Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin

Abstract

L'Istituto Nazionale di ImageJ di salute è una potente suite di software, liberamente disponibile l'elaborazione delle immagini. ImageJ ha algoritmi di analisi delle particelle complete che possono essere utilizzati in modo efficace per contare varie particelle biologiche. Quando il conteggio gran numero di campioni di cellule, l'emocitometro presenta un collo di bottiglia per quanto riguarda il tempo. Allo stesso modo, contando le membrane da saggi di migrazione / invasione con la ImageJ plug cellulare contatore, anche se precisa, è il lavoro eccezionalmente intenso, soggettiva, e famoso per causare dolore al polso. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato due plugin all'interno ImageJ per il solo compito di emocitometro automatizzata (o volume noto) e il conteggio delle cellule migrazione / invasione. Entrambi i plugin si basano sulla capacità di acquisire micrografie di alta qualità con il minimo di sfondo. Sono facili da usare e ottimizzato per il conteggio rapido e l'analisi di campioni di grandi dimensioni con strumenti di analisi integrati per aiutare la calibrazione dei conteggi. Combinando il principio di bases of Cell Contatore con un'analisi automatizzata algoritmo di conteggio e post-conteggio, questo aumenta notevolmente la facilità con cui saggi di migrazione possono essere elaborati senza alcuna perdita di precisione.

Introduction

Nel conteggio delle cellule in vitro è un'importante tecnica di base in una vasta gamma di esperimenti di coltura tissutale. Accuratamente determinare il numero di cellule in una coltura è essenziale per la riproducibilità sperimentale e standardizzazione ^1,2. Conteggio cellulare può essere eseguita manualmente utilizzando un emocitometro e utilizzando una varietà di metodi automatizzati, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi ^3,4,5. La maggior parte dei metodi automatizzati per il conteggio delle cellule appartengono ad una delle due classi, quelli che utilizzano il principio Coulter o citometria a flusso. Contaglobuli sfruttano cellule resistenza elettrica per determinare il numero di cellule e le dimensioni. Sono veloci, accurati e più economico rispetto citometri a flusso. Tuttavia, essi sono raramente utilizzati solo per il conteggio delle cellule a causa del loro costo considerevole rispetto al conteggio manuale ^3. Flusso citometri, d'altra parte, sono costosi ma hanno molte applicazioni, come il conteggio delle cellule, analisi della forma cellule, structure e cella di misura interna marcatori ^4,5. Le macchine che utilizzano uno di questi due principi sono disponibili da molti produttori. Conteggio manuale è conveniente, ma richiede tempo e soggetto a bias mentre i metodi automatici sono dotati di una frazione del tempo richiesto per il conteggio manuale, ma utilizzando macchine costose ^6.

Altre procedure di coltura cellulare comune ha in saggi di motilità cellulare in vitro, vale a dire, la migrazione cellulare e dell'invasione ^7. saggi di migrazione e invasione sono comunemente usati per studiare la motilità cellulare e invasività in risposta ad una risposta chemiotattica. Inoltre, essi sono ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale, la differenziazione, la risposta infiammatoria, e le metastasi di più tipi di cellule ^7-11. Le cellule che sono migrati o invaso attraverso la membrana porosa di un saggio di migrazione possono essere quantificati in due modi diversi. In primo luogo, colorando le cellule con un colorante fluorescente, dissociazione from la membrana, e la quantificazione usando un lettore di fluorescenza ^12. Una limitazione di questo metodo di quantificazione è che nessun record può essere conservato delle membrane e non vi è alcuna possibilità per ulteriori analisi ^13. Il secondo metodo di quantificazione è per migrato / celle da fissi e colorati con colorante fluorescente o più comunemente, con coloranti citologici, come violetto di cristallo, toluidina colorante blu o ematossilina invaso; quindi le cellule vengono quantificati utilizzando manualmente immagini microscopiche invertite di queste membrane che è un compito molto tempo ^12,13.

Per superare gli inconvenienti di conteggio manuale delle cellule, sono stati sviluppati due contatori di cellule automatizzati affidabili ed accurate per concentrazione cellulare e per il dosaggio di migrazione. Questi algoritmi automatizzati contatore di cellule sono stati sviluppati per ImageJ come plugin usando il linguaggio del computer Java di Oracle. ImageJ è uno strumento di elaborazione immagine pubblica e diffuso sviluppato dal National Institute of Health (NIH) ^14,15; in tal modo, scrivendo questi plugin per ImageJ facilita l'integrazione nella comunità biologica.

Automazione del conteggio delle cellule assicura un throughput elevato e riproducibilità rispetto al conteggio manuale. Anche se altri software e plug-in disponibili possono essere utilizzati per calcolare la concentrazione cellulare attraverso l'analisi delle immagini ^5,16,17, cellulare Concentrazione calcolatore di plug-in è veloce e può anche gestire diluizioni di cellule e trattamenti. Inoltre, tutti i risultati ei calcoli di questi due contatori possono essere salvati ed esportati. I due plugin descritti nel presente documento sono ottimizzate per l'impiego di un microscopio a contrasto di fase per l'imaging cellulare dal vivo e ampio campo di vista (cattura tutta la membrana) di imaging per membrane dosaggio migrazione attraverso l'uso di un ambito dissezione. I plugin sono liberamente disponibili per il download con le istruzioni di installazione da: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. Microscopio e Camera Setup (Cell Concentrazione Calculator)

1. Aumentare la lampadina luminosità completa con la manopola di regolazione della luce, passare alla lente dell'obiettivo 4X, e garantire filtri contrasto di fase vengono selezionati.
   NOTA: Qualsiasi microscopio a contrasto di fase invertito per coltura di tessuti con uno sfondo scuro, ad esempio, PHP fase di contrasto, può essere utilizzato seguendo le procedure del microscopio e della fotocamera standard.
2. All'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di cattura di immagini ai valori predefiniti.
   NOTA: Vedere manuale d'uso del microscopio per trovare la posizione di queste impostazioni.
   1. Set 'luminosità', 'contrasto', e 'la saturazione' al 100% e 'gamma' e 'guadagno' a 1,0.
      NOTA: A seconda del software, 'luminosità' e 'contrasto' possono default un valore di 0% invece del 100%.
   2. Set di catturare fotografie in bianco e nero con la più alta risoluzione dispone (1.600 x 1.200 pixel (px) o superiore).
      NOTA: A 'saturazione' di 0% è sufficiente se un ambiente in bianco e nero non è disponibile.
3. Posizionare un emocitometro serie sul palco microscopio e catturare un'immagine come illustrato nella (Figura 1A); questa è l' 'immagine del volume di calibrazione'. Regolare i tempi di esposizione, come richiesto.

2. Immagine Volume calibrazione

1. Aperto ImageJ e dal menu plugin, avviare la concentrazione delle cellule calcolatore (CCC) plug-in, ad esempio, Plugin> Analyzer> 'cellulare Concentrazione Calculator'.
   1. Se il pannello di destra 'immagine di volume calibrazione' non è visibile, fare clic su 'Calibra' di mostrarlo.
2. In ImageJ, aprire l' 'immagine di taratura del volume' dal punto 1.3 ( 'File'> 'Apri') e CCC clic sul pulsante 'Get Immagine Dimension'.
   NOTA: Questo riempirà sia in Larghezza immagine ecaselle di testo Altezza con la risoluzione dell'immagine in pixel automaticamente.
3. In ImageJ, selezionare il 'Tool Straight Line' accanto agli strumenti di selezione e di disegnare una linea retta per tutta la lunghezza del emocitometro primario (P) L'incontro dimostrato nella (Figura 1B) facendo clic e trascinando il cursore.
   1. Premere il tasto 'M' per visualizzare la finestra di risultati con le misurazioni linea retta. Digitare il valore della colonna lunghezza nella casella di testo 'P-square Lunghezza' a CCC (Figura 1B).
   2. Fare clic sul pulsante 'Calcola Immagine Volume' per l'uscita del volume dell'immagine nella casella di testo Immagine Volume. In alternativa, se il volume di questa immagine è già noto, digitare il volume in nL nel box immagine Volume.
4. Fare clic sul pulsante 'Salva'.
   NOTA: Il plugin è calibrato.

3. Camera Calibration Esposizione

1. A seguito di raccolta di cellule percontando via emocitometro, carico di 10 ml di cellule in una camera del emocitometro e posizionarlo sul palco microscopio.
2. Utilizzando le stesse impostazioni dal punto 1.2, regolare il tempo di esposizione in modo che le linee del emocitometro sfondo scompaiono.
   1. Regolare la messa a fuoco in modo che l'interno delle cellule è più scura della membrana cellulare, indicando fuoco all'interno della sezione centrale della cella e non i poli.
   2. Ulteriore regolare l'esposizione in modo che le cellule non sono sovraesposte e simili a quelli raffigurati nella (Figura 1C).
      NOTA: le linee emocitometro leggermente visibile sono accettabili. Si consiglia di salvare o registrare le impostazioni per mantenere la precisione e riproducibilità.

4. Acquisizione di immagini

1. Per ogni campione di cellule, carico di 10 ml in entrambe le camere del emocitometro per aumentare la potenza inferenza statistica ^2. Posizionare il emocitometro sul palco microscopioper l'imaging.
   NOTA: La risoluzione e l'ingrandimento di ogni immagine deve essere lo stesso del 'immagine di calibrazione Volume'. Il plugin conta tutte le immagini di qualsiasi cartella selezionata; tenere immagini per essere conteggiati insieme nella stessa cartella.
   1. Se una funzione di incremento automatico il nome del file è disponibile, accenderlo e assicurarsi che ogni immagine non viene mostrata dopo la cattura per aumentare il throughput.
      NOTA: il salvataggio e la chiusura di ogni immagine sarà drasticamente rallentare il processo manualmente. Fare riferimento al manuale utente del microscopio per informazioni sulla disponibilità di una funzione di auto-incremento.
   2. Cattura almeno tre immagini che non si sovrappongono della regione centrale del emocitometro anche se più (5-10) si raccomanda di aumentare la precisione.
      NOTA: evitare sia la parte superiore e di quella inferiore delle camere come cellule tendono ad aumentare in densità a entrambe le posizioni. Prendere lo stesso numero di immagini per ogni camera. Questo è necessario per il corretto funzionamento del plugin durante il conteggio.

   5. Conteggio immagine e diluizioni

   1. In CCC, clicca su 'Conte cellule' e osservare la finestra di dialogo Scegli directory. Selezionare una cartella da contare.
   2. Osservare la casella di inserimento numero del campione dopo aver selezionato una cartella. Inserire il numero di immagini scattate per camera, per esempio, 4.1.2, e fare clic su 'Ok'. Il plugin sarà ora contare tutti i JPG, TIFF e PNG nella cartella selezionata in ordine alfabetico.
      NOTA: Facendo clic sul pulsante 'Sample Viewer', si apre la finestra di visualizzazione di esempio che visualizza le informazioni sui campioni contati. concentrazione del campione è la concentrazione media di tutte le immagini scattate per ogni camera. I campioni con concentrazioni senza unità possono essere aggiunti a questo elenco, come l'aggiunta di un farmaco o trattamento molecola piccola.
      1. Raccontare le campioni di cellule se le concentrazioni variano in modo significativo entro i conteggi degli stessi campioni (sezione 4).
         NOTA: Per calcolare diluizioni per ogni tcontò-campioni, CCC utilizza automaticamente la formula C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Utilizzare lo scenario di semina 15.000 cellule per 200 ml in 30 pozzetti di una 96-pozzetti + 1 extra:
      1. Impostare la casella di testo a destra dell'etichetta C2 a 15.000 e la concentrazione volumetrica casella di testo a 200, cambiando l'unità casella combinata adiacente 'microlitri'.
         NOTA: Il plugin in ultima analisi, calcolare la concentrazione di cellule / ml.
      2. Assicurarsi che la casella combinata volume è selezionato V2 (volume finale) e nella casella di testo a destra digitare 6200 (200 pl x (30 + 1)), selezionando 'microlitri' nella casella combinata unità di volume.
   4. Fare clic su 'Calcola diluizione' per aggiungere la diluizione attualmente inserito nella casella in basso a sinistra lista.
      NOTA: per ogni diluizione aggiunta, sarà risolto per ciascun campione e visualizzato nel diagramma ad albero a destra. Fare doppio clic su ogni voce di espandersi.
   5. Facendo clic su tegli pulsante 'Salva' sotto il pulsante 'Sample Viewer' per scrivere su file tutti i dati del campione e diluizioni.
   6. NOTA: questi dati possono essere recuperati in qualsiasi momento facendo clic su 'Carica' e selezionando il file salvato.

   6. Migrazione e Invasion (contatore)

   1. Eseguire i saggi di migrazione e l'invasione usando il metodo standard camera di Boyden ^7-9.
   2. Dopo che le cellule sono migrate / invaso, rimuovere con attenzione i media all'interno dell'inserto capovolgendo e delicatamente toccando. Stoppino via qualsiasi supporto eccesso aderito al fondo della membrana toccando il bordo di un tovagliolo di carta.
      NOTA: Non toccare la membrana stessa per l'asciugamano, questo può staccare le cellule aderito.
   3. Fissare e macchiare le cellule come riportato ^7-9 in un 24-pozzetti impostato con ogni riga contenente ~ 500 ml di una soluzione diversa, ad esempio, fissativo, Stain 1, 2 Stain e acqua bidistillata (DDH ₂ O). Riempire un secondo piatto con PBS 1x to posizionare gli inserti in prima del taglio.
   4. Lavare gli inserti mettendoli in pozzi pieni di DDH ₂ O e riempire l'inserto con DDH ₂ O. Scaricare l'acqua prima di tampone via le cellule per inversione.
   5. Utilizzare un applicatore di cotone pulito per rimuovere le cellule non-migrati / un-invaso dalla parte superiore della membrana avendo cura di non danneggiare la membrana. Essere approfondita intorno ai bordi della membrana.
   6. Tagliare la membrana utilizzando un rasoio o un bisturi e con attenzione trasferire la membrana (in basso rivolta verso l'alto) su un vetrino pulito.
   7. Aggiungere una piccola goccia di soluzione di montaggio sotto e sopra della membrana e coprire con un sottile vetrino.
      NOTA: Evitare di inglobare bolle all'interno della soluzione di montaggio per preservare la precisione dei conti.

   7. dissezione Campo di applicazione e Camera Setup

   1. Accendere la sorgente luminosa del microscopio e della fotocamera.
      NOTA: consultare il manuale del microscopio per le istruzioni dettagliate.
   2. spiritohin software, impostare le impostazioni di cattura l'immagine del microscopio ai valori predefiniti.
      NOTA: Se è presente una funzione di media, si consiglia un valore di quattro. Questo è un buon compromesso tra il grado di compensazione e acquisizione dell'immagine tempo. Allo stesso modo, un piccolo grado di nitidezza dell'immagine può aumentare la fedeltà.
      1. Set 'luminosità', 'contrasto', e 'la saturazione' al 100% e 'gamma' e 'guadagno' a 1,0.
         NOTA: A seconda del software, 'luminosità' e 'contrasto' possono default un valore di 0% invece del 100%.
      2. Set di visualizzazione (in tempo reale) e la risoluzione di cattura ai valori massimi (1.600 x 1.200 px e 2.592 x 1.944 px, rispettivamente).
         NOTA: Risoluzione display può essere regolato come richiesto se la frequenza di aggiornamento è troppo lento. risoluzioni più basse renderà più difficile mettere a fuoco con precisione, ma di aumentare la frequenza di aggiornamento.
   3. Per la fase del campo di applicazione dissezione, utilizzare un solido bianco background; un fondo nero o vetro è insufficiente.
   4. Utilizzare la fonte di luce sopra stadi, preferibilmente da due luci flessibili del LED a destra ea sinistra del palco.
      NOTA: A seguito stadi sorgente di luce illuminerà i pori all'interno della migrazione saggio membrana che possono influenzare negativamente la precisione dei conteggi successivi.
   5. Posizionare un vetrino membrana test di migrazione completato sul palco. Guardando l'immagine in tempo reale visualizzato dal software a regolare l'ingrandimento con la manopola di regolazione zoom in modo che i bordi di una sola membrana sono solo all'interno del campo visivo della telecamera.
      NOTA: Posizionare la diapositiva su una lastra di vetro sovrastano il bianco fase sfondo rende più facile da manovrare il vetrino per l'imaging.
   6. Regolare le posizioni di luce sorgente (7.6.1) e tempi di esposizione per riprodurre il più fedelmente possibile l'immagine ideale della Figura 2A. A seconda della luminosità, tempi di esposizione di 5-60 ms dovrebbe essere sufficiente.
      NOTA:L'obiettivo è di produrre un'immagine con poco colore di sfondo come possibile e una membrana illuminata uniformemente senza ridurre fedeltà di immagine, cioè, sovraesposizione portando ad una perdita di cellule visibili.
      1. Posizionare le sorgenti luminose a sinistra ea destra ad un angolo basso rispetto alla slitta. Ciò contribuirà a rimuovere sfondo macchia e le aberrazioni cromatiche. Cercate di mantenere ogni fonte di luce di fronte all'altro.
         NOTA: Durante la manovra ogni fonte di luce in posizione, porgere l'altra fuori. Questo aiuta a centrare la zona di illuminazione sulla membrana stessa più facilmente e con precisione.
   7. Rimuovere il vetrino e bilanciamento del bianco l'immagine utilizzando un solo clic nel software microscopio.
      NOTA: Il microscopio è calibrato. Salvare il maggior numero possibile di impostazioni per un utilizzo futuro e prendere atto delle posizioni sorgente luminosa e intensità.

   8. Acquisizione di immagini e flatfield

   1. All'interno del software, impostareil percorso della cartella di cattura, e la cattura un'immagine per membrana. Nome le immagini seguendo il modello generale: Nome - ###, ad esempio, il controllo - 001.tif, controllo - 002.tif, test di droga - 001.tif, e così via.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati di immagini, salvare il tipo di file immagine come TIFF rispetto ad altri formati lossy, come jpeg.
      NOTA: Le immagini non seguono il modello generale sarà ancora essere contati, ma non saranno soggetti a raggruppamento automatico e fielding piatta.
      1. Se la correzione flatfield si desidera, per ogni diapositiva trovare un'area vuota e prendere una immagine in bianco seguendo la convenzione di denominazione: Nome - Blank.
         NOTA: A vuoto è un'area della diapositiva che non contiene la membrana e rappresenta la retroilluminazione.
      2. Immediatamente prima di imaging, appiattire ogni membrana applicando una pressione sul vetrino e rimuovere il maggior numero di bolle più possibile.
   2. In ImageJ, andare al Plugin e aprire il plugin TC; ad esempio, Plugin> Analizza> & #39; Transwell contatore '.
   3. All'interno di TC, fare clic sul pulsante 'flatfield' e osservare la finestra di dialogo Scegli directory. Selezionare la cartella dove sono state salvate le immagini della membrana.
      NOTA: Solo le immagini salvate con il modello generale di cui sopra verrà flatfield automaticamente corretto e salvato in una nuova cartella denominata flatfield all'interno della cartella scelta. Vedere Figura 2B per un esempio di un'immagine flatfield corretta.

   9. Impostazioni di configurazione

   1. Aprire l'immagine membrana un test di migrazione in ImageJ ( 'File'> 'Apri') e selezionare Immagine> Regola> 'Soglia colori ...'. Osservare la finestra Soglia colore per regolare quali colori saranno filtrati dell'immagine.
      1. Nella parte inferiore della finestra, impostare il metodo Soglia di 'Shanbhag', colore Soglia di 'White', e lo spazio colore per 'RGB' (rosso verde blu); Sfondo scuro deselezionare se selezionati.
      2. Regolare la parte superiorecursori cliccando e trascinando i marcatori a 0 e gli slider inferiore a 255 (lasciare i cursori di fondo a 255). Assicurarsi che l'immagine è completamente bianca.
   2. Regolare i migliori cursori verde e rosso fino a quando solo i nuclei sono visibili.
      NOTA: Le impostazioni selezionate varierà interamente dalla macchia cella utilizzata. Vedere la figura 2C.
   3. Nel plug-TC, inserire i valori RGB dei migliori cursori in 'RGB' Soglia caselle di testo le impostazioni di configurazione associati. Fare clic sul pulsante 'Aggiungi / Modifica' e sovrascrivere la configurazione.
      1. Lasciare la dimensione valori intervallo inferiore e superiore ad 1 - Infinity.
   4. All'interno del pannello di impostazioni di configurazione, cliccare su 'Salva' di scrivere le impostazioni sul disco rigido.

   10. Immagini di conteggio e di calibrazione

   1. Aprire il plugin TC (8.2) e cliccare su 'Conte Cartella' e osservare la finestra di dialogo Scegli directory. Selezionare la cartella da contare unND aspettare che finisca.
   2. Ogni campione contato viene automaticamente aggiunto alla tabella principale. colonne chiave sono 'Conte', 'Qualità', e 'Calibrare?'.
      NOTA: Il conte non calibrato è il numero di particelle per membrana all'interno della zona visualizzato nella colonna 'gamma Area'.
      NOTA: La qualità varia da circa -0.8 a 1.7; Q ≥ 0,5 è accettabile.
      1. Osservare un segno di spunta nella 'Calibrate?' colonna se l'immagine è in posizione di calibrazione in base alla sua somiglianza con le metriche ideali.
         NOTA: la qualità e la calibrazione può suggerire che le impostazioni correnti sono forse insufficienti. Se, dopo aver corretto 'Colore Thresholding' e 'Dimensioni Ranges' sono stati selezionati e la calibrazione è ancora suggerito, l'ispezione degli originali e contò immagini dovrebbero essere il fattore determinante finale di un conteggio valido.
   3. Selezionare tutti i campioni nella tabella contrassegnato per la calibrazione.
      1. Fare clic destro in tegli tabella e selezionare Recount> 'dimensione suggerita'. Questo racconterà le immagini con una superficie di particelle minimo suggerito.
      2. fare nuovamente clic destro e selezionare 'Mostra Plot'. Osservare il grafico a dispersione frequenza delle aree delle particelle. L'immagine ideale avrà un grafico simile a una distribuzione normale lunga coda di destra, cioè, la curva a campana. Vedere la Figura 3B.
      3. Regolare la gamma di dimensioni inferiori, se richiesto, selezionando il campione, clic destro, e selezionando Recount> "Impostazioni manuali. Osservare la finestra delle impostazioni manuali. Inserire le impostazioni desiderate e fare clic su Conte per raccontare l'immagine con le nuove impostazioni.
   4. Per regolare i conti manualmente, selezionare i campioni, a destra cliccando sul tavolo, e selezionare 'immagine aperta con i conteggi'. Osservare l'immagine originale con indicatori rossi che rappresentano ogni particella contati dal plugin.
      NOTA: Recount> 'Mostra contato immagine binaria' può essere utile per verificare quanto bene icellule ndividual vengono risolti dalla soglia colore.
      1. Per aggiungere un conteggio, tenere 'Ctrl' e click sinistro. Osservare un marcatore nella posizione del cursore che verrà aggiunto ai campioni conteggio totale. Per rimuovere un marcatore, fate clic destro sull'immagine. Il plugin rimuoverà il marcatore più vicino al cursore.
      2. Per rimuovere un gruppo di marcatori, utilizzare uno strumento di selezione in ImageJ per selezionare una regione di interesse (ROI). Tenendo 'Ctrl', fare clic destro sull'immagine e saranno rimossi tutti gli indicatori all'interno della ROI. Osservare il numero di cella nella colonna 'Conte'.

   11. Risparmio / Apertura risultati ed esportazione in formato CSV

   1. In TC, andare alla barra dei menu e fare clic su 'File'> 'Salva risultati'. Osservare la finestra di dialogo Risultati Salva. Scegliere un nome e la destinazione e cliccare su 'Salva'.
      1. Utilizzare 'File'> 'i risultati di Open' per caricare un file contenente tutti i dati visualizzati nella tabella principale, sapg la trama.
         NOTA: il file dei risultati consente di risparmiare le directory le immagini vengono salvate in Se le immagini originali vengono spostati dopo il salvataggio, l' 'immagine originale Open' e 'immagine aperta con conta "funzioni fallirà..
      2. Per ripristinare la directory delle immagini, selezionare i campioni, fare clic destro del tavolo, e selezionare 'Reset directory dell'immagine'. Osservare la finestra di dialogo Scegli directory. Selezionare la nuova cartella e se sono presenti le immagini, le directory verranno ripristinate. Re-salvare il file dei risultati.
   2. Per salvare un file di valori separati da virgola (CSV), nella barra dei menu vai a 'File'> 'Esporta in .csv'. Questo produce un file con i campioni organizzati in gruppi statistici con la media contare e di errore standard della media; il suo layout è stato progettato per una rapida rappresentazione grafica nei programmi di grafici comuni.
      NOTA: I gruppi statistici sono basati sui gruppi creati all'interno TC.
      1. Se i campioni seguono il modello generale di denominazione, selezionare i campioni da grouped, fare clic destro e selezionare 'Auto raggruppamento'. Questo aggiunge campioni con lo stesso 'Nome' allo stesso gruppo. Utilizzando l'esempio di controllo - 1, di controllo - 2, trattamento - 1, Trattamento - 2: entrambi i controlli sarebbero stati aggiunti al gruppo 'di controllo' e trattamenti per 'trattamento'.
      2. Aggiungere campioni manualmente per gruppi con un doppio clic cellulare e digitando del campione 'Gruppo' nel nome del gruppo. Selezionare i campioni da aggiungere a questo gruppo, fare clic destro e selezionare 'Aggiungi gruppo'.

Representative Results

Calcolatrice cellulare Concentrazione

La figura 1 presenta il processo globale di calibrazione CCC e l'acquisizione di immagini numerabile. Figura 1A e 1B rappresentano l'immagine di calibrazione P-Square e calcolo della lunghezza del P-square in pixel. CCC determina concentrazione cellulare in un dato volume utilizzando la formula:

P-quadro di un emocitometro ha un volume di 100 NL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) e Data questa costante, il volume totale immagine può essere calcolato dopo la conversione pixel a mm. Figura 1C è un'immagine numerabile ideale, con messa a fuoco cellule che visualizza la caratteristica illuminazione fase e non graduazioni sfondo emocitometro. Infine, il diagramma a dispersione di Figure 1D mostra una altamente correlati, manuale contro il conteggio automatizzato delle cellule da 57 immagini scattate su vari esperimenti e tipi di cellule, tra cui HTR8, ES-2, e Swan71. Da segnalare, la gamma alta della concentrazione era ~ 5,6 x 10 ⁶ cellule / ml con una fascia bassa del ~ 2.3 x 10 ³ cellule / ml (≈ 5 cellule per immagine). Si suggerisce che se i conteggi sono al di sotto di 10-15 cellule per immagine, il campione deve essere sospeso in un volume più piccolo per aumentare la potenza statistica.

Acquisizione ed elaborazione di immagini per le migrazioni Assay contatore

Centinaia di membrane test di migrazione sono stati ripresi nel corso di molti esperimenti, che sono stati tutti seminato con la linea umana di cellule trofoblasto HTR8, Swan71, o ovarico linea di cellule di cancro ES-2. Di queste immagini, molteplici sono stati scelti per rappresentare una serie di categorie da molto scarsa per la qualità eccellente sulla base di luminosità, chiarezza e colore della Stained cellule, e il grado di colorazione di fondo e particelle indesiderate (rumore). Utilizzando queste immagini, le impostazioni dei colori RGB soglia predefinita (≈ 150, 120, 0) sono stati determinati (Figura 2C) e utilizzati come base di tutti gli sviluppi successivi dell'algoritmo. L'obiettivo era quello di massimizzare il colore nucleare di rapporto di colore totale, vale a dire, la maggior parte dei pixel colorati dovrebbe essere all'interno di nuclei cellulari. Il pannello superiore della figura 2A illustra la luminosità ideale immagine, cellule nuclei chiarezza e colore, e il rumore di fondo trascurabile. La luminosità dell'immagine è importante garantire c'è una grande abbastanza contrasto tra cellula e lo sfondo per produrre un'immagine binaria in bianco e nero.

Se questa differenza non è soddisfatta, le aree di grandi dimensioni o imprevedibili possono essere contati dalla ImageJ Analizzare funzione di particelle; la migliore delle ipotesi è uno sfondo completamente bianco. In opposizione, il pannello inferiore di Fifigura 2A ha sfondo estrema colorazione e le cellule che sono quasi indistinguibili. Membrane con questo grado di colorazione molto probabilmente produrre risultati inaffidabili dal contatore test di migrazione.

In alcuni casi, aumentando luminosità al livello ideale può influenzare fedeltà dell'immagine da sovraesporre l'immagine. Allo stesso modo, elevata esposizione o la luminosità possono produrre effetti cromatici sistemici con luce progressiva o irregolare e le regioni scure. Con la correzione flatfield, questi effetti possono essere ridotti al minimo o eliminati del tutto come mostrato nella Figura 2B (vs superiore pannello inferiore). Inoltre, la correzione flatfield è un buon modo per pareggiare la luminosità delle immagini multiple di membrana.

Calibrazione e validazione di migrazione Assay contatore

Per aiutare gli Stati UnitiER in meglio determinare se le immagini membrana test di migrazione soddisfano i criteri richiesti per il conteggio preciso, due qualificazioni sono stati progettati, la qualità dell'immagine chiamato (Q), e la calibrazione raccomandazione (CR). È importante sottolineare che entrambe le qualificazioni, come il nome suggerisce CR, sono raccomandazioni solo e agiscono come guide, piuttosto che i giudici assoluti della numerabilità di ogni immagine. Sia Q e CR si basano sulle metriche del grafico a dispersione di frequenza di un'area particella (10.3.2). Per semplificazione, una metrica può essere considerato come le varie forme della curva che compongono la trama di frequenza. La metrica desiderata di un Q adeguata (≥0.5) è stato determinato dal osservata normale distribuzione approssimativa della dimensione della cella. Comunemente, cellule che sono irrisolvibile tra loro, over-tinto, o semplicemente particolarmente grande, spostano il skewedness a una distribuzione normale coda di destra (Figura 3B). Come tale, questa è la metrica ideale di una tipica immagine calibrata. Conl'aggiunta di rumore di fondo, questo porta normalmente ad un gran numero di particelle nell'intervallo zona 1-5 pixel (Figura 3A). Al fine di calcolare le metriche di scena, i dati sono dotati di dieci Savitzky-Golay curve smussati di diversa gradi polinomiali prodotti dalla Biblioteca Java scientifico del Dr. Michael Thomas Flanagan (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Giava/). Essenzialmente, questo crea più punti nella regione approssimativa di ciascun estremo. Attraverso una serie di mappe a grappolo densità di minimi locali e massimi, un quadro generale delle metriche trama può essere calcolato come un elenco ordinato, vale a dire, minimo, massimo, minimo / massimo di sovrapposizione, ..., n ^° estremo. In breve, il grado in cui le curve levigate si adattano i dati di frequenza determina il modo in fitto gli estremi punti sono. Maggiore è il raggruppamento di non sovrapposti extrema, maggiore Q diventa. In teoria, Q rappresenta chiarezza complessiva immagine sulla base di tha distribuzione delle dimensioni delle particelle distinte.

Sia il booleano CR è vero o no dipende dalla sequenza di Extrema. Dalla figura 3A, la lista ordinata sarebbe minimo, massimo, e una sequenza di sovrapposizione extrema in base alle proprietà della curva Savitzky-Golay. Dal momento che figura 3A rappresenta un'immagine non calibrato, questa sequenza generale di bandiere Extrema CR come veri, il che suggerisce all'utente che l'immagine può avere bisogno di calibrazione. Andando avanti, si può notare che dalla figura 3B, l'elenco sarebbe identica, ma con l'esclusione del primo minimo. Così le metriche delle immagini non calibrati e tarati ideali sono stati determinati. Deviazioni da queste metriche generalmente contrassegnare un'immagine per la calibrazione e ridurre Q ≤ 0, come nel caso del fondo elevato rumore membrana in Figura 3C. L'applicazione di queste qualificazioni ad una selezionedi modesto per immagini eccellenti, per quanto riguarda la luminosità e il rumore di fondo, è chiaro che conta immagine calibrata sono significativamente più vicino a conteggi manuali che non calibrato (1,9% ± 0,3 vs 21,7% ± 2,9, rispettivamente; Figura 3D, E). Data l'elevata qualità complessiva delle immagini scelte per l'analisi (non calibrata = 0,71 ± 0,04; media ± SE), vi è stato un modesto aumento previsto solo in D dopo la calibrazione ( = 0.90 ± 0.04). Nel loro insieme, Q suggerisce il potenziale numerabilità generale di un'immagine, mentre CR è un forte indicatore del fatto che la taratura è successo o meno.

Timing confronti di entrambi i contatori cellulare Concentrazione e migrazione contatore Assay

Figura 4A confronta CCC tempo di taratura tra il Utente 1 e 2. Come previsto, l'utente 1 è sostanzialmente più veloce di utente 2, insieme, prendendo in media circa cinque minuti per la calibrazione CCC. Al fine di confrontare il conteggio emocitometro manuale e tariffe automatizzati, il tasso di manuale di contare con un contatore riscontro è stato confrontato con il tempo impiegato per scattare nove immagini della camera di emocitometro e conteggiato in CCC (Figura 4B). Una concentrazione cellulare tipica di 1,15 x 10 ⁶ cellule / ml è stato utilizzato per confrontare tempi, portando ad una media di aumento del throughput 1x. Questo tasso varia a seconda del numero di cellule caricato nelemocitometro come il tempo totale impiegato per catturare immagini e di processo è indipendente dal numero di cellule.

Infine, timing che comprende l'acquisizione delle immagini delle membrane, quantificazione all'interno TC, e le regolazioni manuali di queste immagini è stata misurata in figura 4C. In particolare, 12 membrane test di migrazione con basso numero di cellule (Totale = 10.571 cellule) e lo sfondo sostanziale colorazione e detriti cellulari sono stati scelti per facilitare la peggiore delle ipotesi, che richiederebbe una regolazione manuale per numero di cellulare. Ciò si riflette nella colonna di regolazione Figura 4C (Adj) dove ha preso una media di 13 minuti per rimuovere i conteggi indesiderati e aggiungere le cellule perse. Per confronto al conteggio manuale, i tassi di conteggio delle cellule ottimali sono stati determinati con cellulare contatore; immagini di alta qualità a membrana con alta densità cellulare sono stati usati (risultati non mostrati). Questo ha prodotto un tasso massimo medio tra l'utente 1 e 2 di 9.1 x 10 ³ cellule / h(~ 2,5 cellule / s). L'utilizzo di questi numeri, le membrane di Figura 4C sono stati contati 4.4x più veloce con TC quanto ci si aspetterebbe a tasso manuale di massima. Il risparmio di tempo sono direttamente dipendenti da numero di cellulare e la qualità delle immagini, contando membrane di migrazione che ha richiesto poco o nessun aggiustamento e la densità delle cellule alta (~ 7.000 cellule / membrana), TC generato conta delle cellule 1,395x più veloce rispetto al tasso di manuale di massima.

Figura 1: Cell Concentrazione Calcolatrice. Contrasto microfotografia (A) Fase della piazza principale centrale del emocitometro prese a 40X ingrandimento totale. barra della scala rappresenta 200 micron. (B) Un ritagliata versione dell'immagine da (A) raffigurante che lunghezza misurare sul emocitometro. La colonna Lunghezza finestra Risultati è stato evidenziato per una facile identificazione. barra gialla= 1 mm. (C) Un microscopio ideale di un emocitometro contenente cellule HTR8 dopo la calibrazione microscopio e software a 40X di ingrandimento totale, con una risoluzione di 1.600 x 1.200 px. Barra di scala = 200 micron. (D) Un grafico a dispersione confrontando i conteggi manuali utilizzando il contatore ImageJ plug-cellulare rispetto ai conteggi automatici delle stesse immagini utilizzando la calcolatrice concentrazione delle cellule. n = 57 immagini. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: saggio di migrazione contatore immagini rappresentative. (A) Il pannello superiore è un ottavo porzione di una membrana totale raffigurante un'immagine ideale con sfondo minima; Barra di scala = 200 micron. Ilpannello inferiore contiene un'immagine con sfondo significativa colorazione che influenza fortemente la precisione del conteggio automatico; Barra di scala = 585 micron. (B) Il pannello superiore rappresenta un'immagine scura di buona qualità che produceva conteggi imprecisi. Il pannello inferiore è una versione numerabile della stessa immagine dopo la correzione flatfield. Barre di scala = 593 micron. (C) Il pannello superiore rappresenta una vista ingrandita di una membrana tipico. Il pannello inferiore è la stessa immagine seguita dal colore soglia ImageJ desiderato (RGB soglia = 150, 120, 0) per rimuovere sfondo intercellulare e la maggior parte del citoplasma visibilmente macchiato. Tutte le immagini sono state scattate a 1.35X ingrandimento totale con un ambito dissezione tarato a una risoluzione di 2.592 x 1.944 px da più invasioni test di migrazione di HTR8 colorate con ematossilina. Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per viewa più grande versione di questa figura.

Figura 3: Calibrazione e validazione di test di migrazione c ounter. (A) Tipico esempio di un'immagine non calibrato di alta qualità. (B) La versione calibrata di (A) con Recount migrazione del contatore saggio> 'dimensione suggerita'. (C) Un tipico diagramma di frequenza di una membrana a bassa qualità delle immagini con sfondo notevole macchia o l'oscurità generale. (D) Un grafico a dispersione confrontando i conteggi manuali utilizzando il contatore plug cellulare ImageJ e migrazione contatore saggio conteggi automatici. (E) Un grafico a barre che mostra la differenza media per cento dei calibrato rispetto conteggi automatici non calibrati. I dati sono media ± SE. P <0.0001, n = 30, t-test spaiato con corri di Welchction. Le stesse immagini sono state utilizzate per D ed E. La calibrazione di entrambi è stato fatto con il riconteggio> 'dimensione suggerita' e Recount> 'Impostazioni manuali per ridefinire ulteriormente la dimensione minima contati e la soglia del colore. Nessuna rettifica di conteggio manuale sono state effettuate utilizzando il 'immagine aperta con conta' la funzione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Tempi di concentrazione delle cellule contatore e l'uso di contatore test di migrazione. (A) Confronto di ore per la calibrazione CCC (punti 1 e 2) tra l'utente 1 (CCC / esperto TC) e User 2 (CCC / TC novizio). (B) volte conteggio manuale delle cellule sono stati in media nell'arco di cinque prove ed espressi in cellule contate per min. automatic conteggi sono stati calcolati da tempi media per catturare nove immagini di una camera di emocitometro e contati con CCC. Concentrazione cellulare usato era ~ 1,15 x 10 ⁶ cellule / ml. I dati sono media ± SE. n = 5. (C) timing Transwell contatore sono stati confrontati su tre categorie: acquisizione (Acq, i punti 7 e 8), di quantificazione (Qnt; passi 10.1-10.3.3 utilizzando le impostazioni di configurazione di default), e la regolazione manuale (Adj mentre le misure di 10,4 -1.4.2). Le membrane quantificati hanno un elevato grado di colorazione di fondo e detriti per richiedere sostanziali regolazione manuale per conteggi precisi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Passaggi critici, risoluzione dei problemi e limitazioni

La natura stessa di metodi computazionali automatizzati, in particolare quelle di analisi delle particelle, richiede la capacità matematiche per definire queste particelle. Di conseguenza, la precisione di entrambi Calcolo cellulare Concentrazione e contatore dosaggio migrazione majorly dipende fedeltà dell'immagine, cioè quanto strettamente l'immagine catturata assomiglia membrana campione cellulare o dosaggio migrazione. È quindi della massima importanza per seguire microscopio e protocolli di calibrazione software associati nel miglior modo possibile. Questo include limitare il rumore di fondo, riducendo le particelle indesiderate, catturando luminose e uniformemente immagini in-focus, e il salvataggio in formati di file senza perdita come TIFF. Così, entrambi i plugin sono in grado di produrre risultati errati se questi requisiti non sono soddisfatti. E 'quindi sempre buona norma doppi conteggi delle cellule di controllo per determinare se corrispondono aspettative visive, quando in dopt. Se, infatti, i risultati non corrispondono, confrontando l'immagine originale con l'immagine binaria può aiutare a chiarire la questione (10.4 nota). In alcuni casi, le immagini del test di migrazione più scure possono contenere grandi aree che sono state contate a causa di valori di pixel che rientrano nei limiti di soglia colore. In generale, usando un'immagine flatfield rimuoverà l'oscurità e couperose e prevenire conta più indesiderati dovuti a irregolarità cromatiche.

Alla luce di questi problemi possibili e relativamente comuni, è importante seguire le linee guida integrità dell'immagine standard, come quelli proposti dal Nature Publishing Group e altri ^13. Per mantenere i conteggi coerente, alcuna regolazione un'immagine dovrebbe essere applicato anche per tutti gli altri. Questo include ma non si limita al contrasto, la saturazione, la luminosità, il guadagno, filtri come la media e la nitidezza, e filtri colorati. Regolazione della gamma dovrebbe essere evitato in quanto si applica modifica in modo non lineare di colore dei pixel e così può influenzare ogni immagine diversaly ^14. Quando si applica un tempo di esposizione comune per le immagini con poche cellule (<1.000), questo può portare a sovraesposizione e perdita di immagine fedeltà. Al contrario, una membrana con migliaia di cellule può richiedere tempi di esposizione più elevati per evitare la sottoesposizione. Di conseguenza, è buona norma regolare le immagini il meno possibile, e solo quando necessario, per mantenere la massima fedeltà dell'immagine ottenibile.

un'immagine di alta fedeltà Anche con, i conteggi delle particelle veri possono essere gravemente distorta da particelle indesiderate. Quando si utilizza calcolatore cellulare Concentrazione, se un campione contiene quantità significative di detriti cellulari, in particolare di aree simili a quelle di cellule sospese, ciò può inclinare il risultato. In alcuni casi, questo potrebbe impedire l'analisi automatizzata se i detriti non può essere minimizzata. Analogamente, membrane dosaggio migrazione che contengono livelli elevati di colorazione di fondo di colore simile al macchiati cellule o cellule non rimossi dal retro della membrana, probabilmente produrrà irisultati nAccuratezza. Queste particelle indesiderate possono normalmente essere rimossi in alcuni modi: aumentando la luminosità o l'esposizione origine ora di luce, modificando la soglia colore per essere più severi, o rimosso manualmente tramite 'immagine aperta con conta' (10.4). È importante notare che questo protocollo produce l'ottima qualità dell'immagine richiesta per CCC e TC per mantenere la precisione. Tuttavia, TC è in grado di contare le immagini di qualità notevolmente inferiore, ingrandimenti variabili, o diverse macchie di colore, in genere solo richiede più tempo speso per regolazioni manuali (10.4).

Durante la calibrazione di qualsiasi immagine membrane test di migrazione è importante prendere in considerazione la risoluzione dell'immagine e la relativa dimensione delle celle. Come descritto in precedenza, Qualità immagine (Q) e la raccomandazione di calibrazione (CR) dipendono metriche trama frequenza di superficie delle particelle. Delle immagini analizzate, ogni cella occupa mediamente 1 / 100.000 dellaarea dell'immagine totale. Quando si utilizzano immagini di solo milioni di pixel con un piccolo rapporto di dimensione cellulare, la variazione di dimensione della cella è anche piccolo. Cioè, la varianza può variare solo dal 10-60 px. Ma come area cellule rapporto area dell'immagine diventa più grande, la distribuzione di cellula dimensioni aumenta, riducendo l'Kurtosis della dimensione della cella distribuzione normale riducendo la frequenza di una determinata area. Questo a sua volta può rendere il calcolo automatico del superficie cellulare più difficile o impossibile perché una superficie minima definita non può essere determinata. Analogamente, questo vale anche per le immagini con pochi numeri di cellule in cui la frequenza di diverse dimensioni delle celle può essere molto bassa (<50). Come risultato, quando si analizzano immagini con risoluzioni diverse rispetto a quelli utilizzati in questo studio o diverse distribuzioni di dimensioni delle cellule, può essere necessaria l'identificazione manuale della gamma dimensione della cella (10.3.3).

Significato e futuri arrivarci

Il ImageJ plug cellulare Counter E 'stato inizialmente Relèased nel 2001 dal Dr. Kurt De Vos e ha servito come un fiocco per il conteggio delle cellule manuale a questo giorno. Per continuare il trend di strumenti liberamente disponibili per la comunità biologica, cellulare Concentrazione Calcolatrice e contatore test di migrazione offrono il prossimo passo in strumenti gratuiti per contribuire ad aumentare il throughput e la riproducibilità inter-sperimentale di test di migrazione. Il risultato finale del test di migrazione è fortemente dipendente dal numero di cellule seminate. Ergo una conta cellulare affidabile è una necessità per la riproducibilità. In questo modo, CCC offre sia una maggiore precisione grazie alla maggiore certezza statistica di concentrazione cellulare e più brevi i tempi di conteggio preservare la salute delle cellule.

Inoltre, il risultato finale di entrambe plugin è un conteggio del numero di cellule e non un indice relativo come fluorescenza. Vari altri protocolli esistenti che misura la fluorescenza dopo colorazione ma questi metodi soffrono di mancanza di sensibilità ^13. Adobe Photoshop offre la propria analisi delle particelle tool ma il programma deve essere acquistato per l'uso e non offre l'analisi post-conteggio disponibile dalla migrazione contatore test ^20. Entrambi i plugin si affidano alla funzione di conteggio delle particelle da ImageJ e di conseguenza possono essere modificati dall'utente finale modificando le macro utilizzate da ImageJ. Questo offre una maggiore flessibilità per l'utente di ampliare la portata dei plugin per altre particelle con la creazione di nuove macro. Un ulteriore sviluppo per aumentare l'ampiezza delle particelle numerabili e di integrare i contributi degli utenti finali è il prossimo passo logico. Combinando i principi fondamentali del cellulare Contatore con un'analisi automatizzata algoritmo di conteggio e post-conteggio, questo aumenta notevolmente la facilità con cui saggi di migrazione possono essere elaborati senza alcuna perdita di precisione. I plugin sono liberamente disponibili per il download con le istruzioni di installazione da: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required