программном обеспечении микроскопа.
Примечание: микроскоп откалиброван. Сохранить как можно больше параметров, как это возможно для использования в будущем и принять к сведению позиции источника света и интенсивности.
8. Изображение Приобретение и Flatfield
- В программном обеспечении, установитерасположение папки захвата и захвата по одному изображению на мембрану. Назовите изображения , следуя общему шаблону: Название - ###, например, управление - 001.tif, контроль - 002.tif, испытания снадобья - 001.tif, и так далее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов изображения, сохранить тип файла изображения, как TIFF по сравнению с другими форматами с потерями, такие как JPEG.
Примечание: Изображения не следуя общей шаблон по-прежнему будет подсчитываются, но не будут подвергаться автоматизированной группировке и плоской Филдинг.- Если flatfield коррекции желательно, для каждого слайда найти пустую область и возьмите пустое изображение вслед за соглашением об именах: имя - Бланк.
Примечание: Заготовка представляет собой область на слайде, который не содержит мембрану, и представляет собой фоновую подсветку. - Непосредственно перед изображениями, распрямите каждую мембрану, применяя давление на покровное и удалить как можно больше пузырьков, захваченных, как это возможно.
- Если flatfield коррекции желательно, для каждого слайда найти пустую область и возьмите пустое изображение вслед за соглашением об именах: имя - Бланк.
- В ImageJ, перейдите к плагинам и открыть TC плагин; например, Плагины> Анализ> & #39; Transwell счетчик '.
- В рамках ТС, нажмите на кнопку "Flatfield" и наблюдать диалоговое окно выбора каталога. Выберите папку, в которой были сохранены изображений мембраны.
Примечание: только изображения, сохраненные с общим шаблоном выше будет автоматически flatfield корректируются и сохраняются в новой папке под названием Flatfield в выбранной папке. Смотрите рисунок 2B для примера flatfield исправленное изображение.
9. Параметры конфигурации
- Открыть анализа миграции мембраны изображение в ImageJ ( 'Файл'> 'Open') и выберите Image> Adjust> 'Color Threshold ...'. Обратите внимание на окно Порог цвета для настройки, какие цвета будут отфильтрованы изображения.
- В нижней части окна, установить метод Thresholding к 'Shanbhag', Порог цвета для «белых», и цветовое пространство RGB '' (красный зеленый синий); снимите флажок Темный фон, если выбран.
- Отрегулируйте верхнююползунки, перетаскивая маркеры 0, а нижние ползунки до 255 (оставить нижние ползунки на 255). Убедитесь в том, что изображение является полностью белым.
- Отрегулируйте зеленые и красные верхние ползунки, пока только ядра не видно.
Примечание: Установки, выбранные будет меняться полностью на пятно клеток используется. Смотрите рисунок 2C. - В ТС плагин, введите значения верхних ползунков RGB в «RGB порогового значения 'текстовые поля связанные с ним параметры конфигурации. Нажмите кнопку "Добавить / Изменить" и перезаписать конфигурацию.
- Оставьте диапазон значения нижнего и верхнего размера в 1 - бесконечность.
- В панели Параметры конфигурации, нажмите кнопку "Сохранить", чтобы записать установки на жесткий диск.
10. Подсчет изображения и калибровка
- Откройте плагин TC (8.2) и нажмите на кнопку "Count Folder" и наблюдать диалоговое окно выбора каталога. Выберите папку для насчиталай ждать его, чтобы закончить.
- Каждый подсчитывали-образец автоматически добавляется к основной таблице. Ключевые столбцы 'Count', 'Качество', и 'Калибруйте?'.
ПРИМЕЧАНИЕ: снимите откалиброван Count это число частиц на мембране в зоне отображается в столбце "Диапазон Area '.
Примечание: Качество варьируется приблизительно от -0,8 до 1,7; Q ≥ 0,5 является приемлемым.- Соблюдайте галочку в 'Calibrate? столбец, если изображение попадает для калибровки на основании его сходства с идеальными показателями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба качества и калибровки можно предположить, что текущие настройки, возможно, являются недостаточными. Если после того, как собственно 'Цвет Thresholding' и 'Размер Диапазоны' были выбраны и калибровка по-прежнему предлагается, осмотр оригинала и подсчитывали изображения должны быть окончательным определитель действительного подсчета голосов.
- Соблюдайте галочку в 'Calibrate? столбец, если изображение попадает для калибровки на основании его сходства с идеальными показателями.
- Выберите все образцы в таблице FLAGGED для калибровки.
- Щелкните правой кнопкой мыши в тон стол и выберите Пересчет> 'рекомендуемый размер. Это позволит пересчитать изображения с рекомендованной минимальной площади частиц.
- Щелкните правой кнопкой мыши снова и выберите "Показать Участок". Обратите внимание на частоту график рассеяния частиц областей. Идеальное изображение будет иметь график , напоминающее длинный правый хвост нормальное распределение, т.е. колоколообразной кривой. Смотрите рисунок 3B.
- Отрегулируйте нижний диапазон размеров, при необходимости, выбрав образец, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав Повторный подсчет> 'Ручная настройка ". Соблюдайте диалог ручной настройки. Введите нужные параметры и нажмите кнопку Count, чтобы пересчитать изображение с новыми настройками.
- Для регулировки счетчиков вручную, выберите образцы, щелкнув правой кнопкой мыши таблицу и выберите "Открыть изображение с помощью подсчета '. Обратите внимание на исходное изображение с красными маркерами, представляющими каждую частицу, подсчитанное плагин.
Примечание: Пересчет> 'Показывать подсчитывали бинарное изображение "может быть полезно, чтобы проверить, насколько хорошо яndividual клетки решаются с помощью цвета пороговым.- Чтобы добавить счетчик, удерживая клавишу "Ctrl" и щелкните левой кнопкой мыши. Соблюдайте маркер в позиции курсора, которая будет добавлена к образцам общее количество. Чтобы удалить маркер, щелкните правой кнопкой мыши на изображение. Плагин удалит маркер ближе всего к курсору.
- Чтобы удалить группу маркеров, используйте инструмент выбора в ImageJ для выбора интересующей области (ROI). Удерживая "Ctrl", щелкните правой кнопкой мыши на изображение и все маркеры внутри ROI будут удалены. Обратите внимание на номер ячейки в столбце "Количество".
11. Сохранение / Открытие результатов и Экспорт в CSV
- В ТК, перейдите к строке меню и нажмите на кнопку "Файл"> "Сохранить результаты". Обратите внимание на диалоговое окно Результаты Сохранить. Выберите имя отправителя и получателя и нажмите кнопку "Сохранить".
- Используйте 'Файл'> 'Открыть результаты ", чтобы загрузить файл, содержащий все данные, отображаемые в основной таблице, includinг сюжет.
Примечание: Файл результаты сохраняются каталоги изображений сохраняются в случае, если исходные изображения будут перемещены после сохранения, "Открыть исходное изображение 'и' открытое изображение с числом 'функций потерпит неудачу.. - Чтобы сбросить каталог изображений, выберите образцы, щелкните правой кнопкой мыши таблицу и выберите "Сбросить каталог образа". Обратите внимание на диалоговое окно Choose Directory. Выберите новую папку и, если существуют образы, каталоги будут сброшены. Повторно сохраните файл результатов.
- Используйте 'Файл'> 'Открыть результаты ", чтобы загрузить файл, содержащий все данные, отображаемые в основной таблице, includinг сюжет.
- Для сохранения файла в разделенные запятыми (CSV), в строке меню выберите "Файл"> "Экспорт в .csv». Это создает файл с образцами, организованных в статистических группах со средним значением подсчета и стандартная ошибка среднего значения; его макет предназначен для быстрого построения графиков в общих программах построения графиков.
Примечание: Статистические группы основаны на группах, созданных в рамках ТС.- Если образцы следуют общей шаблон именования, выберите образцы, чтобы быть грouped, щелкните правой кнопкой мыши и выберите 'Auto' группировки. Это добавляет образцы с тем же именем '' к той же группе. Используя пример управления - 1, контроль - 2, лечение - 1, лечение - 2: оба элемента управления будут добавлены в группу 'Control' и лечения для "лечения".
- Добавьте образцы вручную группы двойным щелчком сэмпла ячейки и набрав 'Group' в названии группы. Выберите образцы, которые будут добавлены в эту группу, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Добавить в группу".
- Если функция файла автоматическое приращение доступна, включите его и убедитесь, что каждое изображение не отображается после захвата для увеличения пропускной способности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Концентрация клеток Калькулятор
На рисунке 1 представлен общий процесс калибровки CCC и счетного получения изображения. На рисунке 1А и 1В изображают P-квадрат калибровки изображения и вычисление P-квадрат длины в пикселях. ССС определяет концентрацию клеток в заданном объеме по формуле:
P-квадрат гемоцитометра имеет объем 100 нл (1 мм х 1 мм х 0,1 мм) и с учетом этой константы, общий объем изображения можно рассчитать после преобразования пикселей в мм. Рисунок 1С является идеальным счетная изображение с в фокусе клетки показывая характерное освещение фазы и без фона гемоцитометра градуировки. И, наконец, разброс участок Figurе 1D показывает высокую корреляцию, руководство по сравнению автоматизированного подсчета клеток из 57 изображений , полученных с помощью различных экспериментов и типов клеток , включая HTR8, ES-2 и Swan71. Следует отметить, что верхний предел диапазона концентраций составляла ~ 5,6 х 10 6 клеток / мл с низким конце ~ 2,3 × 10 3 клеток / мл (≈ 5 клеток на изображение). Предполагается, что, если подсчеты ниже 10-15 клеток на изображении, выборка должна быть приостановлена в меньшем объеме, для увеличения статистической мощности.
Получение и обработка изображений для анализа миграции Счетчик
Сотни анализа миграции мембран были обследованы в течение многих экспериментов, каждый из которых высевали с линией человеческого трофобласта клеток HTR8, Swan71 или яичников линии раковых клеток ES-2. Из этих образов, множественный были выбраны, чтобы представить диапазон категорий от очень бедных отличного качества на основе яркости, четкости и цвета staineD-клетки, а также степень фонового окрашивания и нежелательных частиц (шум). С помощью этих изображений, настройки по умолчанию RGB Порог цвета (≈ 150, 120, 0) были определены (рис 2С) и используется в качестве основы для всех последующих разработок алгоритма. Цель состояла в том, чтобы максимизировать ядерный цвет к общему цвету, то есть, большинство цветных пикселей должно быть в пределах клеточных ядер. Верхняя панель на рисунке 2А изображает идеальную яркость изображения, ячейки ядер ясности и цвет, а также незначительный фоновый шум. Яркость изображения имеет важное значение для обеспечения есть достаточно большой контраст между клеткой и фоном для создания черно-белое бинарное изображение.
Если эта разница не выполняется, большие или непредсказуемые участки могут быть подсчитаны с помощью ImageJ анализировать частицы функцию; в лучшем случае это совершенно белый фон. В оппозиции, нижняя панель Fiфигура 2A имеет экстремальный фоновое окрашивание и клетки, которые практически неотличимы. Мембраны с такой степенью окрашивания, скорее всего, производят ненадежные результаты из счетчика анализа миграции.
В некоторых случаях, увеличивая яркость до идеального уровня может повлиять на точность воспроизведения изображения путем передержки изображения. Кроме того, высокое облучение или яркость может привести к системным хроматические эффекты с прогрессивной или нерегулярной светлых и темных областей. С помощью коррекции flatfield, эти эффекты могут быть сведены к минимуму или полностью удален , как показано на фигуре 2В (верхний по сравнению с нижней панелью). Кроме того, flatfield коррекция является хорошим способом для выравнивания яркости нескольких мембранных изображений.
Калибровка и проверка анализа миграции Счетчик
Для того, чтобы помочь намэр в определении лучше , если миграция анализа изображений мембраны отвечают требуемым критериям для точного подсчета, два отборочные были разработаны, качество изображения называется (Q), и калибровка рекомендация (CR). Важно отметить, что оба классификаторы, как следует из названия CR предлагает, только рекомендации и выступать в качестве гидов, а не абсолютных судей счетностью каждого изображения. Оба Q и CR основаны на показателях частотной диаграммы разброса площади частиц (10.3.2). Для упрощения, метрика можно рассматривать как различные формы кривой, составляющих частотный участок. Нужный метрика адекватной Q (≥0.5) определяли с помощью наблюдаемого приблизительной нормального распределения размера ячейки. Как правило, клетки, которые неразрешимые друг от друга, над пятнами, или просто особенно велико, сдвиг skewedness к правой хвостами нормального распределения (рис 3B). Таким образом, это идеальная метрика типичного калиброванного изображения. Сдобавление фонового шума, это обычно приводит к большому числу частиц в диапазоне от площади 1-5 пикселя (Рисунок 3А). Для вычисления метрик сюжета, данные оснащены десятью Савицкого-Голея сглаженными кривыми разной степени полиномиальных производимые Java научной библиотеки доктора Майкла Томаса Фланагана (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Ява/). По сути, это создает несколько точек в приблизительной области каждого экстремума. Через ряд кластерных плотности карт локальных минимумов и максимумов, общая картина метрик участка может быть вычислена как упорядоченный список, т.е. минимум, максимум, минимальная / максимальная перекрытия, ..., п - й экстремум. Короче говоря, степень, в которой сглаженные кривые соответствуют данные частоты определяет, насколько плотно экстремумы точки. Чем больше кластеризация Неперекрывающиеся экстремумов, тем больше Q становится. Теоретически, Q представляет собой общую четкость изображения на основе тон распределение различных размеров частиц.
Будет ли Логическое CR верно или нет , зависит от последовательности экстремумов. Из рисунка 3А, упорядоченный список был бы минимум, максимум, и последовательность перекрытия экстремумов на основании свойств кривой Савицкого-Голея. Поскольку Фигура 3А представляет собой Некалиброванный изображение, эту общую последовательность экстремумов флагов CR как истинные, предлагая пользователю , что изображение может потребоваться калибровка. Перемещение вперед, можно видеть , что из фиг.3В, этот список будет идентично , но с исключением первого минимума. Таким образом, были определены показатели идеальных некалиброванных и калиброванных изображений. Отклонения от этих показателей в целом будет помечать изображения для калибровки и уменьшить Q ≤ 0, например, в случае с высоким уровнем фоновых шумов мембраны на фиг.3С. Применяя эти отборочные к выборуот умеренных до отличных изображений, в отношении яркости и фонового шума, то ясно , что Калиброванные Количество изображений значительно ближе к ручному подсчетов , чем некалиброванное (1,9% ± 0,3 против 21,7% ± 2,9, соответственно; рис 3D, Е). С учетом общего высокого качества изображений, выбранных для анализа (некалиброванное 
= 0,71 ± 0,04; среднее значение ± SE), был ожидаемый умеренный рост только в Q после процесса калибровки ( = 0,90 ± 0,04). Взятые вместе, Q предполагает общий счетность потенциал изображения , тогда как CR является сильным индикатором того , является ли успешным или нет калибровки.
Сроки Сравнения обеих клеточных концентрационного Счетчик и анализа миграции Счетчик
Рисунок 4A сравнивает CCC время калибровки между пользователем 1 и 2. Как и ожидалось, пользователь 1 был значительно быстрее , чем пользователь 2, вместе, принимая в среднем около пяти минут для калибровки CCC. Для сравнения ручного подсчета гемоцитометра и автоматизированные ставки, ручная скорость подсчета с использованием Tally счетчик был по сравнению с временем, которое потребовалось , чтобы сделать девять изображений гемоцитометра камеры и подсчитывали в КТС (рис 4В). Типичная концентрация клеток 1,15 × 10 6 клеток / мл использовали для сравнения тайминги, что приводит к увеличению в среднем 1 раза в пропускной способности . Эта скорость будет варьироваться в зависимости от количества клеток, загруженных вгемоцитометр как общее время, необходимое для захвата изображений и обрабатывать их не зависит от числа клеток.
И, наконец, тайминги , включающие приобретение изображения мембран, количественной оценки в рамках ТС, а также ручной настройки этих изображений была измерена на фиг.4С. Следует отметить, что 12 анализа миграции мембраны с низким числом клеток (Всего = 10,571 клеток) и существенного фонового окрашивания и клеточных остатков были выбраны, чтобы облегчить наихудший сценарий, который потребует ручной регулировки количества клеток. Это находит свое отражение в регулировочного Рисунок 4C колонке (прил) , где она занимает в среднем 13 минут , чтобы удалить нежелательные счетчики и добавить пропущенные клетки. Для сравнения с ручного подсчета, оптимальные скорости подсчета клеток определяли с Счетчик клеток; были использованы высококачественные изображений мембраны с высокой плотностью клеток (результаты не показаны). Это давало среднюю максимальную скорость между пользователем 1 и 2 9.1 х 10 3 клеток / ч(~ 2,5 клеток / с). Используя эти цифры, мембраны из фигуры 4C были подсчитаны 4.4x быстрее с ТС , чем можно было бы ожидать при максимальной ручной скоростью. Экономия времени напрямую зависит от количества клеток и качества изображения, путем подсчета миграционных мембран, которые требуют мало или нет перестройки и высокой плотности клеток (~ 7000 клеток / мембраны), TC генерируется подсчет клеток 1,395x быстрее, чем максимальная ручной скоростью.
Рисунок 1: Сотовый Концентрация калькулятор. (А) Фазовый контраст микрофотография центральной первичной площади гемоцитометра взятой при 40 - кратном увеличении общего. Шкала бар представляет собой 200 мкм. (Б) обрезается версию изображения из (A) с изображением какой длины для измерения на гемоцитометра. В столбце Длина окна Результаты были выделены для легкой идентификации. Желтая полоса= 1 мм. (C) Идеальная микрофотография гемоцитометра , содержащей клетки HTR8 после того, как микроскоп и программное обеспечение для калибровки при 40х увеличении общего с разрешением 1600 х 1200 пикселей. Шкала бар = 200 мкм. (D) график рассеяния сравнивая ручной подсчет с использованием ImageJ плагин Счетчик клеток по сравнению с автоматизированных подсчетов одних и тех же изображений с помощью мобильного Концентрация калькулятор. п = 57 изображений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Анализ миграции счетчик репрезентативные изображения. (А) Верхняя панель представляет собой одну восьмую часть общей мембраны , изображающей идеальный образ с минимальным фоном; Шкала бар = 200 мкм.Нижняя панель содержит изображение со значительным фоне окрашивания, что серьезно влияет на точность автоматического подсчета; Шкала бар = 585 мкм. (В) Верхняя панель представляет собой темное изображение хорошего качества , которое производится неточные счетчики. Нижняя панель представляет собой счетное версию того же самого изображения после коррекции flatfield. Масштабные полоски = 593 мкм. (С) Верхняя панель представляет в увеличенном масштабе вид типичной мембраны. Нижняя панель и то же изображение с последующим желаемого ImageJ цвета пороговым (RGB Порог = 150, 120, 0), чтобы удалить межклеточную фон и большинство заметно окрашенного цитоплазме. Все снимки были сделаны при 1.35X общее увеличение с помощью калиброванного рассекает рамки при разрешении 2592 х 1,944 пикселей из нескольких анализа миграции нашествий HTR8 окрашивали гематоксилином. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы соперничаютва большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Калибровка и проверка анализа миграции ounter гр. (А) Типичный пример откалиброван изображение высокого качества. (B) Калиброванный версия (A) с помощью анализа миграции Повторный подсчет счетчика> '' рекомендуемый размер. (C) Типичная частота участок низкого качества изображения мембраны со значительным фоном пятна или общей темноте. (D) график рассеяния сравнивая ручной подсчет с использованием ImageJ плагин Счетчик клеток и анализа миграции счетчик автоматизированных рассчитывает. (Е) Гистограмма показывает среднюю разницу калибруется по сравнению с некалиброванных автоматизированных подсчитывает процентов. Данные представляют собой среднее ± SE. P <0,0001, п = 30, непарный т-тест с соответствую Уэлшафикция. Одни и те же изображения были использованы для D и E. Калибровка как это было сделано с Пересчитать> 'предлагаемый размер' и ПЕРЕСЧЕТ> 'Ручные настройки' для дальнейшего уточнения минимального размера подсчитываются и порог цвета. Нет ручной настройки подсчета не были сделаны с помощью "Открыть изображение с числом 'функции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Выбор времени Cell концентрационного счетчик и счетчик использования анализа миграции. (A) Сравнение калибровки CCC раз (шаги 1 и 2) между пользователем 1 (CCC / эксперт TC) и пользователя 2 (CCC / TC новичка). (B) Ручной раз для подсчета клеток усреднялись по пяти испытаний и экспрессируется в клетках , подсчитанных в минуту. автоматизацгр рассчитывает рассчитывались путем усреднения времен захвата девяти изображений гемоцитометра камеры и подсчитывали с CCC. Концентрация клеток использовали ~ 1,15 × 10 6 клеток / мл. Данные представляют собой среднее ± SE. п = 5. (C) Transwell Счетчик тайминги сравнивали более трех категорий: приобретение (ПОЛ; шаги 7 и 8), количественной оценки (Qnt; шаги 10.1-10.3.3 с использованием параметров конфигурации по умолчанию) и ручной настройки (прил; шаги 10.4 -1.4.2). Мембраны количественно имела высокую степень фонового окрашивания и мусора, для того, чтобы потребовать существенной ручной настройки для точного подсчета. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги, устранение неполадок и ограничения
Сама природа автоматизированных вычислительных методов, в частности, те из анализа частиц, требует математические способности определять эти частицы. Следовательно, точность обеих клеточных концентрационного Калькулятор и анализа миграции счетчика главно зависит от верности изображения, то есть, насколько близко захваченное изображение напоминает образец клеток или анализа миграции мембраны. Поэтому в первостепенное значение для последующего микроскопа и связанные с ним протоколы калибровки программного обеспечения как можно лучше. Это включает в себя ограничение фоновый шум, уменьшая нежелательные частицы, захватив яркие и равномерно в фокусе изображения и сохранение в не с потерями форматов файлов, таких как TIFF. Таким образом, оба плагина могут производить ошибочные результаты, если эти требования не будут выполнены. Поэтому всегда хорошая практика, чтобы подсчетов двойной проверки ячейки, чтобы определить, соответствуют ли они визуальные ожидания, когда в Doubт. Если в самом деле результаты не совпадают, сравнивая исходное изображение с бинарного изображения может помочь прояснить вопрос (10.4 примечание). В некоторых случаях более темные анализа миграции изображения могут содержать большие участки, которые были пересчитаны из-за значений пикселов, попадающих в пороговых пределах цвета. В общем, с помощью flatfield изображение будет удалить темноту и пятнистость и предотвратить большинство нежелательных счетчиков за счет хроматической неровностей.
С учетом этих возможных и относительно общих вопросов, важно следовать стандартным рекомендациям целостности образа , как предложенные издательской группы и другие Nature 13. Чтобы сохранить счетчики последовательно, любые корректировки к одному изображению, должны применяться одинаково ко всем остальным. Это включает, но не ограничивается контраст, насыщенность, яркость, коэффициент усиления, фильтры, такие как усреднение и резкость, а также цветных фильтров. Регулировка гамма следует избегать, поскольку она применяет нелинейную изменение цвета пикселя и таким образом может повлиять на каждое изображение другогоLY 14. При применении общего времени экспозиции до изображений с минимальным количеством ячеек (<1000), это может привести к передержке и потери качества изображения. С другой стороны, мембрана с тысячами клеток может потребоваться более длительное время экспозиции, чтобы предотвратить недодержку. Соответственно, лучшая практика для настройки изображения как можно меньше, и только тогда, когда это необходимо, чтобы поддерживать высокую точность изображения достижимой.
Даже при высокой точности изображения, истинные количества частиц может быть сильно искажены нежелательных частиц. При использовании сотового Концентрация калькулятор, если проба содержит значительные количества продуктов распада клеток, в частности, из областей, аналогичных тем, взвешенных клеток, это может исказить результат. В некоторых случаях это может предотвратить автоматизированный анализ, если мусор не может быть сведено к минимуму. Подобным же образом, анализа миграции мембраны, которые содержат высокие уровни фонового окрашивания аналогичного цвета для окрашенных клеток или клеток неудаленных с задней стороны мембраны, скорее всего, производят InТочность: результаты. Эти нежелательные частицы обычно могут быть удалены несколькими способами: увеличение яркости света источника или выдержки времени, изменяя цвет пороговую, чтобы быть более жесткими, или удалить вручную с помощью "Открыть изображения с числом '(10.4). Важно отметить, что этот протокол обеспечивает оптимальное качество изображения, необходимое для CCC и TC для поддержания точности. Тем не менее, TC способна подсчитывать изображения в значительно более низкого качества, различной увеличениях или различных цветовых пятен, как правило, только что требует больше времени, затрачиваемого на ручной настройки (10.4).
Во время калибровки любого анализа миграции мембраны изображения, важно учитывать разрешение изображения и относительный размер ячеек. Как было описано выше, качество изображения (Q) и рекомендация калибровки (CR) зависят от частоты сюжетных метрик области элементарных частиц. Из изображений анализируемых, каждая ячейка занимает в среднем 1/100000 изОбщая площадь изображения. При использовании изображений только миллионов пикселей с малым отношением размера ячейки, изменение размера ячейки также мала. То есть, дисперсия может находиться в пределах только от 10-60 пикселей. Но поскольку площадь ячейки отношение площади изображения к становится больше, распределение размера ячейки увеличивается, уменьшая Kurtosis размера ячейки нормального распределения путем уменьшения частоты любой данной области. Это, в свою очередь, может сделать автоматизированное вычисление площади ячейки более трудным или невозможным из-за определенной минимальной площади не может быть определена. Кроме того, это также относится и к изображениям с небольшим количеством ячеек, где частота различных размеров ячеек может быть очень низким (<50). В результате, при анализе изображений с различным разрешением, чем те, которые используются в данном исследовании, или различными распределениями размера ячейки, ручное определение диапазона размеров ячейки может потребоваться (10.3.3).
Значение и будущие направления
Плагин Счетчик клеток ImageJ был изначально ReleAsed в 2001 году д-ром Куртом Де Вос и служил в качестве основной для подсчета клеток вручную и по сей день. Для того, чтобы продолжить тенденцию свободно доступных инструментов для биологического сообщества, Cell Концентрация Калькулятор и анализа миграции счетчик предложить следующий шаг в бесплатных инструментов, чтобы помочь увеличить пропускную способность и между экспериментальной воспроизводимости миграции анализов. Конечным результатом миграции анализов сильно зависит от количества клеток, посеянных. Ergo надежный подсчет клеток является необходимостью для воспроизводимости. Таким образом, СТС предлагает как повышенную точность из-за более высокой статистической достоверностью концентрации клеток и более короткое время подсчета клеток, сохраняющих здоровье.
Кроме того, конечный результат обоих плагинов является подсчет количества клеток, а не относительный показатель, такой как флуоресценции. Различные другие протоколы существуют , что мера флуоресценции после окрашивания , но эти методы страдают от недостатка чувствительности 13. Компании Adobe Photoshop предлагает свой собственный анализ частиц тоол , но программа должна быть приобретена для использования и не предлагает анализа после подсчета доступного из анализа миграции счетчика 20. Оба плагина полагаться на функцию подсчета частиц от ImageJ и, следовательно, могут быть изменены конечным пользователем путем редактирования макросов, используемых ImageJ. Это обеспечивает большую гибкость для пользователя, чтобы расширить сферу плагинов к другим частицам путем создания новых макросов. Дальнейшее развитие, чтобы увеличить ширину счетных частиц и включать вклады конечных пользователей является следующим логическим шагом. Объединив основные принципы Счетчик клеток с автоматическим алгоритмом подсчета и после подсчета анализа, это значительно увеличивает легкость, с которой миграционные анализы могут быть обработаны без потери точности. Плагины свободно доступны для загрузки с инструкциями по установке от: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 - 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides - Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293 | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth - 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. Animal Cell Culture. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).
- Scott, W. N. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/ (2007).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J.
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , Available from: https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html (2016).
