כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

Abstract

המכון הלאומי ImageJ של בריאות היא חבילת תוכנת עיבוד תמונה רבת עוצמה, זמין באופן חופשי. ImageJ יש אלגוריתמי ניתוח חלקיקים מקיפים אשר ניתן להשתמש בם ביעילות למנות חלקיקים ביולוגיים שונים. כאשר כותבים מספרים גדולות של דגימות תאים, hemocytometer מציג צוואר בקבוק בכל הנוגע לזמן. כמו כן, ספירת ממברנות מבחני הגירה / פלישה עם דלפק תא תוסף ImageJ, למרות מדויק, הוא עבודה באופן יוצא מן הכלל אינטנסיבי, סובייקטיבי, לשמצה בשל גרימת כאב בפרקי יד. כדי לתת מענה לצורך זה, פיתחנו שני תוספים בתוך ImageJ למשימה הבלעדית של hemocytometer אוטומטיות (או נפח ידוע) ועוד היד נטויה תא הגירה / הפלישה. שני תוספים להסתמך על היכולת לרכוש micrographs באיכות גבוהה עם רקע מינימלי. הם קלים לשימוש אופטימיזציה עבור ספירה וניתוח מהיר של מדגמים גדולים עם כלי ניתוח מובנים כדי לעזור כיול של ספירות. על ידי שילוב של עיקרון הליבהים של מונה סלולארי עם ניתוח אלגוריתם ספירה אוטומטי שלאחר ספירה, זה מגדיל מאוד את הקלות שבה מבחני הגירה יכולים להיות מעובד ללא כל אובדן של דיוק.

Introduction

בשנת ספירת תאים במבחנה היא טכניקה בסיסית חשובה במגוון רחב של ניסויים בתרבית רקמה. קביעת מספר התאים במדויק בתרבות חיונית שחזור ניסיוני ^1,2 סטנדרטיזציה. ספירת תאים יכול להתבצע באופן ידני באמצעות hemocytometer וכן באמצעות מגוון של שיטות אוטומטיות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלהם ^3,4,5. רוב השיטות האוטומטיות ספירת תאים שייך לאחת משתי כיתות, אלה העושים שימוש עיקרון קולטר או cytometry זרימה. מונה קולטר לנצל התנגדות חשמלית תאים כדי לקבוע את מספר נייד וגודל. הם מהירים, מדויקים יותר זולים מאשר cytometers זרימה. עם זאת, הם משמשים לעתים נדירות עבור ספירת תאים רק בשל הניכר בעלויות שלהם לעומת ספירה ידנית ^3. זרימת cytometers, מצד השני, הם יקרים, אבל יש להם יישומים רבים כגון ספירת תאים, ניתוח של צורת התאים, structure ותא פנימי למדידת סמני ^4,5. מכונות המשתמשות אחד משני עקרונות אלה זמינות מיצרנים רבים. ספירה ידנית היא זולה אך זמן רב ובכפוף ההטיה בעוד בשיטות האוטומטיות לבוא עם חלק מן הזמן הדרוש הספירה הידנית אלא באמצעות ⁶ מכונות יקרות.

הליכים נפוצים תרבית תאים אחרים נמצאים מבחני תנועתיות תא במבחנה, כלומר, נדידת תאים ופלישה ^7. מבחני הגירה ופלישה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תנועתיות התא הפולשנות בתגובה לתגובה chemotactic. בנוסף, הם נמצאים בשימוש נרחב ללמוד התפתחות עוברית, בידול, תגובה דלקתית, וגרורות של סוגי תאים מרובים ^7-11. תאים שתהליך ההתפתחות שלהם היגרו או פלשו דרך הממברנה נקבובי של assay הגירה ניתן לכמת בשתי דרכים שונות. ראשית, על ידי צביעה את התאים עם צבע פלואורסצנטי, דיסוציאציה הלוך ושובמ הממברנה, וכימות באמצעות קורא פלורסנט ^12. הגבלה של שיטה זו של כימות היא שאף שיא ניתן להיעזר של ממברנות ואין אפשרות לניתוח נוסף ^13. שיטת הכימות השנייה עבור היגרו / פלש תא להיות קבוע מוכתם צבע פלואורסצנטי או יותר נפוץ, עם צבעי ציטולוגיה כגון סגול קריסטל, צבע כחול toluidine או hematoxylin; אז תאים לכמת באמצעות תמונות מיקרוסקופיות הפוכות ידני של הקרומים האלה אשר הוא משימה מאוד זמן רב ^12,13.

כדי להתגבר על החסרונות של ספירת תאים ידנית, שני מוני תא אוטומטיים אמינים ומדויקים עבור ריכוז תא עבור assay הגירה פותחו. אלגוריתמים נגד תא אוטומטי אלו פותחו עבור ImageJ בתור תוסף באמצעות שפת מחשב Java של אורקל. ImageJ הוא כלי עיבוד תמונה ציבורי הנפוצה ביותר לשימוש שפותח על ידי המכון הלאומי של חימוםLTH (NIH) ^14,15; וכך, כותב תוספים אלה עבור ImageJ מקל אינטגרציה קלה לתוך הקהילה הביולוגית.

אוטומציה של ספירת תאים מבטיחה תפוקת שחזור גבוהות לעומת ספירה ידנית. למרות תוכנות ותוספות אחרות זמינות שניתן להשתמש בם כדי לחשב ריכוז תא באמצעות ניתוח תמונת ^5,16,17, תוסף מחשבון ריכוז תא הוא מהיר והוא יכול גם להתמודד עם דילולים של תאים וטיפולים. יתר על כן, כל התוצאות והחישובים משני מונים אלה ניתן לשמור וייצא. שני תוספים המתואר במאמר זה מותאמים לשימוש מיקרוסקופ לעומת שלב הדמיה תא חי ושדה גדול של תצוגה (לכידת הממברנה כולה) הדמיה עבור ממברנות assay הגירה באמצעות היקף הניתוחים. את התוספים זמינים באופן חופשי להורדה עם הוראות התקנה מ: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. מיקרוסקופ מתחם והגדרת מצלמה (מחשבון ריכוז תא)

1. גברת בהירות הנורה עד מלא עם כפתור כוונון האור, לעבור העדשה האובייקטיבית 4X, ולהבטיח מסננים בניגוד השלב נבחרו.
   הערה: כל מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך עבור בתרבית רקמה עם רקע כהה, למשל, בניגוד שלב PHP, ניתן להשתמש בעקבות הליכים מיקרוסקופ מצלמה רגילות.
2. בתוך תוכנת מיקרוסקופ, להגדיר הגדרות לכידות תמונה לערכי ברירת מחדל.
   הערה: עיין במדריך למשתמש של מיקרוסקופ כדי למצוא את המיקום של הגדרות אלה.
   1. הגדר 'בהירות', 'בניגוד', ו 'רוויה' 100% ו 'גמא' ו 'רווח' ל -1.0.
      הערה: בהתאם לתוכנה, 'בהירות' ו 'לעומת' יכנס לכשל לערך של 0% במקום 100%.
   2. תמונות סט להיות בשבי שחור ולבן באמצעות availabl ברזולוציה הגבוהה ביותרדואר (1,600 x 1,200 פיקסלים (px) או יותר).
      הערה: א 'רוויה' של 0% די אם הגדרה שחורה ולבן אינה זמינה.
3. מניחים hemocytometer תקן לבמה מיקרוסקופ ו ללכוד תמונה כמתואר (איור 1 א); זהו דימוי כיול העצמה '. התאם עיתוי החשיפה כנדרש.

2. כיול נפח תמונה

1. ImageJ פתח מתפריט התוספים, הפעל את המחשבון הנייד ריכוז תוסף (CCC), למשל, תוספים> 'מחשבון ריכוז תא' Analyzer>.
   1. אם בלוח כיול נפח התמונה 'בצד הימני אינו גלוי, לחץ על' כייל 'להראות את זה.
2. ב ImageJ, לפתוח את "תמונת כיול העצמה 'משלב 1.3 (' קובץ '>' פתח ') ו בלחיצת CCC על הכפתור" קבל ממד תמונה ".
   הערה: זה ימלא בשני תמונת רוחבתיבות טקסט גובה עם רזולוציית התמונה בפיקסלים אוטומטית.
3. ב ImageJ, לבחור את "כלי הקו הישר" ליד כלי הבחירה למתוח קו ישר על פני אורך של בפריימריז hemocytometer (P) -square הפגינו (איור 1B) על ידי לחיצה וגרירה של הסמן.
   1. דחוף את המפתח 'M' כדי להציג את חלון תוצאות המכיל את מידות קו הישרות. הקלד את הערך מהעמודה אורך לתיבת הטקסט 'P-מרובע אורך' ב CCC (איור 1B).
   2. הקש על 'עצמת תמונת חישוב' כדי פלט נפח התמונה לתוך הטקסט נפח תמונה. לחלופין, אם הנפח של התמונה כבר ידוע, הקלד את נפח nL לתיבת הטקסט נפח תמונה.
4. לחץ על הלחצן 'שמור'.
   הערה: התוסף כעת מכויל.

כיול חשיפת מצלמה 3.

1. קצירת התא בעקבות עבורלספור באמצעות hemocytometer, עומס 10 μL של תאים לתוך תא של hemocytometer ומניחים אותו על הבמה מיקרוסקופ.
2. שימוש בהגדרות אותו משלב 1.2, להתאים את זמן החשיפה כך שקווי רקע hemocytometer להיעלם.
   1. התאם את המיקוד כך שהחלק הפנימי של התאים הוא כהה יותר קרום התא, דבר מצביע מוקד בתוך החתך המרכזי של התא ולא הקטבים.
   2. בהמשך להתאים את החשיפה כך התאים אינם מחשיפת יתר ומזכירים אלה מתוארים (איור 1 ג).
      הערה: נראה מעט קווי hemocytometer כשרים. מומלץ לשמור או להקליט את ההגדרות האלה כדי לשמור על דיוק ואת שחזור.

4. Image Acquisition

1. עבור כל דגימת תא, עומס 10 μL לשני התאים של hemocytometer להגדיל הסקה סטטיסטית כוח ^2. מניחים את hemocytometer על הבמה מיקרוסקופהדמיה.
   הערה: רזולוציית והגדלה של כל תמונה חייבת להיות זהה "תמונת כיול העצמה '. התוסף סופר את כל התמונות של כל תיקייה שנבחרה; לשמור תמונות ייספרו יחד באותה תיקייה.
   1. אם פונקצית תוספת האוטומטית filename זמינה, להפעיל אותו ולוודא כל תמונה אינה מוצגת לאחר הלכידה כדי להגדיל את התפוקה.
      הערה: באופן ידני חיסכון וסגירת כל תמונה תאט באופן דרסטי את התהליך. עיין במדריך למשתמש של מיקרוסקופ לקבלת מידע על הזמינות של פונקציית Auto-increment.
   2. לכידת לפחות שלוש תמונות שאינן חופפות של אזור המרכז של hemocytometer אף יותר (5-10) מומלץ להגדיל את הדיוק.
      הערה: הימנע הוא בשורה העליונה והן באזורים התחתונים של התאים כתאים נוטים להגדיל בצפיפות בשני המקומות. קח את אותו מספר של תמונות עבור כל תא. זה נדרש לתפקוד תקין של התוסף במהלך לספור.

   ספירת תמונה 5. דילולים

   1. ב CCC, לחץ על 'ספירת תאים' ולבחון את תיבת הדו-שיח בחר Directory. בחר תיקייה להיספר.
   2. שים בתיבת קלט מספר המדגם לאחר בחירת תיקייה. הזן את מספר התמונות שצולמו לכל תא, כלומר, 4.1.2, ולחץ על 'אישור'. התוסף עכשיו אספור כל jpg, tiff, ותמונות png בתיקייה הנבחרת ב בסדר אלפביתי.
      הערה: הלחיצה על הכפתור 'מציג לדוגמא' תביא את החלון מציג לדוגמא מוצגת מידע על הדגימות נספרו. ריכוז מדגם הוא הריכוז הממוצע של כל התמונות שצולמו לכל תא. דוגמאות עם ריכוזי unitless ניתן להוסיף לרשימה זו, כגון תוספת של תרופה או טיפול מולקולה קטנה.
      1. תספור מחדש את דגימות תאים אם ריכוזיים להשתנות באופן משמעותי בתוך סעיפים של אותו הדגימות (סעיף 4).
         הערה: כדי לחשב דילולים עבור כל tהוא חישב ומצא דגימות, CCC משתמש אוטומטית את הנוסחה C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. השתמש תרחיש של זריעת 15,000 תאים לכל 200 μL לתוך 30 בארות של צלחת 96-היטב + 1 נוסף:
      1. הגדר את הטקסט מימין תווית C2 15,000 ואת טקסט נפח הריכוז ל -200, שינוי יחידת התיבה המשולבת הסמוכה 'μL'.
         הערה: התוסף בסופו של דבר יהיה לחשב את ריכוז תאים / מ"ל.
      2. ודא שהתיבה משולבת נפח בחרה V2 (נפח סופי) ו בתיבת הטקסט מימין הזן 6200 (200 x μL (30 + 1)), בחירת 'μL' בתיבה משולבת ביחידת נפח.
   4. לחץ על 'חישוב דילול' להוסיף את הדילול נכנס כרגע לתיבת הרשימה השמאלית התחתונה.
      הערה: עבור כל דילול הוסיף, ייפתר עבור כל דגימה ומוצגת בתרשים העץ ימינה. לחץ לחיצה כפולה על כל ערך להתרחב.
   5. לחיצת tהוא הלחצן 'שמורה' מתחת ללחצן 'מציג לדוגמא' כתיבה לקובץ כל נתוני הדילולים מדגמים.
   6. הערה: נתונים אלה ניתן לשחזר בכל עת באמצעות לחיצה על 'טען' ובחירת הקובץ שנשמר.

   6. הגירה הפלישה (מונה)

   1. בצע את מבחני הגירה ופלישה בשיטה הקאמרית בוידן תקן ^7-9.
   2. לאחר תאים הגרו / פלש, להסיר בזהירות את התקשורת בתוך הכנס על ידי היפוך קשה בעדינות. וויק משם כל תקשורת עודפת דבקה התחתונה של הקרום על ידי נגיעה בקצה אל מגבת נייר.
      הערה: אל תיגע הממברנה עצמה אל המגבת, זה עשוי לסלק תאים דבק.
   3. תיקון ו להכתים את התאים כפי שדווח ^7-9 בצלחת 24 גם להגדיר עם כל שורה המכילה ~ 500 μl של פתרון אחר, למשל, מקבע, הכתם 1, כתם 2, ומים מזוקקים פעמיים (DDH ₂ O). מלאו צלחת שנייה עם t 1x PBSo למקם מחדיר ב לפני החיתוך.
   4. שטוף את מוסיף ידי הצבת לתוך בארות מלאות DDH ₂ O ולמלא את הכנס עם DDH ₂ O. מסנן את המים לפני בניקוי משם תאים על ידי היפוך.
   5. השתמש מוליך כותנה נקי כדי להסיר תאים בלתי הגר / un-פלש מהחלק העליון של נזהר הקרום שלא לפגוע הקרום. להיות יסודי מסביב לקצוות של הממברנה.
   6. חותכים את הממברנה באמצעות תער או אזמל ובזהירות להעביר את הממברנה (מלמטה למעלה בצד) על גבי זכוכית נושאת נקייה.
   7. הוסף טיפה קטנה של פתרון הרכבה מתחת ועל גבי הקרום ומכסה להחליק כיסוי דק.
      הערה: הימנע השמנת בועות בתוך הפתרון גובר לשמר דיוק של הספירה.

   7. ביתור הגדרת היקף ומצלמה

   1. הפעל את המקור ומצלמת האור של המיקרוסקופ.
      הערה: עיין במדריך למשתמש של מיקרוסקופ לקבלת הוראות מפורטות.
   2. שְׁנִינוּתין ההגדרות לכידות תמונת התוכנה, הגדר של מיקרוסקופ לערכי ברירת מחדל.
      הערה: אם פונקצית מיצוע קיים, בשווי של ארבעה מומלץ. זוהי פשרה טובה בין מידת זמן רכישת מיצוע ותמונה. כמו כן, במידה קטנה של חידוד עלולה להגביר נאמנות תמונה.
      1. הגדר 'בהירות', 'בניגוד', ו 'רוויה' 100% ו 'גמא' ו 'רווח' ל -1.0.
         הערה: בהתאם לתוכנה, 'בהירות' ו 'לעומת' יכנס לכשל לערך של 0% במקום 100%.
      2. תצוגת גדר (בזמן אמת) ללכוד ברזולוציה להגדרות המקסימלית שלהם (1,600 x 1,200 פיקסלים ו 2,592 x 1,944 פיקסלים, בהתאמה).
         הערה: רזולוציית תצוגה ניתנת תותאם כנדרש אם קצב הרענון הוא איטי מדי. ברזולוציות נמוכות יותר יעשה את זה יותר קשה להתמקד באופן מדויק אך להגדיל את קצב הרענון.
   3. עבור השלב של היקף הניתוחים, להשתמש backgro לבן מוצקund; רקע שחור או זכוכית אינו מספיק.
   4. השתמש מקור האור מעל הבמה, רצוי משתי נורות LED גמישות כדי ימינה ושמאלה של הבמה.
      הערה: א 'להלן שלבית מקור אור שיאיר את הנקבוביות המצויות בממברנה assay ההגירה אשר עשוי להשפיע לרעה על הדיוק של הספירה הבאה.
   5. מקום שקופיות הממברנה assay הגירה השלימו לבמה. כאשר מסתכלים על התמונה בזמן אמת המוצגת על-ידי התוכנה, להתאים את ההגדלה עם כפתור כוונון הזום כך שהקצוות של קרום יחיד הם רק בתוך השדה של המצלמה.
      הערה: הצבת את השקופית על צלחת זכוכית overtop הבמה רקע לבן מקלה לתמרן את השקופית הדמיה.
   6. התאם את עמדות מקור האור (7.6.1) וזמני חשיפה לשחזר במדויק ככל האפשר את הדימוי האידיאלי מתואר איור 2 א. בהתאם הבהירות, פעמי חשיפה של 5-60 MS צריכות להספיק.
      הערה:המטרה היא לייצר תמונה עם צבע רקע כמה שפחות וקרומי מוארים באופן אחיד מבלי להקטין נאמנות תמונה, כלומר, חשיפת יתר שמוביל לאובדן של תאים גלויים.
      1. מקם את מקורות אור על ימין ועל שמאל על קרוב משפחה נמוך זוית לשקופית. זה יעזור להסיר את כתם רקע עיוותים כרומטיים. נסה לשמור על כל מקור אור ישירות מול השני.
         הערה: תוך כדי תמרון כל מקור אור למקומו, סובב את האחר. זה עוזר כדי למרכז את האזור של תאורה על הממברנה עצמה יותר בקלות ובמדויק.
   7. להסיר את השקופית ואיזון לבן את התמונה באמצעות לחיצה על לחצן יחיד בתוכנת מיקרוסקופ.
      הערה: המיקרוסקופ עכשיו מכויל. להציל כמה שיותר הגדרות ככל האפשר לשימוש עתידי ושימו לב לעמדות מקור אור ועוצמה.

   תמונה 8. רכישת Flatfield

   1. בתוך התוכנה, גדרמיקום תיקיית לכידה, ו לכיד תמונה אחת לכל הממברנה. שם את התמונות הבאות התבנית הכללית של: שם - ###, למשל, בקרה - 001.tif, בקרה - 002.tif, התרופה מבחן - 001.tif, וכן הלאה.
      הערה: לקבלת התוצאות התמונה הטובה ביותר, להציל את סוג קובץ תמונה כמו TIFF על פורמטים lossy אחרים כגון jpeg.
      הערה: תמונות לא בעקבות התבנית הכללית עדיין תיספר אך לא תהיה כפוף קיבוץ אוטומטי פילדינג שטוח.
      1. אם תיקון flatfield הוא רצוי, עבור כל שקופית למצוא שטח ריק ולקחת תמונה בלנק בעקבות אמנת השמות: שם - בלנק.
         הערה: ריק הוא אזור בשקופית שאינו מכיל קרום ומייצג את התאורה ברקע.
      2. מיד לפני הדמיה, מרדדים כל הממברנה על ידי הפעלת לחץ על coverslip ולהסיר כמו בועות רבות ככל האפשר לכודים.
   2. ב ImageJ, ללכת תוספים ולפתוח את תוסף TC; למשל, תוספים> נתח> & #39; מונה Transwell '.
   3. בתוך TC, ללחוץ על כפתור 'Flatfield' ולבחון את תיבת הדו-שיח בחר Directory. בחר את התיקייה בה את התמונות קרום ניצלו.
      הערה: רק תמונות שנשמרו עם התבנית הכללית הנ"ל תהיה אוטומטית flatfield תקנו ונשמרה תיקייה חדשה בשם Flatfield בתוך התיקייה שנבחרה. ראה תרשים 2B עבור דוגמה של תמונה תיקן flatfield.

   9. הגדרות תצורה

   1. פתח תמונה קרום assay ההגירה ImageJ ( 'קובץ'> 'פתח') ותמונה בחר> התאם> 'סף צבע ... ". שים את חלון סף הצבע כדי להתאים את מה צבעים יסונן של התמונה.
      1. בתחתית החלון, שיטת קביעת ערכי סף מוגדר 'Shanbhag', סף צבע 'לבן', ו מרחב הצבע כדי "RGB" (כחול ירוק אדום); רקע כהה לבטל את הסימון אם נבחר.
      2. התאם העליוןמחוונים על ידי לחיצה וגרירה של הסמנים ל -0 ואת המחוונים התחתונים עד 255 (לעזוב את המחוונים התחתונים ב 255). להבטיח שהתמונה לבנה מלא.
   2. התאם את המחוונים העליונים הירוקים ואדום עד שרק הגרעינים גלויים.
      הערה: ההגדרות שנבחרו ישתנה לחלוטין על כתם התא בשימוש. ראה איור 2 ג.
   3. ב plugin TC, קלט את ערכיה של מחווני RGB העליונים לתוך קופסות 'RGB הסף' הגדרות התצורה הקשורות. לחץ על 'הוספה / שינוי' כפתור להחליף את התצורה.
      1. השאירו את ערכי גודל טווח התחתון והעליון של 1 - אינפיניטי.
   4. בתוך בלוח הגדרות תצורה, לחץ על 'שמור' כדי לכתוב את ההגדרות על הכונן הקשיח.

   10. תמונות ספירת כיול

   1. פתח את תוסף TC (8.2) ולחץ על 'הרוזן תיקייה "ולבחון את תיבת הדו-שיח בחר Directory. בחר את התיקייה להיספרnd להמתין עד לסיומו.
   2. כל מנה-מדגם מתווסף אוטומטית בטבלה הראשית. עמודות מפתח הן "רוזן", 'איכות', ו 'כייל?'.
      הערה: הרוזן בלתי מכויל הוא מספר חלקיקים לכל קרום בתוך האזור מוצג בעמודה 'טווח פינה'.
      הערה: איכות נעה בין כ -0.8 ל -1.7; Q ≥ 0.5 מקובל.
      1. שים לב סימן ביקורת ב 'הכיול?' טור אם תמונה סומנה כיול מבוסס על הדמיון שלה המדדים האידיאליים.
         הערה: גם איכות כיול עשויה לרמוז על ההגדרות הנוכחיות הן אולי לא מספיק. אם לאחר ראוי "צבע ערכי סף 'ו' גודל הטווחים 'נבחר וכיול עדיין הציע, בדיקה של המקור ומנת תמונה צריכה להיות גורם הקובע הסופי של ספירה תקפה.
   3. בחר את כל הדגימות בטבלה המסומנת לכיול.
      1. קליק ימני tהוא שולחן ויסופר בחר> 'מוצע גודל'. זה יספר את התמונות עם פינת חלקיקי מינימום שהציעה.
      2. קליק ימני שוב ובחר "מגרש צג '. שים את עלילת פיזור תדר של אזורי חלקיקים. דימוי אידיאלי יצטרך גרף דומה התפלגות נורמלית עם זנב ימני ארוכה, כלומר, עקומת הפעמון. ראה איור 3B.
      3. התאם את טווח הגודל הנמוך, אם נדרש, על ידי בחירת המדגם, לחיצה ימנית, ובחירת ספירה חוזרת> 'הגדרות ידניות'. שים את הדו-שיח הגדרות הידני. הזן את ההגדרות הרצויות ולחץ על רוזן לספר את התמונה עם ההגדרות החדשות.
   4. כדי להתאים את הספירה באופן ידני, בחר את הדוגמות, לחיצה ימנית על השולחן, ובחר 'פתח את תמונה עם ספירה'. שים את התמונה המקורית עם סמנים אדומים המייצגים כל חלקיק נספר על ידי התוסף.
      הערה: ספירה חוזרת> 'הצג נספר תמונה בינארית "יכול להיות שימושי כדי לבדוק עד כמה אניתאי ndividual שמתבצעים נפתרו על ידי thresholding הצבע.
      1. כדי להוסיף ספירה, החזק את מקש CTRL ועל שמאל לחץ. שים לב סמן במיקום הסמן כי יתווסף הדגימות במניין כולל. כדי להסיר סמן, קליק ימני על התמונה. התוסף יסיר את הסמן קרוב הסמן.
      2. כדי להסיר קבוצה של סמנים, להשתמש בכלי הבחירה ImageJ כדי לבחור אזור של (ROI) ריבית. תוך כדי לחיצה על 'Ctrl', שמור את התמונה ואת כל הסמנים בתוך ROI יוסרו. שים את המספר הסלולרי בעמודה 'הרוזן'.

   11. שמירה / פתיחת תוצאות יצוא ל- CSV

   1. ב TC, עבור אל שורת התפריטים ולחץ על 'קובץ'> 'שמור תוצאות ". שים את תיבת הדו-שיח תוצאות השמורה. בחר שם יעד ולחץ על 'שמור'.
      1. השתמש ב 'קובץ'> 'פתח את התוצאות' כדי לטעון קובץ המכיל את כל הנתונים המוצגים בטבלה הראשית, including העלילה.
         הערה: קובץ התוצאות שומרת את ספריות התמונות נשמרות אם התמונות המקוריות מועברות לאחר לחסוך, "פתח המקורי 'ו' פתח את תמונה עם הספירה 'פונקציות תיכשלנה..
      2. כדי לאפס את ספריית התמונה, בחר את הדוגמות, קליק ימני על השולחן, ובחר 'איפוס בספריית תמונה'. שים את תיבת הדו-שיח בחר Directory. בחר התיקייה החדשה ואם התמונות להתקיים, הספריות תאופסנה. Re-להציל את קובץ התוצאות.
   2. כדי לשמור עם ערכים מופרדים בפסיקים (CSV), בשורת התפריטים ללכת 'קובץ'> 'ייצוא ל- csv'. זה מייצר קובץ עם דוגמאות מאורגנות בקבוצות סטטיסטיות עם הממוצע לספור ואת סטיית התקן של הממוצע; הפריסה שלה מיועדת גרפים מהירים בתוכניות גרפים משותפות.
      הערה: הקבוצות הסטטיסטיות מבוססות על הקבוצות שנוצרות בתוך TC.
      1. אם הדגימות בצעו את תבנית שמות הכללית, בחר את הדגימות להיות גרouped, קליק ימני ובחר "קיבוץ אוטומטי '. זה מוסיף דגימות עם אותו "שם" באותו ענף משנה. שימוש בשלט למשל - 1, שליטה - 2, טיפול - 1, טיפול - 2: גם שולט יתווסף לקבוצה 'הבקרה' והטיפולים כדי "טיפול".
      2. להוסיף דוגמאות ידניות לקבוצות על ידי לחיצה כפולה על תא 'הקבוצה' של המדגם והקליד את שם הקבוצה. בחרו את הדגימות להתווסף לקבוצה זו, קליק ימני ובחר "הוסף קבוצה".

Representative Results

מחשבון ריכוז התא

איור 1 מציג את התהליך הכולל של כיול CCC ורכישת תמונת ספיר. איור 1 א ו -1 B לתאר את תמונת כיול מרובע P וחישוב אורך P-מרובע בפיקסלים. CCC קובע ריכוז התאים בנפח נתון לפי הנוסחה:

P-מרובע של hemocytometer יש נפח של 100 nL (1 מ"מ x 1 מ"מ x 0.1 מ"מ) ובהתחשב זה קבוע, נפח התמונה הכוללת ניתן לחשב לאחר המרת פיקסלים מ"מ. תרשים 1C הוא דימוי ספיר אידיאלי עם פוקוס תאי הצגת תאורת שלב המאפיין ואין סיום לימודי רקע hemocytometer. לבסוף, עלילת הפיזור של Figurדואר 1D מראה ידנית, מתאם גבוה לעומת ספירה אוטומטית של תאים 57 תמונות שצולמו על ניסויים שונים סוגי תאים כולל HTR8, ES-2, ו Swan71. מן הראוי לציין כי, בטווח של ריכוז העליון היה ~ 5.6 x 10 ⁶ תאים / מ"ל עם בקצה הנמוך של ~ 2.3 x 10 ³ תאים / מ"ל (≈ 5 תאים לכל תמונה). הוא הציע כי אם ספירה נמצאת מתחת 10-15 תאים לכל תמונה, המדגם צריך להיות מושעה בנפח קטן יותר כדי להגדיל את הכח סטטיסטי.

רכישה ועיבוד של תמונות למדיניות נגד Assay גירה

מאות ממברנות assay הגירה הם צלמו על ניסויים רבים, שכולן היו זורעים עם שורת תאי trophoblast אדם HTR8, Swan71, או שורת תאי סרטן שחלות ES-2. דימויים אלה, מספר נבחרו לייצג מגוון של קטגוריות עניות מאוד איכות מעולה המבוססת על בהירות, בהירות וצבע staineתאי ד, ואת מידת מכתים רקע וחלקיקים רצויים (רעש). שימוש בתמונות אלה, את גדרות צבע סף RGB ברירת המחדל (≈ 150, 120, 0) נקבעו (איור 2 ג) ומשמשות כבסיס בכל ההתפתחויות הבאות של האלגוריתם. המטרה הייתה למקסם את הצבע הגרעיני יחס צבע כולל, כלומר, הרוב המכריע של פיקסלים צבעוניים צריך להיות בתוך גרעין תא. הפאנל העליון באיור 2A מתאר את בהירות התמונה האידיאלית, בהירות גרעין התא ואת צבע, רעש רקע זניח. הבהירות של התמונה חשובה לוודא שיש ניגוד מספיק גדול בין התא ורקע לייצר תמונה בינארית שחורה ולבן.

אם ההבדל הזה אינו מתקיים, שטחים גדולים או בלתי צפויים ניתן לספור על ידי ImageJ ניתוח פונקצית חלקיקים; במקרה הטוב הוא רקע לבן לחלוטין. באופוזיציה, הפאנל התחתון של Fiיש איור 2A מכתים רקע קיצוני ותאיים כי הם כמעט שאין להבחין בו. ממברנות עם התואר הזה של מכתים הסביר להניח להניב תוצאות לא אמינות מדלפק assay הגירה.

בחלק ממקרים, הגדלת בהירות לרמה האידיאלית עשויה להשפיע נאמנות תמונה על ידי overexposing התמונה. באופן דומה, חשיפה גבוהה או בהירות מביאה להשפעות כרומטית מערכתיות עם אור מתקדם או לא סדיר ואזורים כהים. עם תיקון flatfield, ההשפעות הללו ניתן למזער או להסיר לחלוטין כפי שמוצג באיור 2B (הפאנל התחתון לעומת העליון). יתר על כן, תיקון flatfield הוא דרך טובה להשוות את הבהירות של תמונות קרום מרובות.

כיול ואימות של מונה Assay הגירה

כדי לסייע לנואה בבטר לקבוע אם תמונות הממברנה assay ההגירה עומדות בקריטריונים הנדרשים ספירה מדויקת, שתי המוקדמים נועדו, איכות תמונה שנקראה (Q), והמלצת כיול (CR). חשוב לציין, הן מוקדמות, כמו CR שהשם מרמז, הן המלצות בלבד ולפעול כמדריכים ולא שופטים מוחלטים של סְפִירוּת של כל תמונה. שני ש ו CR מבוססים על המדדים של עלילת פיזור תדר של אזור חלקיקים (10.3.2). פישוט, יכול להיחשב מדד כמו צורות השונות של העקומה שמרכיבות את עלילת התדר. המטריקה הרצוי של Q נאותה (≥0.5) נקבע על ידי ההתפלגות הנורמלית המשוערת הנצפית של גודל תא. בדרך כלל, תאי הנמצאים פתירים אחד מהשני, יתר מוכתם, או סתם גדול במיוחד, להעביר את skewedness כדי התפלגות נורמלית עם זנב ימנית (איור 3 ב). ככזה, זה הוא המדד האידיאלי של תמונה מכוילת טיפוסית. עםהתוספת של רעשי רקע, זה בדרך כלל מוביל למספר רב של חלקיקים בטווח 1-5 פיקסל באזור (איור 3 א). על מנת לחשב את ערכי העלילה, הנתונים הנם מצוידים עם עשר עקומות מוחלקות Savitzky-Golay של שוני מעלות פולינום המיוצרות על ידי הספרייה המדעית Java של ד"ר מייקל תומאס פלאנגן (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga / java /). בעיקרו של דבר, זה יוצר מספר רב של נקודות באזור המשוער בכל קיצון. באמצעות סדרה של מפות אשכול צפיפות של ומינימום מקומי מקסימום, תמונה כללית של מדדי העלילה ניתן לחשב כמו ברשימה מסודרת, כלומר, מינימום, מקסימום, מינימום / מקסימום חפיפה, ..., n ^th קיצון. בקיצור, את המידה שבה עקומה המוחלק להתאים את הנתונים התדירים קובעים כמה חזק גדשו את קיצון נקודות. ההתקבצות הגבוהה מבינה קיצון שאינו חופף, ש יותר הופכת. בתיאוריה, Q מייצג בהירות התמונה הכוללת מבוסס על tהוא חלוקת חלקיקים בגדלים ברורים.

האם CR בוליאני נכון או לא תלוי ברצף של קיצון. מתוך איור 3A, רשימת ההורה תהיה מינימום, מקסימום, ואת רצף של חופפי קיצון על בסיס התכונות של עקומת Savitzky-Golay. מאז האיור 3A מייצג דימוי לא מכויל, רצף כללי זו של דגלי קיצון CR כאמת, דבר המצביע למשתמש שהתמונה עשויה להזדקק כיול. במבט קדימה, ניתן לראות כי מתוך איור 3B, רשימה זו תהיה זהה אבל עם הדרת המינימום הראשון. לכן את המדדים של תמונות לא מכוילות מכוילות אידיאליות נקבעו. סטיות בין ערכים אלו יהיה בדרך כלל לסמן תמונה לכיול ולהפחית Q ≤ 0, כמו במקרה עם קרום רעש רקע גבוה באיור 3C. החלה מוקדמת אלה מבחר של צנועה תמונות מצוינות, לגבי בהירות רעשי רקע, ברור כי ספירת תמונה מכוילת קרובה משמעותי ספירת כפות מאשר לא מכויל (1.9% ± 0.3 לעומת 21.7% ± 2.9, בהתאמה; האיור 3D, E). בהתחשב באיכות גבוהה הכוללת של תמונות שנבחרו לניתוח (לא מכוילת = 0.71 ± 0.04; ± מתכוון SE), חל גידול צנוע צפוי רק ב Q הבא כיול ( = 0.90 ± 0.04). יחדיו, Q מציע פוטנציאל סְפִירוּת הכללי של תמונה ואילו CR הוא אינדיקציה חזקה של אם הכיול הוא מוצלח או לא.

עיתוי השוואות של שני מונה ריכוז התא מונה Assay הגירה

הין-page = "1"> שני חוקרים (משתמש 1 ו 2 User) שמשו כדי לבדוק את ההשוואות המהירות בין שיטות ידניות ואוטומטיות. היו שני חוקרי ניסיון רב עם ספירת תאים ואת assay ההגירה אבל משתמש 1 חווה את השימוש של שני CCC ו- TC תוך 2 User היה לעקוב אחרי הוראות בכתב. איור 4 א משווה זמן כיול CCC בין משתמש 1 ו -2 כצפוי, משתמש 1 היה מהיר יותר באופן משמעותי מאשר 2 User, יחד, לוקח על עצמו כ ממוצעת חמש דקות לכיול CCC. על מנת להשוות ספירת hemocytometer ידנית ושיעורים אוטומטיים, השיעור הידני של ספירה בעזרת מונה נקודות הושווה את הזמן שנדרש כדי לקחת תשע תמונות של חדר hemocytometer ו נספר CCC (האיור 4B). ריכוז הסלולרי הטיפוסי של 1.15 x 10 ⁶ תאים / מ"ל שימש להשוות תזמונים, שמוביל בממוצע עלייה 1x התפוקה. שיעור זה ישתנה בהתאם למספר התאים וטעוןhemocytometer כפי הזמן הכולל נלקח ללכוד תמונות ולעבד אותם הוא עצמאי של מספר תא.

לבסוף, תזמונים המקיף רכישת תמונה של ממברנות, כימות בתוך TC, והתאמות ידניות של תמונות אלה נמדדו באיור 4C. יש לציין, 12 ממברנות assay הגירה עם מספר תאים נמוך (סה"כ = 10,571 תאים) ו מכתים רקע משמעותי ופסולת הסלולר נבחרו כדי להקל על תרחיש המקרה הגרוע ביותר שתחייב התאמות ידניות למספר התא. הדבר בא לידי ביטוי התאמת איור 4C (Adj) טור שבו נדרש ממוצע של 13 דקות כדי להסיר סעיפים רצויים ולהוסיף תאים החמיץ. לשם השוואה כדי ספירה ידנית, שיעורי ספירת תאים אופטימליים נקבעו עם דלפק תא; תמונות קרום באיכות גבוהות עם צפיפות תא גבוה שמשו (תוצאות לא מוצגות). זה ניב שיעור מקסימאלי ממוצע בין משתמש 1 ו -2 של 9.1 x 10 תאים ³ / h(~ 2.5 תאים / s). באמצעות מספרים אלה, את הקרומים מהתרשים 4C נספרו 4.4x מהר עם TC ממה שאפשר לצפות בקצב ידני מקסימאלי. החיסכון בזמן תלוי באופן ישיר על מספר תא איכות תמונה, על ידי ספירת ממברנות הגירה כי נדרשו מעט או ללא התאמה צפיפות תא גבוהה (~ 7,000 תאים / קרום), TC שנוצר ספירת תאי 1,395x הגדולה משיעור הידני המקסימאלי.

איור 1: מחשבון ריכוז תא. (א) שלב מיקרוסקופ ניגודיות של הכיכר הראשית המרכזית של hemocytometer נלקחה ב 40X גדלה מוחלטת. סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. (ב) קצוץ גרסה של התמונה מ- (A) המתארים מה אורך למדוד על hemocytometer. העמודה אורך חלון תוצאות הובלטה לזיהוי קל. פס צהוב= 1 מ"מ. (ג) מיקרוסקופ אידיאלי של hemocytometer המכיל תאי HTR8 לאחר כיול מיקרוסקופ ותוכנה ב 40X הגדלה הכולל עם רזולוציה של 1,600 x 1,200 פיקסלים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (ד) פיזור עלילת השוואת ספירה ידנית באמצעות מונה Cell תוסף ImageJ לעומת ספירות אוטומטיות של תמונות באותו באמצעות מחשבון ריכוז תא. n = 57 תמונות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: assay הגירה לסתור תמונות מייצגות. (א) הפנל העליון הוא חלק שמיני של קרום כולל מתאר דימוי אידיאלי עם רקע מינימאלי; סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. הפנל תחתון מכיל תמונה עם מכתים רקע משמעותי המשפיע על הדיוק קשה של הספירה האוטומטית; סרגל קנה מידה = 585 מיקרומטר. (ב) הפנל העליון מייצג דמות אפלה באיכות טובה שהפיקה ספירה מדויקת. הפאנל התחתון הוא גרסה מנייה של אותה תמונה לאחר תיקון flatfield. ברים בקנה מידה = 593 מיקרומטר. (C) הפנל העליון ייצג zoomed- בתצוגה של קרום טיפוסי. הפאנל התחתון הוא אותה התמונה ואחריו thresholding צבע ImageJ הרצוי (סף RGB = 150, 120, 0) להסיר רקע אינטר ואת רוב הציטופלסמה בעליל מוכתם. כל התמונות צולמו בהגדלה סכה 1.35X עם ביתור מכויל ברזולוציה של 2,592 x 1,944 פיקסלים מפני פלישות assay ההגירה מרובות של HTR8 מוכתמות hematoxylin. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי vieווה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: כיול ואימות של ounter ג assay הגירה. (א) דוגמה אופיינית של תמונה uncalibrated באיכות גבוהה. (ב) הגרסה המכוילת של (א) באמצעות הספירה החוזרת של דלפק assay גירה> 'גודל מוצע'. (C) עלילת תדר אופיינית קרום איכות תמונה נמוך עם כתם רקע משמעותי או חושך הכולל. (ד) פיזור עלילת השוואת ספירה ידנית באמצעות מונה Cell תוסף ImageJ שכנגד assay גירת ספירה אוטומטית. (ה) גרף עמודות מראה את הבדל אחוז הממוצע של מכויל לעומת ספירות אוטומטיות לא מכוילות. נתונים הם ממוצעים ± SE. P <0.0001, n = 30, מבחן t מזווג עם הקור של וולשction. אותן התמונות שמשו D ו- E כיול של שני נעשה עם הספירה החוזרת> 'גודל מוצע' ויסופר> 'הגדרות ידניות' כדי לצמצם עוד יותר את הגודל המינימאלי נספר סף צבע. אין התאמות ספירה ידניות נעשו באמצעות 'פתח את התמונה עם ספירה' פונקציה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: עיתוי של מונה Cell ריכוזי שימוש דלפק assay הגירה. (א) השוואת פעמים כיול CCC (שלבים 1 ו -2) בין 1 משתמש (CCC / מומחה TC) ו 2 User (CCC / טירון TC). (ב) פעמי ספירת תאים ידניות היו בממוצע לכל חמישה מחקרים והביעו בתאים נספרו לדקה. אוטומציהספירת ג חושבה על ידי פעמים ממוצעות ללכוד תשע תמונות של תא hemocytometer ולספור עם CCC. ריכוז נייד המשמש היה ~ 1.15 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. נתונים הם ממוצעים ± SE. n = 5. (ג) תזמוני Transwell מונים הושוו מעל לשלוש קטגוריות: רכישה (ACQ; שלבי 7 ו -8), כימות (Qnt; צעדי 10.1-10.3.3 באמצעות הגדרות תצורת ברירת מחדל) ולאחר התאמה ידנית (Adj; צעדי 10.4 -1.4.2). הממברנות לכמת היו רמה גבוהה של מכתים רקע ופסולת כדי להצריך התאמה ידנית משמעותית עבור ספירה מדויקת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

שלבים קריטיים, פתרון בעיות, ומגבלות

עצם טבעו של שיטות חישוביות אוטומטיות, במיוחד אלה של ניתוח חלקיקים, מחייבת היכולת המתמטית להגדיר חלקיקים אלה. כתוצאה מכך, את הדיוק של שני מחשבון נייד ריכוזיות דלפק assay ההגירה תלוי majorly על נאמנות תמונה, כלומר, כיצד מקרוב את התמונה שצולמה דומה מדגם תא או קרום assay הגירה. לכן בעל החשיבות העליונה לעקוב מיקרוסקופ ופרוטוקולי כיול תוכנה נלווה בצורה הטובה ביותר אפשרי. זה כולל הגבלת רעש רקע, הפחתת חלקיקים לא רצויים, לכידה בהירה ואחיד תמונות הפוקוס, ושמירה בפורמטי קבצים שאינם lossy כגון TIFF. לפיכך, הוא התוספים צפויים להפיק תוצאות שגויות אם דרישות אלה לא תיענינה. לכן הוא תמיד טוב להתאמן כדי ספירת תאים בדוקה כדי לקבוע אם הם תואמים את ציפיות חזותיות כאשר doubt. אם אכן התוצאות אינן תואמות, השוואת התמונה המקורית עם תמונה בינארית עשוי לעזור להבהיר את הנושא (10.4 פתק). במקרים מסוימים, תמונות assay ההגירה כהות עשויות להכיל שטחים גדולים שנספרו בשל ערכי הפיקסלים נופלים בגבולות סף צבע. באופן כללי, באמצעות תמונת flatfield יסיר חושך blotchiness ולמנוע ספירה הרצויה ביותר בשל אי סדרים כרומטית.

בהתחשב בעיות אפשריות ויחסית אלה נפוצות, חשוב לעקוב אחר הנחיות שלמות תמונה רגילות כמו אלה המוצעים על ידי קבוצת Nature Publishing Group ועוד ^13. כדי לשמור ספירה עקבית, והכולל שינויי תמונה אחת צריכים להיות מיושמים באופן שווה על כל האחרים. זה כולל אך אינו מוגבל ניגודיות, רוויה, בהירות, רווח, מסנן כגון מיצוע וחד, ומסנני צבע. התאמת גמא יש להימנע ככל שהוא חל שינוי שאינו ליניארי של צבע פיקסל כן הדבר ישפיע על כל תמונה שונהly ^14. כאשר פונה זמן חשיפה משותף תמונות עם כמה תאים (<1,000), זה יכול להוביל יתר ואובדן נאמנות תמונה. לעומת זאת, קרום עם אלפי תאים יכול לדרוש זמני חשיפה גבוהה יותר כדי למנוע underexposure. בהתאם לכך, זהו התרגול הטוב ביותר להתאים תמונות כמה שפחות, ורק בעת צורך, כדי לשמור על נאמנות התמונה הגבוהה ביותר להשגה.

אפילו עם תמונה באיכות גבוהה, ספירת חלקיקים אמיתית יכולה להיות מוטה באופן חמור על ידי חלקיקים לא רצויים. בעת שימוש מחשבון ריכוז תא, אם מדגם מכיל כמויות משמעותיות של פסולת תא, במיוחד של תחומים דומים לאלה של תאים מושעים, זה עלול להטות את התוצאה. במקרים מסוימים, זה יכול למנוע ניתוח אוטומטי אם הפסולת לא יכולה להיות ממוזערת. כמו כן, ממברנות assay הגירה המכילים רמות גבוהות של מכתים רקע צבע דומה מוכתם תאים או תאים unremoved מהישבן של הממברנה, יפיק סביר iתוצאות n מדויקות. חלקיקים לא רצויים אלו ניתן להסיר בדרך כלל בכמה דרכים: הגדלת הזמן הבהיר או חשיפת מקור האור, שינוי thresholding צבע להיות מחמיר יותר, או להסיר באופן ידני באמצעות "פתח את תמונה עם ספירה '(10.4). חשוב לציין כי פרוטוקול זה מפיק את האיכות האופטימלית של תמונה הנדרשת CCC ו- TC כדי לשמור על דיוק. עם זאת, TC הוא מסוגל לספור תמונות באיכות פחות משמעותית, בהגדלה משתנים, או כתמים בצבע שונה, בדרך כלל רק הדורשים יותר זמן בילה על התאמות ידניות (10.4).

במהלך הכיול של כל תמונה קרום assay הגירה חשוב לקחת בחשבון את הרזולוציה של התמונה ואת הגודל היחסי של התאים. כפי שתואר קודם לכן, איכות תמונה (Q) והמלצת הכיול (CR) תלויות מדדה עלילה תדירה שטח חלקיקים. התמונות מנותחות, כל תא לוקח בממוצע 1 / 100,000באזור התמונה הכוללת. כאשר באמצעות תמונות של רק מיליוני פיקסלים עם יחס גודל תא קטן, וריאצית גודל תא היא גם קטנה. כלומר, את השונות עשויות לנוע רק 10-60 פיקסלים. אבל כאזור תא יחס תמונה באזור מתעבה, חלוקת התא גדלה עליות, צמצום kurtosis של ההתפלגות הנורמלית גודל תא על ידי הפחתת התדירות בכל אזור נתון. זה בתורו יכול לעשות חישוב אוטומטי של שטח תא יותר קשה או בלתי אפשרי, כי שטח מינימאלי מובהק לא ניתן לקבוע. באופן דומה, זה חל גם על תמונות עם כמה מספרים של תאים שבם התדירות בגדלי תאים שונים עשויות להיות מאוד נמוכות (<50). כתוצאה מכך, בעת ניתוח תמונות עם רזולוציות שונות מאלה ששימשו במחקר זה או הפצות שונות של גודל התא, זיהוי ידני של מגוון גודל התא עשוי להיות נחוץ (10.3.3).

כיווני משמעות ועתיד

את ספירת תא תוסף ImageJ הייתה בתחילת released בשנת 2001 על ידי ד"ר קורט דה ווס ושימש מצרך עבור ספירת תאים ידנית עד עצם היום הזה. כדי להמשיך את המגמה של כלים זמינים באופן חופשי עבור הקהילה הביולוגית, מחשבון נייד ריכוזיות דלפק assay הגירה להציע את השלב הבא כולים חינם כדי לעזור להגדיל את התפוקה והבין-ניסיוני שחזור של מבחני הגירה. התוצאה הסופית של מבחני הגירה תלויה מאוד את מספר התאים הזורעים. Ergo ספירת תאים אמין הוא הכרח עבור שחזור. בדרך זו, CCC מציעה הן גדל הדיוק בשל ודאות סטטיסטית גבוהה של ריכוז התא פעמים ספירה קצרה שמירה על בריאות התא.

יתר על כן, התוצאה הסופית של שני התוספים היא ספירה של מספר סלולארי ולא מדד יחסים כגון קרינה. פרוטוקולים אחרים שונים קיימים קרינת מידה לאחר המכתים אך שיטות אלו סובלות מחוסר רגישות ^13. פוטושופ של אדובי מציע t ניתוח חלקיקים משלהOOL אבל התכנית יש לרכוש לשימוש ואינו מציעה ניתוח שלאחר הספירה הזמין דלפק assay הגיר ^20. שני התוספים להסתמך על תכונת ספירת חלקיקים מן ImageJ וכתוצאה מכך יכולים להיות שונה על ידי משתמש הקצה על ידי עריכת הפקודות מאקרו שמוצג ImageJ. זה מציע גמישות רבה יותר עבור המשתמש כדי להרחיב את ההיקף של התוספים לחלקיקים אחרים על ידי יצירת פקודות מאקרו חדש. פיתוח נוסף כדי להגדיל את רוחב היריעה של חלקיקי ספיר ולשלב תרומות משתמש קצה הוא הצעד ההגיוני הבא. על ידי שילוב של עקרונות הליבה של מונה סלולארי עם ניתוח אלגוריתם ספירה אוטומטי שלאחר ספירה, זה מגדיל מאוד את הקלות שבה מבחני הגירה יכולים להיות מעובד ללא כל אובדן של דיוק. את התוספים זמינים באופן חופשי להורדה עם הוראות התקנה מ: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required